Name: analysis of side population in solid tumor cell lines
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00
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이 작품은 중국 81572599, 81773124, 81972787 대한 중국 자연과학 재단의 지원을 받았습니다. 천진시 자연과학재단(중국) 19JCYBJC27300; 천진인민병원 & 난카이대학 협력연구보조금 2016rmnk005; 중앙 대학, 난카이 대학 63191153 대한 기본 연구 기금.

1. 셀 준비
<ol><li>세포 소화 및 중화<ol>
<li>종자 종양 세포(예: MDA-MB-231 세포)는 6웰 플레이트에서, 5%CO2로공급되는 37°C 인큐베이터에서 배양한다.</li>
		<li>그들의 밀도가 대략 90%에 도달할 때 세포를 수확합니다. 배양 배지를 철저히 흡인시키고 3mL의 인산염 완충식식염수(PBS)로 세포를 2x 세척한다. 참고: 종양 세포의 줄기 기능에 대한 신호 경로 억제제 (예를 들어, FRA1 억제제), 또는 활성...

<ol>
	<li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+cancer,+and+cancer+stem+cells.">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population.">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133/CD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component.">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).</li><li>Bailey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCLK1+marks+a+morphologically+distinct+subpopulation+of+cells+with+stem+cell+properties+in+preinvasive+pancreatic+cancer.">DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).</li><li>Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44++CD24(-)+prostate+cells+are+early+cancer+progenitor/stem+cells+that+provide+a+model+for+patients+with+poor+prognosis.">CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis.</a> British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD90++cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer.">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li><li>Schulenburg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+basic+science+and+in+translational+oncology:+can+we+translate+into+clinical+application.">Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application.</a> Journal of Hematology &amp; Oncolcology. 8, 16 (2015).</li><li>Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+Antigen-1+Enriches+for+a+Cancer+Stem+Cell-Like+Subpopulation+in+Mouse+Gastric+Cancer.">Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer.</a> Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+identification+and+sorting+using+the+Hoechst+33342+side+population+(SP).">Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP).</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).</li><li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABC+Transporters+in+Cancer+Stem+Cells:+Beyond+Chemoresistance.">ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).</li><li>Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumitremorgin+C+reverses+multidrug+resistance+in+cells+transfected+with+the+breast+cancer+resistance+protein.">Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein.</a> Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).</li><li>Takara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+calcium+antagonists+on+ABCG2/BCRP-mediated+drug+resistance+and+transport+in+SN-38-resistant+HeLa+cells.">Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells.</a> Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).</li><li>Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+specific+and+general+inhibitors+of+the+three+major+human+ATP-binding+cassette+transporters+P-gp,+BCRP+and+MRP2+among+registered+drugs.">Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs.</a> Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).</li><li>Challen, G. A., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+side+order+of+stem+cells:+the+SP+phenotype.">A side order of stem cells: the SP phenotype.</a> Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).</li><li>Wu, C., Alman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+in+human+cancers.">Side population cells in human cancers.</a> Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).</li><li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+is+enriched+in+tumorigenic,+stem-like+cancer+cells,+whereas+ABCG2++and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic.">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+Colivelin+treatment+ameliorates+memory+impairment+related+to+Alzheimer's+disease.">Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).</li><li>Marotta, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK2/STAT3+signaling+pathway+is+required+for+growth+of+CD44(+)CD24(-)+stem+cell-like+breast+cancer+cells+in+human+tumors.">The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).</li><li>Zhang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Lead+to+Drug+Candidate:+Optimization+of+3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine+Derivatives+as+Agents+for+the+Treatment+of+Triple+Negative+Breast+Cancer.">From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer.</a> Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).</li><li>Tam, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+alpha+is+a+central+signaling+node+and+therapeutic+target+for+breast+cancer+stem+cells.">Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).</li><li>Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analyses+as+a+critical+parameter+in+defining+the+side+population+(SP)+phenotype.">Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype.</a> Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).</li><li>Petriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+the+side+population+(SP).">Flow cytometry of the side population (SP).</a> Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).</li><li>Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells+exhibits+cancer+stem+cell-like+properties+without+higher+bone-metastatic+potential.">Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.</a> Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).</li><li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM3+mediates+inflammatory+signaling+to+promote+cancer+cell+stemness.">ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness.</a> Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).</li><li>Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baicalein+Suppresses+Stem+Cell-Like+Characteristics+in+Radio-+and+Chemoresistant+MDA-MB-231+Human+Breast+Cancer+Cells+through+Up-Regulation+of+IFIT2.">Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2.</a> Nutrients. 11 (3), 624 (2019).</li><li>Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapped+doxorubicin+nanoparticles+for+the+treatment+of+metastatic+anoikis-resistant+cancer+cells.">Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells.</a> Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).</li><li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells.">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+for+lung+cancer+risk+of+PM2.5+:+Induction+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+properties+in+human+non-small+cell+lung+cancer+cells.">The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).</li><li>Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Modeling+of+ABCG2+Transporter+Heterogeneity:+A+Quantitative,+Single-Cell+Analysis+of+the+Side+Population+Assay.">Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay.</a> PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+inhibitor+of+angiogenesis+inversely+correlates+with+side+population+phenotype+and+function+in+human+lung+cancer+cells.">An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells.</a> Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).</li><li>Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAIL-expressing+mesenchymal+stem+cells+kill+the+putative+cancer+stem+cell+population.">TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population.</a> British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).</li><li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties.">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+"side+population"+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+minor+groove-binding+ligands:+a+different+class+of+mammalian+DNA+topoisomerase+I+inhibitors.">DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).</li></ol>

