Name: analysis of side population in solid tumor cell lines
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00
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Questo lavoro è stato finanziato dalla Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 e 81972787; Fondazione di Scienze Naturali della Città di Tianjin (Cina) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fondi di ricerca fondamentali per le università centrali, l'Università di Nankai 63191153.

1. Preparazione cellulare
<ol><li>Digestione cellulare e neutralizzazione<ol>
<li>Seminare cellule tumorali (come le cellule MDA-MB-231) in una piastra di 6 pozzi e culturerle in un incubatore a 37 °C fornito con 5% di CO2.</li>
		<li>Raccogli le cellule quando la loro densità raggiunge circa il 90%. Aspirare accuratamente il mezzo di coltura e lavare accuratamente le cellule 2x con 3 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). NOTA: Per esaminare gli effetti degli inibitori della via di segnala...

<ol>
	<li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+cancer,+and+cancer+stem+cells.">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population.">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133/CD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component.">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).</li><li>Bailey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCLK1+marks+a+morphologically+distinct+subpopulation+of+cells+with+stem+cell+properties+in+preinvasive+pancreatic+cancer.">DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).</li><li>Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44++CD24(-)+prostate+cells+are+early+cancer+progenitor/stem+cells+that+provide+a+model+for+patients+with+poor+prognosis.">CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis.</a> British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD90++cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer.">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li><li>Schulenburg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+basic+science+and+in+translational+oncology:+can+we+translate+into+clinical+application.">Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application.</a> Journal of Hematology &amp; Oncolcology. 8, 16 (2015).</li><li>Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+Antigen-1+Enriches+for+a+Cancer+Stem+Cell-Like+Subpopulation+in+Mouse+Gastric+Cancer.">Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer.</a> Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+identification+and+sorting+using+the+Hoechst+33342+side+population+(SP).">Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP).</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).</li><li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABC+Transporters+in+Cancer+Stem+Cells:+Beyond+Chemoresistance.">ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).</li><li>Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumitremorgin+C+reverses+multidrug+resistance+in+cells+transfected+with+the+breast+cancer+resistance+protein.">Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein.</a> Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).</li><li>Takara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+calcium+antagonists+on+ABCG2/BCRP-mediated+drug+resistance+and+transport+in+SN-38-resistant+HeLa+cells.">Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells.</a> Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).</li><li>Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+specific+and+general+inhibitors+of+the+three+major+human+ATP-binding+cassette+transporters+P-gp,+BCRP+and+MRP2+among+registered+drugs.">Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs.</a> Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).</li><li>Challen, G. A., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+side+order+of+stem+cells:+the+SP+phenotype.">A side order of stem cells: the SP phenotype.</a> Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).</li><li>Wu, C., Alman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+in+human+cancers.">Side population cells in human cancers.</a> Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).</li><li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+is+enriched+in+tumorigenic,+stem-like+cancer+cells,+whereas+ABCG2++and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic.">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+Colivelin+treatment+ameliorates+memory+impairment+related+to+Alzheimer's+disease.">Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).</li><li>Marotta, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK2/STAT3+signaling+pathway+is+required+for+growth+of+CD44(+)CD24(-)+stem+cell-like+breast+cancer+cells+in+human+tumors.">The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).</li><li>Zhang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Lead+to+Drug+Candidate:+Optimization+of+3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine+Derivatives+as+Agents+for+the+Treatment+of+Triple+Negative+Breast+Cancer.">From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer.</a> Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).</li><li>Tam, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+alpha+is+a+central+signaling+node+and+therapeutic+target+for+breast+cancer+stem+cells.">Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).</li><li>Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analyses+as+a+critical+parameter+in+defining+the+side+population+(SP)+phenotype.">Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype.</a> Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).</li><li>Petriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+the+side+population+(SP).">Flow cytometry of the side population (SP).</a> Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).</li><li>Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells+exhibits+cancer+stem+cell-like+properties+without+higher+bone-metastatic+potential.">Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.</a> Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).</li><li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM3+mediates+inflammatory+signaling+to+promote+cancer+cell+stemness.">ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness.</a> Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).</li><li>Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baicalein+Suppresses+Stem+Cell-Like+Characteristics+in+Radio-+and+Chemoresistant+MDA-MB-231+Human+Breast+Cancer+Cells+through+Up-Regulation+of+IFIT2.">Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2.</a> Nutrients. 11 (3), 624 (2019).</li><li>Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapped+doxorubicin+nanoparticles+for+the+treatment+of+metastatic+anoikis-resistant+cancer+cells.">Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells.</a> Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).</li><li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells.">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+for+lung+cancer+risk+of+PM2.5+:+Induction+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+properties+in+human+non-small+cell+lung+cancer+cells.">The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).</li><li>Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Modeling+of+ABCG2+Transporter+Heterogeneity:+A+Quantitative,+Single-Cell+Analysis+of+the+Side+Population+Assay.">Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay.</a> PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+inhibitor+of+angiogenesis+inversely+correlates+with+side+population+phenotype+and+function+in+human+lung+cancer+cells.">An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells.</a> Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).</li><li>Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAIL-expressing+mesenchymal+stem+cells+kill+the+putative+cancer+stem+cell+population.">TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population.</a> British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).</li><li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties.">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+"side+population"+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+minor+groove-binding+ligands:+a+different+class+of+mammalian+DNA+topoisomerase+I+inhibitors.">DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).</li></ol>

