Name: analysis of side population in solid tumor cell lines
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00
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Ce travail a été financé par la Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 et 81972787; Natural Science Foundation of Tianjin City (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People’s Hospital &Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales, Université de Nankai 63191153.

1. Préparation cellulaire
<ol><li>Digestion cellulaire et neutralisation<ol>
<li>Graines de cellules tumorales (telles que les cellules MDA-MB-231) dans une plaque à 6 puits, et les culturez dans un incubateur à 37 °C alimenté à 5% deCO2.</li>
		<li>Récoltez des cellules lorsque leur densité atteint environ 90%. Aspirer soigneusement le milieu de culture et laver les cellules 2x avec 3 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). REMARQUE: Pour examiner les effets des inhibiteurs de la voi...

<ol>
	<li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+cancer,+and+cancer+stem+cells.">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population.">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133/CD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component.">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).</li><li>Bailey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCLK1+marks+a+morphologically+distinct+subpopulation+of+cells+with+stem+cell+properties+in+preinvasive+pancreatic+cancer.">DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).</li><li>Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44++CD24(-)+prostate+cells+are+early+cancer+progenitor/stem+cells+that+provide+a+model+for+patients+with+poor+prognosis.">CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis.</a> British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD90++cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer.">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li><li>Schulenburg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+basic+science+and+in+translational+oncology:+can+we+translate+into+clinical+application.">Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application.</a> Journal of Hematology &amp; Oncolcology. 8, 16 (2015).</li><li>Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+Antigen-1+Enriches+for+a+Cancer+Stem+Cell-Like+Subpopulation+in+Mouse+Gastric+Cancer.">Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer.</a> Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+identification+and+sorting+using+the+Hoechst+33342+side+population+(SP).">Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP).</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).</li><li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABC+Transporters+in+Cancer+Stem+Cells:+Beyond+Chemoresistance.">ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).</li><li>Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumitremorgin+C+reverses+multidrug+resistance+in+cells+transfected+with+the+breast+cancer+resistance+protein.">Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein.</a> Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).</li><li>Takara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+calcium+antagonists+on+ABCG2/BCRP-mediated+drug+resistance+and+transport+in+SN-38-resistant+HeLa+cells.">Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells.</a> Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).</li><li>Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+specific+and+general+inhibitors+of+the+three+major+human+ATP-binding+cassette+transporters+P-gp,+BCRP+and+MRP2+among+registered+drugs.">Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs.</a> Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).</li><li>Challen, G. A., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+side+order+of+stem+cells:+the+SP+phenotype.">A side order of stem cells: the SP phenotype.</a> Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).</li><li>Wu, C., Alman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+in+human+cancers.">Side population cells in human cancers.</a> Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).</li><li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+is+enriched+in+tumorigenic,+stem-like+cancer+cells,+whereas+ABCG2++and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic.">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+Colivelin+treatment+ameliorates+memory+impairment+related+to+Alzheimer's+disease.">Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).</li><li>Marotta, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK2/STAT3+signaling+pathway+is+required+for+growth+of+CD44(+)CD24(-)+stem+cell-like+breast+cancer+cells+in+human+tumors.">The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).</li><li>Zhang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Lead+to+Drug+Candidate:+Optimization+of+3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine+Derivatives+as+Agents+for+the+Treatment+of+Triple+Negative+Breast+Cancer.">From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer.</a> Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).</li><li>Tam, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+alpha+is+a+central+signaling+node+and+therapeutic+target+for+breast+cancer+stem+cells.">Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).</li><li>Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analyses+as+a+critical+parameter+in+defining+the+side+population+(SP)+phenotype.">Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype.</a> Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).</li><li>Petriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+the+side+population+(SP).">Flow cytometry of the side population (SP).</a> Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).</li><li>Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells+exhibits+cancer+stem+cell-like+properties+without+higher+bone-metastatic+potential.">Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.</a> Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).</li><li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM3+mediates+inflammatory+signaling+to+promote+cancer+cell+stemness.">ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness.</a> Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).</li><li>Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baicalein+Suppresses+Stem+Cell-Like+Characteristics+in+Radio-+and+Chemoresistant+MDA-MB-231+Human+Breast+Cancer+Cells+through+Up-Regulation+of+IFIT2.">Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2.</a> Nutrients. 11 (3), 624 (2019).</li><li>Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapped+doxorubicin+nanoparticles+for+the+treatment+of+metastatic+anoikis-resistant+cancer+cells.">Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells.</a> Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).</li><li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells.">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+for+lung+cancer+risk+of+PM2.5+:+Induction+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+properties+in+human+non-small+cell+lung+cancer+cells.">The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).</li><li>Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Modeling+of+ABCG2+Transporter+Heterogeneity:+A+Quantitative,+Single-Cell+Analysis+of+the+Side+Population+Assay.">Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay.</a> PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+inhibitor+of+angiogenesis+inversely+correlates+with+side+population+phenotype+and+function+in+human+lung+cancer+cells.">An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells.</a> Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).</li><li>Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAIL-expressing+mesenchymal+stem+cells+kill+the+putative+cancer+stem+cell+population.">TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population.</a> British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).</li><li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties.">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+"side+population"+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+minor+groove-binding+ligands:+a+different+class+of+mammalian+DNA+topoisomerase+I+inhibitors.">DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).</li></ol>

