Name: analysis of side population in solid tumor cell lines
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 og 81972787; Tianjin bys naturvitenskapelige stiftelse (Kina) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital &Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Grunnleggende forskningsmidler for de sentrale universitetene, Nankai University 63191153.

1. Celleforberedelse
<ol><li>Celle fordøyelse og nøytralisering<ol>
<li>Frøsvulstceller (som MDA-MB-231 celler) i en 6 brønnplate, og kultur dem i en 37 ° C inkubator levert med 5% CO2.</li>
		<li>Høst celler når deres tetthet når ca 90%. Aspirer kulturmediet grundig og vask cellene 2x med 3 ml fosfatbufret saltvann (PBS). MERK: For å undersøke effekten av signalveihemmere (f.eks. FRA1-hemmere) eller aktivatorer (f.eks. STAT3-aktivator) på stamceller, blir tumorceller sådd i en 6 brønnplate o...

<ol>
	<li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+cancer,+and+cancer+stem+cells.">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population.">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133/CD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component.">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).</li><li>Bailey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCLK1+marks+a+morphologically+distinct+subpopulation+of+cells+with+stem+cell+properties+in+preinvasive+pancreatic+cancer.">DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).</li><li>Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44++CD24(-)+prostate+cells+are+early+cancer+progenitor/stem+cells+that+provide+a+model+for+patients+with+poor+prognosis.">CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis.</a> British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD90++cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer.">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li><li>Schulenburg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+basic+science+and+in+translational+oncology:+can+we+translate+into+clinical+application.">Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application.</a> Journal of Hematology &amp; Oncolcology. 8, 16 (2015).</li><li>Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+Antigen-1+Enriches+for+a+Cancer+Stem+Cell-Like+Subpopulation+in+Mouse+Gastric+Cancer.">Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer.</a> Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+identification+and+sorting+using+the+Hoechst+33342+side+population+(SP).">Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP).</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).</li><li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABC+Transporters+in+Cancer+Stem+Cells:+Beyond+Chemoresistance.">ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).</li><li>Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumitremorgin+C+reverses+multidrug+resistance+in+cells+transfected+with+the+breast+cancer+resistance+protein.">Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein.</a> Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).</li><li>Takara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+calcium+antagonists+on+ABCG2/BCRP-mediated+drug+resistance+and+transport+in+SN-38-resistant+HeLa+cells.">Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells.</a> Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).</li><li>Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+specific+and+general+inhibitors+of+the+three+major+human+ATP-binding+cassette+transporters+P-gp,+BCRP+and+MRP2+among+registered+drugs.">Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs.</a> Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).</li><li>Challen, G. A., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+side+order+of+stem+cells:+the+SP+phenotype.">A side order of stem cells: the SP phenotype.</a> Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).</li><li>Wu, C., Alman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+in+human+cancers.">Side population cells in human cancers.</a> Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).</li><li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+is+enriched+in+tumorigenic,+stem-like+cancer+cells,+whereas+ABCG2++and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic.">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+Colivelin+treatment+ameliorates+memory+impairment+related+to+Alzheimer's+disease.">Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).</li><li>Marotta, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK2/STAT3+signaling+pathway+is+required+for+growth+of+CD44(+)CD24(-)+stem+cell-like+breast+cancer+cells+in+human+tumors.">The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).</li><li>Zhang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Lead+to+Drug+Candidate:+Optimization+of+3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine+Derivatives+as+Agents+for+the+Treatment+of+Triple+Negative+Breast+Cancer.">From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer.</a> Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).</li><li>Tam, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+alpha+is+a+central+signaling+node+and+therapeutic+target+for+breast+cancer+stem+cells.">Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).</li><li>Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analyses+as+a+critical+parameter+in+defining+the+side+population+(SP)+phenotype.">Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype.</a> Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).</li><li>Petriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+the+side+population+(SP).">Flow cytometry of the side population (SP).</a> Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).</li><li>Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells+exhibits+cancer+stem+cell-like+properties+without+higher+bone-metastatic+potential.">Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.</a> Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).</li><li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM3+mediates+inflammatory+signaling+to+promote+cancer+cell+stemness.">ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness.</a> Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).</li><li>Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baicalein+Suppresses+Stem+Cell-Like+Characteristics+in+Radio-+and+Chemoresistant+MDA-MB-231+Human+Breast+Cancer+Cells+through+Up-Regulation+of+IFIT2.">Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2.</a> Nutrients. 11 (3), 624 (2019).</li><li>Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapped+doxorubicin+nanoparticles+for+the+treatment+of+metastatic+anoikis-resistant+cancer+cells.">Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells.</a> Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).</li><li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells.">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+for+lung+cancer+risk+of+PM2.5+:+Induction+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+properties+in+human+non-small+cell+lung+cancer+cells.">The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).</li><li>Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Modeling+of+ABCG2+Transporter+Heterogeneity:+A+Quantitative,+Single-Cell+Analysis+of+the+Side+Population+Assay.">Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay.</a> PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+inhibitor+of+angiogenesis+inversely+correlates+with+side+population+phenotype+and+function+in+human+lung+cancer+cells.">An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells.</a> Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).</li><li>Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAIL-expressing+mesenchymal+stem+cells+kill+the+putative+cancer+stem+cell+population.">TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population.</a> British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).</li><li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties.">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+"side+population"+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+minor+groove-binding+ligands:+a+different+class+of+mammalian+DNA+topoisomerase+I+inhibitors.">DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).</li></ol>