Ci sono diversi punti chiave da tenere a mente per il test SP. Il primo è la selezione di un blocco adeguato, come Verapamil o Reserpine, per ogni linea cellulare, perché la posizione "gate" delle celle SP è determinata in base alla posizione in cui un gran numero di cellule SP scompaiono dopo l'aggiunta del blocco. Per la linea di celle MDA-MB-231, Reserpine funziona bene. Tuttavia, per altre linee di celle, i blocchi diversi potrebbero funzionare meglio.
Il secondo è la concentrazione di...

Le cellule staminali tumorali (CSC) sono sottoinsiemi di cellule con capacità di autorinnoto e potenziale di differenziazione multipla, che svolgono un ruolo vitale nella crescita tumorale, metastasi erecidiva 1,2. Attualmente, i CSC sono stati identificati per esistere in una varietà di tumori maligni, tra cui tumori polmonari, cerebrali, pancreas, prostata, seno e fegato3,4,5,6,7,8,9. L'identificazione dei CSC in questi tumori si basa principalmente sulla presenza di proteine marcatori superficiali, come l'alta e/o bassa espressione di CD44, CD24, CD133 e Sca-19,10, ma un marcatore unico in grado di distinguere le CSC dai non CSC non è stato segnalato finora. Attualmente, diverse tecniche sono utilizzate per identificare e purificare i CSC nei tessuti tumorali o nelle linee cellulari tumorali. Queste tecniche sono progettate in base alle proprietà specifiche dei CSC. Tra questi, i saggi e lo smistamento delle cellule della popolazione laterale (SP) sono due dei metodi comunemente usati.
Le cellule SP sono state originariamente scoperte da Goodell etal. Quando le cellule del midollo osseo del topo furono etichettate con il colorante fluorescente Hoechst 33342, un piccolo gruppo di cellule macchiate di hoechst 33342 appariva nel grafico a punti bidimensionale di un saggio di citometria a flusso. Hoechst 33342 è un colorante legante il DNA e ha almeno due modalità di legame che portano a diverse caratteristiche spettrali. Quando si visualizza l'emissione di fluorescenza a due lunghezze d'onda contemporaneamente, è possibile rivelare più popolazioni12. Nel loro saggio, l'Hoechst 33342 era eccitato a 350 nm e la fluorescenza è stata misurata utilizzando il filtro passa-banda (BP) da 450/20 nm e il filtro perimetrale long-pass (EFLP)11da 675 nm. Rispetto all'intera popolazione di cellule del midollo osseo, questo gruppo di cellule è stato arricchito con cellule staminali ematopoietiche chiamate cellule SP11. Le cellule SP sono in grado di espellere rapidamente hoechst 33342. L'efflux di questo colorante è correlato ai trasportatori di cassette di legame ATP (ABC)13, che possono essere inibiti da alcuni agenti come Fumitremorgin C14,Verapamil e Reserpine15,16. Successivamente, diverse proporzioni di cellule SP sono state rilevate in una varietà di tessuti, organi, tessuti tumorali e linee cellulari tumorali17,18,19. Queste cellule SP hanno molte caratteristiche delle cellule staminali17,19.
Questo manoscritto descrive l'etichettatura e la colorazione hoechst 33342 delle cellule tumorali coltivate e l'analisi delle cellule SP per citometria del flusso. Inoltre, vengono mostrate l'ottimizzazione della concentrazione di Hoechst 33342 e la corretta selezione del bloccante per una specifica linea cellulare tumorale utilizzando questo approccio. Infine, vengono dimostrati gli effetti della promozione della staminalità o dei segnali di inibizione sulla proporzione di SP nelle cellule tumorali. Gli esempi sperimentali dimostrano che l'analisi della SP può essere utilizzata per esplorare gli effetti di vari segnali, come l'espressione genica, piccoli inibitori, attivatori, citochine e chemiochine, sulla staminali tumorale. Rispetto ad altri metodi per l'isolamento e la purificazione dei CSC, come lo smistamento di CD44+/CD24– popolazione, analisi dell'aldeide deidrogenasi (ALDH) e test di formazione della sfera tumorale, questo metodo è più facile da manipolazione ed è conveniente.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3516</td>
			<td>9.5 cm2 (approx.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colivelin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-P1061A</td>
			<td>Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries (BIOIND)</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSDiva</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352054</td>
			<td>12 x 75 mm, 5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td>(3&#946;, 16&#946;, 17&#945;, 18&#946;, 20&#945;)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKLB816</td>
			<td>Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td>5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of side population in solid tumor cell lines