Il y a plusieurs points clés à garder à l’esprit pour le test SP. Le premier est la sélection d’un bloqueur approprié, tel que Vérapamil ou Réserpine, pour chaque lignée cellulaire, car l’emplacement « porte » des cellules SP est déterminé en fonction de la position à laquelle un grand nombre de cellules SP disparaissent après l’ajout du bloqueur. Pour la lignée cellulaire MDA-MB-231, Reserpine fonctionne bien. Cependant, pour d’autres lignées cellulaires, différents bloqueurs peuvent mieux f...

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont des sous-ensembles de cellules ayant une capacité d’autore renouvellement et un potentiel de différenciation multiple, qui jouent un rôle essentiel dans la croissance tumorale, les métastases et la récurrence1,2. Actuellement, les CSC ont été identifiés comme existant dans une variété de tumeurs malignes, y compris les cancers du poumon, du cerveau, du pancréas, de la prostate, du sein et du foie3,4,5,6,7,8,9. L’identification de CSCs dans ces tumeurs est principalement basée sur la présence des protéines de marqueur de surface, telles que l’expression haute et/ou basse de CD44, CD24, CD133, etSca-1 9,10,mais un marqueur unique qui peut distinguer CSCs de non-CSCs n’a pas été rapporté jusqu’ici. Actuellement, plusieurs techniques sont employées pour identifier et purifier des CSC dans le tissu tumoral ou les variétés de cellule tumorales. Ces techniques sont conçues en fonction des propriétés spécifiques des CSC. Parmi eux, les tests et le tri des cellules de la population latérale (SP) sont deux des méthodes couramment utilisées.
Les cellules SP ont été découvertes à l’origine par Goodell et al.11,lorsqu’ils ont caractérisé les cellules souches hématopoïétiques dans les cellules de la moelle osseuse de la souris. Quand les cellules de moelle de souris ont été étiquetées avec le colorant fluorescent Hoechst 33342, un petit groupe de cellules de Hoechst 33342 faiblement-souillées est apparu dans le diagramme bidimensionnel de point d’une analyse cytometry d’écoulement. Hoechst 33342 est un colorant liant l’ADN et a au moins deux modes de liaison qui conduisent à des caractéristiques spectrales différentes. Lors de la visualisation de l’émission de fluorescence à deux longueurs d’onde en même temps, plusieurs populations peuvent être révélées12. Dans leur test, le Hoechst 33342 a été excité à 350 nm et la fluorescence a été mesurée à l’aide du filtre passe-bande (BP) de 450/20 nm et du filtre de bord de 675 nm passe-long (EFLP)11. Par rapport à toute la population de cellules de moelle osseuse, ce groupe de cellules a été enrichi en cellules souches hématopoïétiques appelées cellules SP11. Les cellules SP sont capables d’expulser rapidement Hoechst 33342. L’efflux de ce colorant est apparenté aux transporteurs de cassettes de liaison à l’ATP (ABC)13,qui peuvent être inhibés par certains agents tels que la fumitrémorgineC14,le vérapamil et la réserpine15,16. Après cela, différentes proportions de cellules SP ont été détectées dans une variété de tissus, d’organes, de tissus tumoraux et de lignées cellulairestumorales 17,18,19. Ces cellules SP présentent de nombreuses caractéristiques des cellules souches17,19.
Ce manuscrit décrit le étiquetage et la coloration de Hoechst 33342 des cellules tumorales cultivées et l’analyse des cellules SP par cytométrie en flux. D’ailleurs, l’optimisation de la concentration de Hoechst 33342 et la sélection appropriée de bloqueur pour une variété de cellule spécifique de tumeur utilisant cette approche sont montrées. Enfin, les effets des signaux de promotion ou d’inhibition de stemness sur la proportion de SP dans les cellules tumorales sont démontrés. Les exemples expérimentaux démontrent que l’analyse du SP peut être employée pour explorer les effets de divers signaux, tels que l’expression de gène, les petits inhibiteurs, les activateurs, les cytokines, et les chemokines, sur le stemness de tumeur. Par rapport à d’autres méthodes d’isolement et de purification des CSC, telles que le tri de cd44+/CD24– population, l’analyse de l’aldéhyde déshydrogénase (ALDH) et les tests de formation de sphère tumorale, cette méthode est plus facile à manipuler et est rentable.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3516</td>
			<td>9.5 cm2 (approx.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colivelin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-P1061A</td>
			<td>Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries (BIOIND)</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSDiva</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352054</td>
			<td>12 x 75 mm, 5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td>(3&#946;, 16&#946;, 17&#945;, 18&#946;, 20&#945;)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKLB816</td>
			<td>Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td>5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of side population in solid tumor cell lines