Det er flere viktige punkter å huske på for SP-analysen. Den første er valget av en riktig blokkering, for eksempel Verapamil eller Reserpine, for hver cellelinje, fordi "gate" -plasseringen av SP-cellene bestemmes i henhold til posisjonen der et stort antall SP-celler forsvinner etter tilsetning av blokkeringen. For MDA-MB-231-cellelinjen fungerer Reserpine bra. For andre cellelinjer kan imidlertid forskjellige blokkeringer fungere bedre.
Den andre er konsentrasjonen av Hoechst 33342. Ande...

Kreft stamceller (CSC) er undergrupper av celler med selvfornyelse evne og flere differensiering potensial, som spiller en viktig rolle i tumor vekst, metastase, og tilbakefall1,2. For tiden har CSC blitt identifisert til å eksistere i en rekke ondartede svulster, inkludert lunge,hjerne, bukspyttkjertel, prostata, bryst- og leverkreft3,4,5,6,7,8,9. Identifisering av CSCer i disse svulstene er hovedsakelig basert på tilstedeværelsen av overflatemarkørproteiner, for eksempel høyt og / eller lavt uttrykk for CD44, CD24, CD133 og Sca-19,10, men en unik markør som kan skille CSC-er fra ikke-CSC-er er ikke rapportert så langt. For tiden brukes flere teknikker til å identifisere og rense CSC-er i tumorvev eller tumorcellelinjer. Disse teknikkene er utformet basert på de spesifikke egenskapene til CSC-er. Blant dem er analyser og sortering av sidepopulasjonsceller (SP) to av de ofte brukte metodene.
SP-celler ble opprinnelig oppdaget av Goodell et al.11, da de karakteriserte hematopoietiske stamceller i musebenmargsceller. Da musebenmargscellene ble merket med det fluorescerende fargestoffet Hoechst 33342, oppstod en liten gruppe Hoechst 33342 svakt fargede celler i den todimensjonale prikkplottet av en strømningscytometrianalyse. Hoechst 33342 er et DNA-bindende fargestoff og har minst to bindingsmoduser som fører til forskjellige spektrale egenskaper. Når du ser på fluorescensutslipp ved to bølgelengder samtidig, kan flere populasjoner avsløres12. I analysen var Hoechst 33342 spent på 350 nm og fluorescensen ble målt ved hjelp av 450/20 nm båndpass (BP) filter og 675 nm kantfilter langpass (EFLP)11. Sammenlignet med hele populasjonen av benmargsceller, ble denne gruppen av celler beriket med hematopoietiske stamceller kalt SP-celler11. SP-celler er i stand til raskt å utvise Hoechst 33342. Effluksen av dette fargestoffet er relatert til ATP-bindende kassett (ABC) transportører13, som kan hemmes av noen midler som Fumitremorgin C14, Verapamil og Reserpine15,16. Deretter ble forskjellige proporsjoner av SP-celler oppdaget i en rekke vev, organer, tumorvev og tumorcellelinjer17,18,19. Disse SP-cellene har mange egenskaper vedstamceller 17,19.
Dette manuskriptet beskriver Hoechst 33342 merking og farging av dyrkede tumorceller og analyse av SP-celler ved strømningscytometri. Videre vises optimalisering av Hoechst 33342-konsentrasjonen og riktig blokkeringsvalg for en bestemt tumorcellelinje ved hjelp av denne tilnærmingen. Til slutt er effekten av stemnessfremming eller hemmingssignaler på andelen SP i tumorceller demonstrert. De eksperimentelle eksemplene viser at analyse av SP kan brukes til å utforske effekten av ulike signaler, for eksempel genuttrykk, små hemmere, aktivatorer, cytokiner og kjemokiner, på tumorstamme. Sammenlignet med andre metoder for isolering og rensing av CSC-er, for eksempel sortering av CD44+/ CD24- befolkning, aldehyd dehydrogenase (ALDH) analyse og tumorsfæredannelsesanalyser, er denne metoden lettere for manipulering og er kostnadseffektiv.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3516</td>
			<td>9.5 cm2 (approx.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colivelin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-P1061A</td>
			<td>Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries (BIOIND)</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSDiva</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352054</td>
			<td>12 x 75 mm, 5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td>(3&#946;, 16&#946;, 17&#945;, 18&#946;, 20&#945;)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKLB816</td>
			<td>Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td>5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of side population in solid tumor cell lines