Le cellule staminali tumorali (CSC) sono una causa importante di crescita tumorale, metastasi e recidiva. L'isolamento e l'identificazione dei CSC sono di grande importanza per la ricerca sul tumore. Attualmente, diverse tecniche sono utilizzate per l'identificazione e la purificazione dei CSC dai tessuti tumorali e dalle linee cellulari tumorali. La separazione e l'analisi delle cellule della popolazione laterale (SP) sono due dei metodi comunemente usati. I metodi si basano sulla capacità dei CSC di espellere rapidamente coloranti fluorescenti, come hoechst 33342. L'efflux del colorante è associato ai trasportatori di cassette di legame ATP (ABC) e può essere inibito dagli inibitori del trasportatore ABC. Vengono descritti i metodi per la colorazione delle cellule tumorali coltivate con Hoechst 33342 e l'analisi della proporzione delle loro cellule SP mediante citometria a flusso. Questo test è conveniente, veloce ed economico. I dati generati in questo saggio possono contribuire a una migliore comprensione dell'effetto dei geni o di altri segnali extracellulari e intracellulari sulle proprietà di staminali delle cellule tumorali.

Secondo questo metodo sono state eseguite quattro analisi sperimentali dell'SP. Nel primo, abbiamo rilevato la proporzione di cellule SP in MDA-MB-231, che è una linea cellulare per il cancro al seno umano tripla negativa, in condizioni normali. Dopo il conteggio delle cellule, hoechst 33342 è stato aggiunto in un tubo contenente 1 x10 6 celle ad una concentrazione finale di 3 μg/mL. Reserpina e Hoechst 33342 sono stati aggiunti ad un altro tubo a concentrazioni finali rispettivamente di 40 μM e 3 μg/mL. ...

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Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Viene presentato un metodo conveniente, veloce ed economico per misurare la proporzione di cellule della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide.