SP 분석기의 경우 몇 가지 핵심 사항이 있습니다. 첫 번째는 각 세포주에 대해 베라파밀 또는 레서핀과 같은 적절한 차단제의 선택이며, SP 세포의 "게이트" 위치는 차단기의 첨가 후 많은 수의 SP 세포가 사라지는 위치에 따라 결정되기 때문이다. MDA-MB-231 세포주, 레서핀은 잘 작동합니다. 그러나, 다른 세포주에 대 한, 다른 차단제 더 나은 작동 수 있습니다.
두 번째는 Hoechst 3334...

암 줄기세포(CSC)는 자가 재생 능력과 여러 분화 잠재력을 가진 세포의 하위 집합으로 종양 성장, 전이 및 재발1,2에서중요한 역할을 한다. 현재 CSC는 폐, 뇌, 췌장, 전립선, 유방암 및간암3,4,5,6,7,8,9를포함한 다양한 악성종양에존재하는 것으로 확인되었습니다. 이들 종양에서 CSC의 식별은 주로 CD44, CD24, CD133 및 Sca-19,10의높은 및/또는 낮은 발현과 같은 표면 마커 단백질의 존재에 기초하지만, 비-CSC로부터 CSC를 구별할 수 있는 독특한 마커는 지금까지 보고되지 않았다. 현재, 몇몇 기술은 종양 조직 또는 종양 세포주에서 CSCs를 확인하고 정화하기 위하여 이용됩니다. 이러한 기술은 CS의 특정 특성을 기반으로 설계되었습니다. 그 중에서도, 측면 집단(SP) 세포의 소법과 정렬은 일반적으로 사용되는 두 가지 방법이다.
SP 세포는 원래 구델 외11에의해 발견되었다, 그들은 마우스 골수 세포에서 조혈 줄기 세포를 특성화 할 때. 마우스 골수 세포가 형광염 호흐트 33342로 표지되었을 때, Hoechst 33342 의 작은 그룹은 유동 세포 분석법의 2차원 도표 플롯에 나타났다. Hoechst 33342는 DNA 결합 염료이고 다른 스펙트럼 특성으로 이끌어 내는 적어도 2개의 결합 모드가 있습니다. 동시에 두 파장에서 형광 방출을 볼 때, 다중 인구는12를드러낸다. 이들의 분석에서 Hoechst 33342는 350nm에서 흥분되었고 형광은 450/20 nm 대역 패스(BP) 필터 및 675 nm 엣지 필터 롱패스(EFLP)11을사용하여 측정하였다. 골수 세포의 전체 인구와 비교하여, 세포의이 그룹은 SP 세포(11)에게불린 조혈 줄기 세포로 풍부하게 되었다. SP 세포는 Hoechst 33342를 급속하게 추방할 수 있습니다. 이 염료의 효능은 ATP 결합 카세트 (ABC)수송기 (13)와관련이 있으며, 이는 Fumitremorgin C14,Verapamil 및 Reserpine15,16과같은 일부 에이전트에 의해 억제 될 수 있습니다. 그 후, SP 세포의 상이한 비율은 다양한 조직, 장기, 종양 조직 및 종양 세포주17,18,19에서검출되었다. 이들 SP 세포는줄기세포(17,19)의많은특성을갖는다.
이 원고는 Hoechst 33342 의 배양 된 종양 세포의 라벨링 및 염색 및 유동 세포측정에 의한 SP 세포의 분석을 설명합니다. 더욱이, 이러한 접근법을 이용하여 특정 종양 세포주에 대한 Hoechst 33342 농도 및 적절한 차단제 선택의 최적화가 도시된다. 마지막으로, 종양 세포에서 SP의 비율에 대한 줄기 촉진 또는 억제 신호의 효과가 입증된다. 실험적인 예는 SP의 분석이 종양 줄기에 유전자 발현, 작은 억제제, 활성제, 사이토카인 및 화학과 같은 다양한 신호의 효과를 탐구하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. CD44 +/CD24의 정렬과 같은 CSC의격리 및 정화를 위한 다른 방법에 비해 인구, 알데히드 탈수소효소(ALDH) 분석 및 종양 구형성 분석, 이 방법은 조작이 용이하며 비용 효율적입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3516</td>
			<td>9.5 cm2 (approx.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colivelin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-P1061A</td>
			<td>Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries (BIOIND)</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSDiva</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352054</td>
			<td>12 x 75 mm, 5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td>(3&#946;, 16&#946;, 17&#945;, 18&#946;, 20&#945;)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKLB816</td>
			<td>Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td>5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of side population in solid tumor cell lines

