Name: analysis of side population in solid tumor cell lines
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00
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इस काम को चीन 81572599, 81773124 और 81972787 के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था; तियानजिन सिटी (चीन) के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन 19JCYBJC27300; तियानजिन पीपुल्स हॉस्पिटल और नानकाई विश्वविद्यालय सहयोगी अनुसंधान अनुदान 2016rmnk005; केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष, नानकाई विश्वविद्यालय 63191153 ।

1. सेल की तैयारी
<ol><li>सेल पाचन और बेअसर<ol>
<li>बीज ट्यूमर कोशिकाओं (जैसे एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं) एक 6 अच्छी तरह से थाली में, और उन्हें एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृति 5% सीओ2के साथ आपूर्ति की।</li>
		<li>...

<ol>
	<li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+cancer,+and+cancer+stem+cells.">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population.">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133/CD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component.">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).</li><li>Bailey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCLK1+marks+a+morphologically+distinct+subpopulation+of+cells+with+stem+cell+properties+in+preinvasive+pancreatic+cancer.">DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).</li><li>Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44++CD24(-)+prostate+cells+are+early+cancer+progenitor/stem+cells+that+provide+a+model+for+patients+with+poor+prognosis.">CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis.</a> British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD90++cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer.">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li><li>Schulenburg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+basic+science+and+in+translational+oncology:+can+we+translate+into+clinical+application.">Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application.</a> Journal of Hematology &amp; Oncolcology. 8, 16 (2015).</li><li>Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+Antigen-1+Enriches+for+a+Cancer+Stem+Cell-Like+Subpopulation+in+Mouse+Gastric+Cancer.">Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer.</a> Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+identification+and+sorting+using+the+Hoechst+33342+side+population+(SP).">Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP).</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).</li><li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABC+Transporters+in+Cancer+Stem+Cells:+Beyond+Chemoresistance.">ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).</li><li>Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumitremorgin+C+reverses+multidrug+resistance+in+cells+transfected+with+the+breast+cancer+resistance+protein.">Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein.</a> Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).</li><li>Takara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+calcium+antagonists+on+ABCG2/BCRP-mediated+drug+resistance+and+transport+in+SN-38-resistant+HeLa+cells.">Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells.</a> Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).</li><li>Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+specific+and+general+inhibitors+of+the+three+major+human+ATP-binding+cassette+transporters+P-gp,+BCRP+and+MRP2+among+registered+drugs.">Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs.</a> Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).</li><li>Challen, G. A., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+side+order+of+stem+cells:+the+SP+phenotype.">A side order of stem cells: the SP phenotype.</a> Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).</li><li>Wu, C., Alman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+in+human+cancers.">Side population cells in human cancers.</a> Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).</li><li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+is+enriched+in+tumorigenic,+stem-like+cancer+cells,+whereas+ABCG2++and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic.">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+Colivelin+treatment+ameliorates+memory+impairment+related+to+Alzheimer's+disease.">Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).</li><li>Marotta, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK2/STAT3+signaling+pathway+is+required+for+growth+of+CD44(+)CD24(-)+stem+cell-like+breast+cancer+cells+in+human+tumors.">The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).</li><li>Zhang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Lead+to+Drug+Candidate:+Optimization+of+3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine+Derivatives+as+Agents+for+the+Treatment+of+Triple+Negative+Breast+Cancer.">From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer.</a> Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).</li><li>Tam, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+alpha+is+a+central+signaling+node+and+therapeutic+target+for+breast+cancer+stem+cells.">Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).</li><li>Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analyses+as+a+critical+parameter+in+defining+the+side+population+(SP)+phenotype.">Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype.</a> Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).</li><li>Petriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+the+side+population+(SP).">Flow cytometry of the side population (SP).</a> Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).</li><li>Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells+exhibits+cancer+stem+cell-like+properties+without+higher+bone-metastatic+potential.">Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.</a> Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).</li><li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM3+mediates+inflammatory+signaling+to+promote+cancer+cell+stemness.">ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness.</a> Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).</li><li>Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baicalein+Suppresses+Stem+Cell-Like+Characteristics+in+Radio-+and+Chemoresistant+MDA-MB-231+Human+Breast+Cancer+Cells+through+Up-Regulation+of+IFIT2.">Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2.</a> Nutrients. 11 (3), 624 (2019).</li><li>Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapped+doxorubicin+nanoparticles+for+the+treatment+of+metastatic+anoikis-resistant+cancer+cells.">Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells.</a> Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).</li><li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells.">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+for+lung+cancer+risk+of+PM2.5+:+Induction+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+properties+in+human+non-small+cell+lung+cancer+cells.">The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).</li><li>Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Modeling+of+ABCG2+Transporter+Heterogeneity:+A+Quantitative,+Single-Cell+Analysis+of+the+Side+Population+Assay.">Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay.</a> PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+inhibitor+of+angiogenesis+inversely+correlates+with+side+population+phenotype+and+function+in+human+lung+cancer+cells.">An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells.</a> Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).</li><li>Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAIL-expressing+mesenchymal+stem+cells+kill+the+putative+cancer+stem+cell+population.">TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population.</a> British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).</li><li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties.">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+"side+population"+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+minor+groove-binding+ligands:+a+different+class+of+mammalian+DNA+topoisomerase+I+inhibitors.">DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).</li></ol>