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont une cause importante de croissance, de métastase, et de répétition de tumeur. L’isolement et l’identification de CSCs sont d’une grande importance pour la recherche de tumeur. Actuellement, plusieurs techniques sont utilisées pour l’identification et la purification des CSC à partir de tissus tumoraux et de lignées cellulaires tumorales. La séparation et l’analyse des cellules de la population latérale (SP) sont deux des méthodes couramment utilisées. Les méthodes reposent sur la capacité des CSC à expulser rapidement les colorants fluorescents, tels que Hoechst 33342. L’efflux du colorant est associé aux transporteurs de cassette de liaison à l’ATP (ABC) et peut être inhibé par des inhibiteurs du transporteur ABC. Des méthodes pour souter les cellules cultivées de tumeur avec Hoechst 33342 et analyser la proportion de leurs cellules de SP par cytometry d’écoulement sont décrites. Ce test est pratique, rapide et rentable. Les données générées dans ce test peuvent contribuer à une meilleure compréhension de l’effet des gènes ou d’autres signaux extracellulaires et intracellulaires sur les propriétés de stemness des cellules tumorales.

Quatre analyses expérimentales de SP ont été exécutées selon cette méthode. Dans le premier, nous avons détecté la proportion de cellules de SP dans MDA-MB-231, qui est une variété de cellule humaine triple négative de cancer du sein, dans des conditions normales. Après comptage cellulaire, Hoechst 33342 a été ajouté dans un tube contenant 1 x 106 cellules à une concentration finale de 3 μg/mL. La réserpine et le hoechst 33342 ont été ajoutés à un autre tube à des concentrations finales ...

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Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Une méthode pratique, rapide, et rentable pour mesurer la proportion de cellules de population latérale dans les variétés de cellule pleines de tumeur est présentée.