Analisi della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

L'analisi delle cellule della popolazione laterale è uno dei metodi comunemente usati per isolare e identificare le cellule staminali tumorali dai tessuti tumorali e dalle linee cellulari tumorali. Questo test è conveniente, veloce ed economico. Questo metodo può contribuire a una migliore comprensione dell'effetto dei geni o di altri segnali extracellulari e intracellulari sulle proprietà di staminali delle cellule tumorali.Molti fattori possono influenzare la percentuale di cellule SP in questa analisi, quindi è fondamentale esplorare le condizioni corrette prima dell'esperimento formale. Semina le cellule tumorali in una piastra di sei po', e incubale in un incubatore Celsius di 37 gradi fornito con anidride carbonica al 5%. Quando la densità cellulare raggiunge circa il 90% aspira il mezzo di coltura e lava le cellule due volte con tre millilitri di PBS.Quindi, aggiungere 500 microlitri dello 0,25% di tripsiderina-EDTA a ciascun pozzo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per uno o tre minuti. Toccare delicatamente la piastra per staccare le celle, aggiungere tre millilitri di PBS integrati con 2%FBS a ciascun pozzo e pipettare le celle su e giù da tre a cinque volte per disperdere i grumi cellulari. Esaminare la sospensione cellulare al microscopio.Se sono presenti grumi cellulari, passare la sospensione attraverso un filtro da 70 micrometri. Trasferire le cellule in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e centrifugarle a 200 volte g per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in tre millilitri di PBS integrati con 2%FBS, pipettando le celle su e giù da tre a cinque volte per mescolare.Contare le cellule al microscopio usando un emocitometro e diluirle in PBS integrato con 2%FPS ad una concentrazione finale di una per 10 alle sei cellule per millilitro. Preparare due provette a cinque millilitri, polistirolo, fondo tondo e aggiungere un millilitro della sospensione cellulare a ciascun tubo. Etichettare una provetta come provetta e l'altra come tubo di controllo del bloccante.Preparare una soluzione di bloccante diluerla alla concentrazione appropriata. Aggiungilo al tubo di controllo del bloccante e mescola bene, quindi incuba il tubo a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Agitare il tubo ogni 10 minuti.Preparare una soluzione di Hoechst 33342 diluerla alla concentrazione appropriata. Aggiungerlo separatamente alla provetta e al tubo di controllo del bloccante e mescolare bene, quindi incubare i tubi a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Agitare i tubi ogni 10 minuti.Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule per cinque minuti a 200 volte g e quattro gradi Celsius, quindi aspirare attentamente il supernatante. Rimorsi le celle in ogni tubo con un millilitro di PBS ghiacciato integrato con 2%FBS, quindi pipettare le celle su e giù per mescolare. Aggiungere un microlitro di ioduro di propidio di un milligrammo per millilitro, o PI, a ciascun tubo e mescolare.Fare clic sulla scheda Parametri nel software del citometro di flusso. In primo luogo, scegliete i parametri rispettivamente di FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red e PI. In secondo luogo, scegliere la scala logaritmica per il parametro PI.Infine, scegliete le scale di area e larghezza rispettivamente per i parametri FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red e PI. Eseguire prima le celle dalla provetta, quindi eseguire le celle dal tubo di controllo del bloccante utilizzando le stesse tensioni e cancelli. Raccogli da 20 a 100.000 eventi da ogni campione per analizzare la percentuale di celle SP.Questo metodo è stato utilizzato per rilevare la proporzione di cellule SP nella linea cellulare del cancro al seno umano MDA-MB-231. La trama a punti di FSC-A contro PI-A mostrava una popolazione di cellule morte, detriti cellulari e la principale popolazione di cellule negative PI, che fu sottoposta ad ulteriori analisi. Una singola popolazione cellulare gateed dal grafico a punti di FSC-A contro FSC-W e il grafico a punti di SSC-A rispetto a SSC-W è stato utilizzato per analizzare la proporzione di cellule SP, che era di circa lo 0,9% nelle celle non trattate e circa lo 0,09% nelle celle trattate con reserpina.Diverse concentrazioni di colorazione di Hoechst 33342 sono state testate su celle MDA-MB-435, ed è stato determinato che due microgrammi per millilitro erano ottimali per l'analisi SP. Basse concentrazioni hanno reso difficile distinguere le cellule SP dalle altre popolazioni, mentre alte concentrazioni hanno causato la scomparsa delle cellule SP. Verapamil e reserpina sono stati testati per determinare il blocco corretto per le celle MDA-MB-435.Circa lo 0,4% delle cellule ha espulso il colorante dopo il trattamento con verapamil, ma il rapporto è sceso a circa lo 0,1% dopo il trattamento con reserpina, dimostrando che la reserpina è un bloccante più appropriato per questa linea cellulare. Questo protocollo è stato utilizzato anche per determinare la proporzione di cellule SP nelle cellule adenocarcinoma polmonari umane A549 trattate con attivatore STAT3 colivelin e nelle cellule tumorali del seno umano T47D trattate con inibitore FRA1 SKLB816. Questo saggio fornisce indizi sull'effetto regolatore delle vie di segnalazione sulle caratteristiche delle cellule staminali tumorali e facilita la scoperta di nuovi meccanismi, che possono in ultima analisi guidare la terapia mirata dei tumori.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Sfruttamento del fenotipo della popolazione laterale innescato dal DNA per rilevare e purificare le cellule staminali del cancro da campioni biologici

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Atterramento condizionale dell'espressione genica in linee cellulari del cancro per studiare il reclutamento dei monociti/macrofagi al microambiente tumorale

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Metodo semplice e veloce per ottenere alta qualità tumore del DNA da campioni clinico-patologiche utilizzando Touch Imprint citologia

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Reazione a catena della polimerasi digitale per la variazione genetica in un paziente di poliposi adenomatosa familiare sporadica utilizzando il formato di Chip-in-a-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Stabilimento di modelli Xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radiosensibilità delle cellule staminali tumorali nelle linee cellulari del cancro del polmone

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Valutazione della morte cellulare utilizzando un surnatante privo di cellule di probiotici in colture sferoidali tridimensionali di cellule tumorali del colon-retto

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee con impianto di innesto tumorale solido nell'osso

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Linee cellulari tumorali circolanti: uno strumento innovativo per la ricerca fondamentale e traslazionale

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...