सपा की परख के लिए कई अहम बातें ध्यान में रखनी हैं। पहला प्रत्येक सेल लाइन के लिए वेरामिल या रेसरपाइन जैसे उचित अवरोधक का चयन है, क्योंकि सपा कोशिकाओं का "गेट" स्थान उस स्थिति के अनुसार निर्धारित किया जात?...

कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) आत्म-नवीकरण क्षमता और कई भेदभाव क्षमता वाली कोशिकाओं के सबसेट हैं, जो ट्यूमर विकास, मेटास्टेसिस और पुनरावृत्ति1,2में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वर्तमान में, सीएससी को फेफड़े, मस्तिष्क, अग्न्याशय, प्रोस्टेट, स्तन और यकृतकैंसर3, 4,5,6,7,8,9सहित विभिन्न घातक ट्यूमर में मौजूद होने के लिएपहचानागया है। इन ट्यूमर में सीएससी की पहचान मुख्य रूप से सतह मार्कर प्रोटीन की उपस्थिति पर आधारित है, जैसे सीडी 44, सीडी24, सीडी 133, और एससीए-19,10की उच्च और/या कम अभिव्यक्ति, लेकिन एक अनूठा मार्कर जो सीएससी को गैर-सीएससी से अलग कर सकताहै,अब तक सूचित नहीं किया गया है । वर्तमान में, ट्यूमर ऊतक या ट्यूमर सेल लाइनों में सीएससी की पहचान और शुद्ध करने के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया जाता है। इन तकनीकों को सीएससी के विशिष्ट गुणों के आधार पर डिजाइन किया गया है। उनमें से, परख और पक्ष जनसंख्या (सपा) कोशिकाओं की छंटाई आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों में से दो हैं ।
एसपी कोशिकाओं को मूल रूप से गूडेल एट अल11द्वारा खोजा गया था, जब वे माउस बोन मैरो कोशिकाओं में हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं की विशेषता थे। जब माउस बोन मैरो कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट डाई होचस्ट 33342 के साथ लेबल किया गया था, तो होचस्ट 33342 मंद-दाग कोशिकाओं का एक छोटा समूह प्रवाह साइटोमेट्री परख के दो आयामी डॉट प्लॉट में दिखाई दिया। Hoechst 33342 एक डीएनए-बाध्यकारी डाई है और इसमें कम से कम दो बाध्यकारी मोड हैं जो विभिन्न स्पेक्ट्रल विशेषताओं का कारण बनते हैं। जब एक ही समय में दो तरंग दैर्ध्य पर फ्लोरेसेंस उत्सर्जन को देखते हैं, तो कईआबादी 12से प्रकट हो सकती है। उनकी परख में, Hoechst ३३३४२ ३५० एनएम पर उत्साहित था और फ्लोरेसेंस 450/20 एनएम बैंड-पास (बीपी) फिल्टर और ६७५ एनएम एज फिल्टर लांग-पास (EFLP)11का उपयोग करके मापा गया था । बोन मैरो कोशिकाओं की पूरी आबादी के साथ तुलना में, कोशिकाओं के इस समूह को हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं से समृद्ध किया गया था जिसे एसपी सेल11कहा जाता है। एसपी सेल तेजी से Hoechst 33342 निष्कासित करने में सक्षम हैं। इस डाई का प्रभाव एटीपी-बाइंडिंग कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर्स13से संबंधित है, जिसे कुछ एजेंटों जैसे फ्यूमिर्मेमोर्गिन सी14,वेरामिल और रेसरपाइन15, 16से बाधित किया जा सकता है। उसके बाद, विभिन्न ऊतकों, अंगों, ट्यूमर ऊतकों और ट्यूमर सेल लाइनों17, 18,19में एसपी कोशिकाओं के विभिन्नअनुपातोंका पता चला। इन एसपी सेल में स्टेम सेल17,19की कई विशेषताएं हैं .
यह पांडुलिपि होचस्ट 33342 लेबलिंग और सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं के धुंधला और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एसपी कोशिकाओं के विश्लेषण का वर्णन करती है। इसके अलावा, Hoechst 33342 एकाग्रता का अनुकूलन और इस दृष्टिकोण का उपयोग कर एक विशिष्ट ट्यूमर सेल लाइन के लिए उचित अवरोधक चयन दिखाया गया है। अंत में, ट्यूमर कोशिकाओं में एसपी के अनुपात पर स्टेमनेस प्रचार या अवरोध संकेतों के प्रभाव का प्रदर्शन किया जाता है। प्रायोगिक उदाहरण प्रदर्शित करते हैं कि एसपी के विश्लेषण का उपयोग ट्यूमर स्टेमनेस पर जीन अभिव्यक्ति, छोटे अवरोधक, एक्टिवेटर, साइटोकिन्स और केमोकिन जैसे विभिन्न संकेतों के प्रभावों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। सीएससी के अलगाव और शुद्धिकरण के लिए अन्य तरीकों की तुलना में, जैसे CD44+/CD24 की छंटाई- जनसंख्या, एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज (एएलडीएच) विश्लेषण, और ट्यूमर क्षेत्र गठन परख, यह विधि हेरफेर के लिए आसान है और लागत प्रभावी है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3516</td>
			<td>9.5 cm2 (approx.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colivelin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-P1061A</td>
			<td>Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries (BIOIND)</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSDiva</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352054</td>
			<td>12 x 75 mm, 5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td>(3&#946;, 16&#946;, 17&#945;, 18&#946;, 20&#945;)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKLB816</td>
			<td>Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td>5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of side population in solid tumor cell lines

कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) ट्यूमर ग्रोथ, मेटास्टेसिस और ऑड-ईवन का एक अहम कारण है। ट्यूमर अनुसंधान के लिए सीएससी का अलगाव और पहचान बहुत मायने रखती है। वर्तमान में, ट्यूमर ऊतकों और ट्यूमर सेल लाइनों से सीएससी की पहचान और शुद्धिकरण के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया जाता है। पक्ष जनसंख्या (एसपी) कोशिकाओं का पृथक्करण और विश्लेषण आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले दो तरीके हैं। विधियां सीएससी की फ्लोरोसेंट रंगों को तेजी से निष्कासित करने की क्षमता पर भरोसा करती हैं, जैसे कि होचस्ट 33342। डाई का efflux एटीपी-बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टरों के साथ जुड़ा हुआ है और एबीसी ट्रांसपोर्टर अवरोधकों द्वारा बाधित किया जा सकता है। Hoechst 33342 के साथ सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं को धुंधला करने और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा उनके एसपी कोशिकाओं के अनुपात का विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन किया गया है। यह परख सुविधाजनक, तेज और लागत प्रभावी है। इस परख में उत्पन्न डेटा ट्यूमर कोशिकाओं के स्टेमनेस गुणों पर जीन या अन्य बाह्राश और इंट्रासेलुलर संकेतों के प्रभाव की बेहतर समझ में योगदान दे सकता है।

इस विधि के अनुसार चार प्रायोगिक एसपी विश्लेषण किए गए। पहले एक में, हमने सामान्य परिस्थितियों में एमडीए-एमबी-231 में एसपी कोशिकाओं के अनुपात का पता लगाया, जो एक ट्रिपल नकारात्मक मानव स्तन कैंसर सेल लाइन ह?...

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Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

ठोस ट्यूमर सेल लाइनों में साइड पॉपुलेशन कोशिकाओं के अनुपात को मापने के लिए एक सुविधाजनक, तेज और लागत प्रभावी विधि प्रस्तुत की जाती है।