암 줄기 세포 (CSC)는 종양 성장, 전이 및 재발의 중요한 원인입니다. CSC의 격리 및 식별은 종양 연구에 큰 의미가 있습니다. 현재, 몇몇 기술은 종양 조직 및 종양 세포주에서 CSC의 식별 그리고 정화를 위해 이용됩니다. 측면 집단(SP) 세포의 분리 및 분석은 일반적으로 사용되는 두 가지 방법이다. 이 방법은 HCs가 Hoechst 33342와 같은 형광 염료를 빠르게 추방하는 능력에 의존합니다. 염료의 efflux는 ATP 결합 카세트 (ABC) 수송기와 연관되고 ABC 수송 억제제에 의해 억제 될 수있다. Hoechst 33342를 사용하여 배양된 종양 세포를 염색하고 혈류 세포에 의한 SP 세포의 비율을 분석하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 분석은 편리하고 빠르며 비용 효율적입니다. 이 분석에서 생성된 데이터는 종양 세포의 줄기 특성에 대한 유전자 또는 기타 세포 외 및 세포 내 신호의 효과에 대한 더 나은 이해에 기여할 수 있습니다.

이 방법에 따라 4개의 실험SP 분석이 수행되었다. 첫 번째 하나에서, 우리는 정상 조건하에서, 3중 음성 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231에 있는 SP 세포의 비율을 검출했습니다. 세포 계수 후 Hoechst 33342를 1 x 106 세포를 포함하는 하나의 튜브에 첨가되어 3 μg/mL의 최종 농도를 하였다. 레서핀과 호흐트스트 33342는 각각 40 μM 및 3 μg/mL의 최종 농도에 다른 튜브에 첨가되었다. PI는 두 튜브에 추가?...

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Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

고형 종양 세포주에서 측면 집단 세포의 비율을 측정하는 편리하고 빠르며 비용 효율적인 방법이 제시된다.