Analyse de la population latérale dans les variétés de cellule de tumeur solide

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

L’analyse des cellules secondaires de la population est l’une des méthodes couramment utilisées pour isoler et identifier les cellules souches cancéreuses des tissus tumoraux et des lignées cellulaires tumorales. Ce test est pratique, rapide et rentable. Cette méthode peut contribuer à une meilleure compréhension de l’effet des gènes ou d’autres signaux extracellulaires et intracellulaires sur les propriétés de stemness des cellules tumorales.De nombreux facteurs peuvent influencer le pourcentage de cellules SP dans cette analyse, il est donc essentiel d’explorer les conditions appropriées avant l’expérience formelle. Ensemencez des cellules tumorales dans une plaque de six puits et incuber dans un incubateur à 37 degrés Celsius alimenté en dioxyde de carbone à 5%. Lorsque la densité cellulaire atteint environ 90%, aspirez le milieu de culture et lavez les cellules deux fois avec trois millilitres de PBS.Ensuite, ajoutez 500 microlitres de 0,25% trypsine-EDTA à chaque puits et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant une à trois minutes. Appuyez doucement sur la plaque pour détacher les cellules, ajoutez trois millilitres de PBS complétés par 2% fbs à chaque puits, et pipettez les cellules de haut en bas trois à cinq fois pour disperser les amas cellulaires. Examinez la suspension cellulaire au microscope.Si des touffes cellulaires sont présentes, passez la suspension à travers une passoire de 70 micromètres. Transférer les cellules dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et centrifuger à 200 fois g pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et ressuscitez les cellules dans trois millilitres de PBS complétés par 2% FBS, en canalisant les cellules de haut en bas trois à cinq fois pour mélanger.Comptez les cellules au microscope à l’aide d’un hémocytomètre et diluez-les dans du PBS complété par 2% de FPS jusqu’à une concentration finale d’une fois 10 à six cellules par millilitre. Préparez deux tubes à essai à fond rond en polystyrène de cinq millilitres et ajoutez un millilitre de la suspension cellulaire à chaque tube. Étiquetez un tube comme un tube à essai et l’autre comme un tube de commande de bloqueur.Préparer une solution de bloqueur en la diluant à la concentration appropriée. Ajoutez-le au tube de commande du bloqueur et mélangez bien, puis incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Agiter le tube toutes les 10 minutes.Préparer une solution de Hoechst 33342 en la diluant à la concentration appropriée. Ajoutez-le au tube à essai et au tube de commande du bloqueur séparément et mélangez bien, puis incuber les tubes à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Agiter les tubes toutes les 10 minutes.Après l’incubation, centrifuger les cellules pendant cinq minutes à 200 fois g et quatre degrés Celsius, puis aspirer soigneusement le surnageant. Ressuscitez les cellules dans chaque tube avec un millilitre de PBS glacé complété par 2% FBS, puis pipettez les cellules de haut en bas pour mélanger. Ajouter un microlitre d’iodure de propidium d’un milligramme par millilitre, ou PI, à chaque tube et mélanger.Cliquez sur l’onglet Paramètres dans le logiciel du cytomètre de flux. Tout d’abord, choisissez les paramètres de FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red et PI, respectivement. Ensuite, choisissez l’échelle logarithmique pour le paramètre PI.Enfin, choisissez des échelles de surface et de largeur pour les paramètres FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red et PI, respectivement. Exécutez d’abord les cellules du tube à essai, puis exécutez les cellules du tube de commande du bloqueur en utilisant les mêmes tensions et portes. Collectez 20 à 100 000 événements de chaque échantillon pour analyser le pourcentage de cellules SP.Cette méthode a été employée pour détecter la proportion de cellules de SP dans la variété de cellule humaine de cancer du sein MDA-MB-231. Le diagramme à points de FSC-A par rapport à PI-A a montré une population de cellules mortes, de débris cellulaires et la population principale de cellules pi négatives, qui a été soumise à une analyse plus approfondie. Une population unicellulaire fermée à partir du diagramme à points de FSC-A par rapport à FSC-W et le diagramme à points de SSC-A contre SSC-W a été utilisé pour analyser la proportion de cellules SP, qui était d’environ 0,9% dans les cellules non traitées et d’environ 0,09% dans les cellules traitées par réserpine.Différentes concentrations de souillure de Hoechst 33342 ont été examinées sur les cellules MDA-MB-435, et on l’a déterminé que deux microgrammes par millilitre étaient optimaux pour l’analyse de PS. Les basses concentrations ont rendu difficile de distinguer des cellules de SP d’autres populations, tandis que des concentrations élevées ont fait disparaître des cellules de SP. Le vérapamil et le reserpine ont été examinés pour déterminer le bloqueur approprié pour les cellules MDA-MB-435.Environ 0,4% de cellules ont expulsé le colorant après traitement de vérapamil, mais le rapport a chuté à environ 0,1% après traitement de reserpine, démontrant que le reserpine est un bloqueur plus approprié pour cette variété de cellule. Ce protocole a également été employé pour déterminer la proportion de cellules de SP dans les cellules humaines d’adénocarcinome de poumon A549 traitées avec la colivelin d’activateur STAT3 et dans les cellules humaines de cancer du sein de T47D traitées avec l’inhibiteur FRA1 SKLB816. Ce test fournit des indices sur l’effet régulateur des voies de signalisation sur les caractéristiques des cellules souches cancéreuses et facilite la découverte de nouveaux mécanismes, qui peuvent finalement guider le traitement ciblé des tumeurs.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Tirer parti du phénotype de population latérale déclenchée par l&#39;ADN pour détecter et purifier les cellules souches du cancer à partir d&#39;échantillons biologiques

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Knockdown conditionnel de l’Expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des Monocytes/Macrophages pour le microenvironnement tumoral

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Méthode simple et rapide d’obtenir qualité tumeur ADN provenant d’échantillons cliniques pathologiques à l’aide de la cytologie mentions légales contact

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for la Variation génétique chez un Patient sporadiques de la polypose adénomateuse familiale en utilisant le Format de puce-in-a-tube

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Établissement de modèles de xénogreffe dérivés du cancer gastrique et de lignées cellulaires primaires

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radiosensibilité des cellules souches cancéreuses dans les lignées cellulaires du cancer du poumon

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Évaluation de la mort cellulaire à l’aide d’un surnageant sans cellules de probiotiques dans des cultures sphéroïdes tridimensionnelles de cellules cancéreuses colorectales

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modélisation des tumeurs osseuses primaires et des métastases osseuses avec implantation d’une greffe de tumeur solide dans l’os

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Les lignées cellulaires tumorales circulantes : un outil innovant pour la recherche fondamentale et translationnelle

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...