सॉलिड ट्यूमर सेल लाइनों में साइड पॉपुलेशन का विश्लेषण

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

साइड जनसंख्या कोशिकाओं का विश्लेषण ट्यूमर ऊतकों और ट्यूमर सेल लाइनों से कैंसर स्टेम कोशिकाओं को अलग करने और पहचानने के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले तरीकों में से एक है। यह परख सुविधाजनक, तेज और लागत प्रभावी है। यह विधि ट्यूमर कोशिकाओं के स्टेमनेस गुणों पर जीन या अन्य बाह्राश और इंट्रासेलर संकेतों के प्रभाव की बेहतर समझ में योगदान दे सकती है।कई कारक इस विश्लेषण में एसपी कोशिकाओं के प्रतिशत को प्रभावित कर सकते हैं, इसलिए औपचारिक प्रयोग से पहले उचित स्थितियों का पता लगाना महत्वपूर्ण है। एक छह अच्छी तरह से थाली में बीज ट्यूमर कोशिकाओं, और उन्हें एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ आपूर्ति की। जब कोशिका घनत्व संस्कृति माध्यम के बारे में 90% तक पहुंचता है, और पीबीएस के तीन मिलीलीटर के साथ दो बार कोशिकाओं को धोता है।फिर, प्रत्येक कुएं में 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, और प्लेट को एक से तीन मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्लेट को धीरे-धीरे टैप करें, प्रत्येक कुएं में 2% एफबीएस के साथ पूरक पीबीएस के तीन मिलीलीटर जोड़ें, और कोशिका झुरमुटों को तितर-बितर करने के लिए कोशिकाओं को तीन से पांच बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। माइक्रोस्कोप के नीचे सेल निलंबन की जांच करें।यदि सेल झुरमुट मौजूद हैं, तो निलंबन को 70 माइक्रोमीटर छलनी के माध्यम से पारित करें। कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और उन्हें पांच मिनट के लिए 200 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें। सुपरनैंट निकालें, और 2% एफबीएस के साथ पूरक पीबीएस के तीन मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, मिश्रण करने के लिए कोशिकाओं को तीन से पांच बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करें।एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की गणना करें, और उन्हें पीबीएस में पतला करें 2% एफपीएस के साथ एक बार 10 की अंतिम एकाग्रता के लिए छह कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर के लिए पूरक। दो पांच मिलीलीटर, पॉलीस्टीरिन, गोल-नीचे टेस्ट ट्यूब तैयार करें, और प्रत्येक ट्यूब में सेल निलंबन का एक मिलीलीटर जोड़ें। एक ट्यूब को टेस्ट ट्यूब के रूप में लेबल करें और दूसरा अवरोधक नियंत्रण ट्यूब के रूप में।इसे उचित एकाग्रता को कमजोर करके अवरोधक का समाधान तैयार करें। इसे अवरोधक नियंत्रण ट्यूब में जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं, फिर ट्यूब को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। हर 10 मिनट में ट्यूब हिलाएं।इसे उचित एकाग्रता को कमजोर करके होचस्ट 33342 का समाधान तैयार करें। इसे टेस्ट ट्यूब और ब्लॉकर कंट्रोल ट्यूब में अलग से जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं, फिर ट्यूबों को 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। हर 10 मिनट में ट्यूब हिलाएं।इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को 200 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें, फिर ध्यान से सुपरनेट को एस्पिरेट करें। प्रत्येक ट्यूब में कोशिकाओं को 2% एफबीएस के साथ पूरक बर्फ-ठंडे पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ फिर से खर्च करें, फिर कोशिकाओं को मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें। प्रत्येक ट्यूब में एक मिलीग्राम-प्रति-मिलीलीटर प्रोपिडियम आयोडाइड, या पीआई का एक माइक्रोलीटर जोड़ें और मिलाएं।फ्लो साइटोमीटर सॉफ्टवेयर में पैरामीटर्स टैब पर क्लिक करें। सबसे पहले, क्रमशः एफएससी, एसएससी, होचस्ट ब्लू, होचस्ट रेड और पीआई के पैरामीटर चुनें। दूसरा, पीआई पैरामीटर के लिए लॉगरिथम स्केल चुनें।अंत में, एफएससी, एसएससी, होचस्ट ब्लू, होचस्ट रेड और पीआई पैरामीटर के लिए क्रमशः क्षेत्र और चौड़ाई तराजू चुनें। पहले टेस्ट ट्यूब से कोशिकाओं को चलाएं, फिर उसी वोल्टेज और गेट का उपयोग करके अवरोधक नियंत्रण ट्यूब से कोशिकाओं को चलाएं। एसपी कोशिकाओं के प्रतिशत का विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक नमूने से 20 से 100, 000 घटनाओं को इकट्ठा करें।एमडीए-एमबी-231 मानव स्तन कैंसर सेल लाइन में एसपी कोशिकाओं के अनुपात का पता लगाने के लिए इस विधि का उपयोग किया गया था। एफएससी-ए बनाम पीआई-ए के डॉट प्लॉट में डेड सेल्स, सेल मलबे और पीआई निगेटिव सेल्स की मुख्य आबादी की आबादी दिखाई गई, जिसे आगे के विश्लेषण के अधीन किया गया । एफएससी-ए बनाम एफएससी-डब्ल्यू के डॉट प्लॉट से एक एकल सेल जनसंख्या और एसएससी-ए बनाम एसएससी-डब्ल्यू के डॉट प्लॉट का उपयोग एसपी कोशिकाओं के अनुपात का विश्लेषण करने के लिए किया गया था, जो अनुपचारित कोशिकाओं में लगभग 0.9% और रेसरपाइन के साथ इलाज की कोशिकाओं में लगभग 0.09% था।Hoechst 33342 की विभिन्न धुंधला सांद्रता एमडीए-एमबी-435 कोशिकाओं पर परीक्षण किया गया था, और यह निर्धारित किया गया था कि सपा विश्लेषण के लिए दो माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर इष्टतम था। कम सांद्रता ने एसपी कोशिकाओं को अन्य आबादी से अलग करना मुश्किल बना दिया, जबकि उच्च सांद्रता के कारण सपा कोशिकाएं गायब हो गईं। वेरापमिल और रेसरपाइन का परीक्षण एमडीए-एमबी-४३५ कोशिकाओं के लिए उचित अवरोधक निर्धारित करने के लिए किया गया था ।कोशिकाओं के बारे में 0.4% verapamil उपचार के बाद डाई निष्कासित कर दिया, लेकिन अनुपात reserpine उपचार के बाद के बारे में 0.1% तक गिरा दिया, प्रदर्शन है कि reserpine इस सेल लाइन के लिए एक अधिक उपयुक्त अवरोधक है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग A549 मानव फेफड़े एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं में एसपी कोशिकाओं के अनुपात को निर्धारित करने के लिए भी किया गया था, जो STAT3 एक्टिवेटर कोलिवलिन के साथ इलाज किया जाता है और T47D मानव स्तन कैंसर कोशिकाओं में FRA1 अवरोधक SKLB816 के साथ इलाज किया जाता है। यह परख कैंसर स्टेम सेल की विशेषताओं पर संकेत रास्ते के नियामक प्रभाव के लिए सुराग प्रदान करता है और नए तंत्र है, जो अंततः ट्यूमर के लक्षित चिकित्सा मार्गदर्शन कर सकते है की खोज की सुविधा ।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