고형 종양 세포주에서 측면 인구의 분석

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

측면 집단 세포의 분석은 종양 조직 및 종양 세포주로부터 암 줄기 세포를 격리하고 식별하는 데 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다. 이 분석은 편리하고 빠르며 비용 효율적입니다. 이 방법은 종양 세포의 줄기 속성에 유전자 또는 그밖 세포외 및 세포내 신호의 효력의 더 나은 이해에 기여할 수 있습니다.많은 요인이 이 분석에서 SP 세포의 백분율에 영향을 미칠 수 있으므로 공식적인 실험 전에 적절한 조건을 탐색하는 것이 중요합니다. 6웰 플레이트에 종양 세포를 종자, 5 %의 이산화탄소와 함께 공급 37도 섭씨 인큐베이터에서 그들을 배양. 세포 밀도가 약 90%에 도달하면 배양 배지를 흡인하고, PBS의 3밀리리터로 세포를 두 번 세척한다.그런 다음 각 웰에 0.25 %의 트립신-EDTA의 500 마이크로 리터를 추가하고 1 ~ 3 분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 부드럽게 세포를 분리하기 위해 접시를 누른 다음, 각 우물에 2 %의 FBS로 보충 된 PBS의 3 밀리리터를 추가하고 세포를 위아래로 피펫하여 세포 덩어리를 분산시십시오. 현미경의 밑에 세포 현탁액을 검사합니다.세포 덩어리가 존재하는 경우, 70 마이크로 미터 여과기를 통해 서스펜션을 전달합니다. 세포를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리기는 5분 동안 200배 g로 전달합니다. 상체를 제거하고 2 %의 FBS로 보충 된 PBS의 3 밀리리터에서 세포를 다시 일시 중지하여 세포를 3 ~ 5 번 배 위아래로 피펫하여 혼합합니다.혈종계를 사용하여 현미경의 밑에 세포를 계산하고, 밀리리터 당 6 개의 세포에 10의 최종 농도로 2%FPS로 보충된 PBS에서 그(것)들을 희석합니다. 5밀리리터, 폴리스티렌, 라운드 하단 테스트 튜브 2개를 준비하고 각 튜브에 셀 서스펜션 1밀리리터를 추가합니다. 한 튜브를 테스트 튜브로, 다른 튜브를 차단제 제어 튜브로 라벨을 부착합니다.적절한 농도로 희석하여 차단제의 용액을 준비합니다. 블로커 컨트롤 튜브에 넣고 잘 섞은 다음 37°C에서 30분간 튜브를 배양합니다. 10분마다 튜브를 흔들어 줍니다.Hoechst 33342의 용액을 적절한 농도로 희석하여 준비하십시오. 테스트 튜브 및 차단제 제어 튜브에 별도로 추가하고 잘 섞은 다음 60 분 동안 섭씨 37도에서 튜브를 배양합니다. 10분마다 튜브를 흔들어 줍니다.인큐베이션 후, 세포를 200배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리한 다음, 수퍼나티를 조심스럽게 흡인시합니다. 2%의 FBS로 보충된 얼음 감기 PBS의 1밀리리터로 각 튜브의 세포를 다시 중단한 다음 세포를 위아래로 섞어 냅니다. 각 튜브에 밀리리터 당 1 밀리그램 프로피듐 요오드 또는 PI의 마이크로리터 1개를 넣고 혼합합니다.흐름 사이토미터 소프트웨어에서 매개 변수 탭을 클릭합니다. 먼저 FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red 및 PI의 매개 변수를 각각 선택합니다. 둘째, PI 매개 변수에 대한 로그자리믹 축척을 선택합니다.마지막으로 FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red 및 PI 매개변수에 대한 영역 및 너비 저울을 각각 선택합니다. 먼저 테스트 튜브에서 세포를 실행한 다음 동일한 전압과 게이트를 사용하여 차단기 제어 관에서 셀을 실행합니다. 각 샘플에서 20~100, 000개의 이벤트를 수집하여 SP 셀의 백분율을 분석합니다.이 방법은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포주에서 SP 세포의 비율을 검출하기 위해 사용되었다. FSC-A 대 PI-A의 도트 플롯은 죽은 세포, 세포 파편 및 PI 음성 세포의 주요 집단의 인구를 보여주었으며, 이는 추가 분석을 거쳤습니다. FSC-A대 점도플롯에서 게이트된 단일 세포 집단과 SSC-A 대 SSC-A의 도트 플롯은 치료되지 않은 세포에서 약 0.9%, 레서핀으로 치료된 세포에서 약 0.09%였던 SP 세포의 비율을 분석하는 데 사용되었다.Hoechst 33342의 상이한 염색 농도는 MDA-MB-435 세포에서 시험되었고, 밀리리터당 2마이크로그램이 SP 분석을 위해 최적이라고 판단되었다. 낮은 농도는 SP 세포를 다른 집단과 구별하기 어렵게 만들었으며, 높은 농도로 인해 SP 세포가 사라지게 되었습니다. 베라파밀 과 레서핀은 MDA-MB-435 세포에 대한 적절한 차단제를 결정하기 위해 시험되었다.세포의 대략 0.4%는 verapamil 처리 후에 염료를 추방했습니다, 그러나 비율은 reserpine 처리 후에 대략 0.1%로 떨어졌습니다, reserpine이 이 세포주에 더 적합한 차단제이다는 것을 보여주는. 이 프로토콜은 또한 STAT3 활성제 colivelin로 처리된 A549 인간 폐 선암 세포및 FRA1 억제제 SKLB816으로 취급된 T47D 인간 유방암 세포에서 SP 세포의 비율을 결정하기 위하여 이용되었습니다. 이 분석법은 암 줄기 세포의 기능에 대한 신호 경로의 규제 효과에 대한 단서를 제공하고 궁극적으로 종양의 표적 치료를 안내 할 수있는 새로운 메커니즘의 발견을 용이하게합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

DNA 염료에 의한 측면 집단 표현형을 활용하여 생물학적 샘플에서 암 줄기 세포를 검출하고 정제

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

연구

암 연구학

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

암 세포 선 종양 Microenvironment에 Monocytes/대 식 세포의 모집 연구에서 유전자 발현의 조건부 최저

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

폐암 세포줄에 있는 암 줄기 세포의 방과성

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

대장암세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 세포없는 슈퍼네탄을 사용하여 세포 사멸 평가

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

원발성 뼈 종양 및 뼈에 이식된 고형 종양을 통한 뼈 전이 모델링

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

순환 종양 세포 주: 근본적이고 번역적인 연구를 위한 혁신적인 도구

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...