जैविक नमूने से कैंसर के स्टेम सेल का पता लगाने और शुद्ध करने के लिए डीएनए डाई ट्रिगर साइड पॉप्युलेशन फीनोटाइप का उपयोग

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

कैंसर कोशिका लाइनों में जीन अभिव्यक्ति की सशर्त पछाड़ना के लिए Monocytes/मैक्रोफेज की भर्ती का अध्ययन करने के लिए ट्यूमर Microenvironment

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

स्पर्श छाप Cytology का उपयोग नैदानिक रोग नमूनों से उच्च गुणवत्ता वाले ट्यूमर डीएनए प्राप्त करने के लिए सरल और तेजी से विधि

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

डिजिटल पोलीमरेज़ एक छिटपुट पारिवारिक एडिनोमेटस पोलीपोसिस रोगी में आनुवंशिक भिंनता के लिए श्रृंखला प्रतिक्रिया परख चिप का उपयोग कर-a-ट्यूब प्रारूप

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

गैस्ट्रिक कैंसर रोगी व्युत्पन्न Xenograft मॉडल और प्राथमिक सेल लाइनों की स्थापना

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

फेफड़ों के कैंसर सेल लाइन्स में कैंसर स्टेम सेल की रेडियो संवेदनशीलता

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं की त्रि-आयामी स्फेरॉइड संस्कृतियों में प्रोबायोटिक्स के सेल-फ्री सुपरनेंट का उपयोग करके सेल डेथ का मूल्यांकन करना

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

हड्डी में ठोस ट्यूमर ग्राफ्ट प्रत्यारोपण के साथ प्राथमिक हड्डी ट्यूमर और हड्डी मेटास्टेसिस मॉडलिंग

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

परिसंचारी ट्यूमर सेल लाइनें: मौलिक और अनुवाद अनुसंधान के लिए एक अभिनव उपकरण

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...