Kreft stamceller (CSC) er en viktig årsak til tumorvekst, metastase og tilbakefall. Isolasjon og identifisering av CSC-er har stor betydning for tumorforskning. For tiden brukes flere teknikker for identifisering og rensing av CSC fra tumorvev og tumorcellelinjer. Separasjon og analyse av sidepopulasjonsceller (SP) er to av de ofte brukte metodene. Metodene er avhengige av CSCCs evne til raskt å utvise fluorescerende fargestoffer, for eksempel Hoechst 33342. Effluksen av fargestoffet er forbundet med ATP-bindende kassett (ABC) transportører og kan hemmes av ABC-transportørhemmere. Metoder for farging av dyrkede tumorceller med Hoechst 33342 og analyse av andelen sp-celler ved strømningscytometri er beskrevet. Denne analysen er praktisk, rask og kostnadseffektiv. Data generert i denne analysen kan bidra til en bedre forståelse av effekten av gener eller andre ekstracellulære og intracellulære signaler på stamcellenes stammeegenskaper.

Fire eksperimentelle SP-analyser ble utført i henhold til denne metoden. I den første oppdaget vi andelen SP-celler i MDA-MB-231, som er en trippel negativ cellelinje for brystkreft, under normale forhold. Etter celletelling ble Hoechst 33342 tilsatt i ett rør som inneholder 1 x 106 celler til en endelig konsentrasjon på 3 μg / ml. Reserpin og Hoechst 33342 ble lagt til et annet rør til endelige konsentrasjoner på henholdsvis 40 μM og 3 μg/ml. PI ble lagt til begge rørene. Prikkplottet for FSC-A (X-a...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines at JoVE.com

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

En praktisk, rask og kostnadseffektiv metode for å måle andelen sidepopulasjonsceller i faste tumorcellelinjer presenteres.

Analyse av sidepopulasjon i faste tumorcellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Analyse av sidepopulasjonsceller er en av de ofte brukte metodene for å isolere og identifisere kreftstammeceller fra tumorvev og tumorcellelinjer. Denne analysen er praktisk, rask og kostnadseffektiv. Denne metoden kan bidra til en bedre forståelse av effekten av gener eller andre ekstracellulære og intracellulære signaler på stamcellers stammeegenskaper.Mange faktorer kan påvirke prosentandelen SP-celler i denne analysen, så det er viktig å utforske de riktige forholdene før det formelle eksperimentet. Frøsvulstceller i en seksbrønnsplate, og inkuber dem i en 37-graders Celsius inkubator levert med 5% karbondioksid. Når celletettheten når ca 90%aspirerer kulturmediet, og vask cellene to ganger med tre milliliter PBS.Deretter legger du til 500 mikroliter på 0,25% trypsin-EDTA til hver brønn, og inkuberer platen ved 37 grader Celsius i ett til tre minutter. Trykk forsiktig på platen for å løsne cellene, legg til tre milliliter PBS supplert med 2% FBS til hver brønn, og pipette cellene opp og ned tre til fem ganger for å spre celleklumper. Undersøk cellefjæringen under mikroskopet.Hvis celleklumper er til stede, send suspensjonen gjennom en 70-mikrometer sil. Overfør cellene til et 15 milliliter sentrifugerør, og sentrifuger dem på 200 ganger g i fem minutter. Fjern supernatanten, og resuspend cellene i tre milliliter PBS supplert med 2% FBS, pipetter cellene opp og ned tre til fem ganger for å blande.Tell celler under mikroskopet ved hjelp av et hemocytometer, og fortynn dem i PBS supplert med 2% FPS til en endelig konsentrasjon på en gang 10 til de seks cellene per milliliter. Forbered to fem milliliter, polystyren, rundbunns reagensrør, og legg til en milliliter av cellefjæringen til hvert rør. Merk det ene røret som et reagensrør og det andre som et blokkeringskontrollrør.Forbered en løsning av blokkering ved å fortynne den til riktig konsentrasjon. Legg det til blokkeringskontrollrøret og bland godt, og inkuber deretter røret ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Rist røret hvert 10.Forbered en løsning av Hoechst 33342 ved å fortynne den til riktig konsentrasjon. Legg det til reagensrøret og blokkeringskontrollrøret separat og bland godt, og inkuber deretter rørene ved 37 grader Celsius i 60 minutter. Rist rørene hvert 10.Etter inkubasjonen, sentrifuger cellene i fem minutter ved 200 ganger g og fire grader Celsius, og aspirer deretter forsiktig supernatanten. Resuspend cellene i hvert rør med en milliliter iskald PBS supplert med 2% FBS, deretter pipette cellene opp og ned for å blande. Tilsett en mikroliter med en milligram per milliliter propidiumjodid, eller PI, til hvert rør og bland.Klikk kategorien Parametere i flytcytometerprogramvaren. Velg først parametrene for henholdsvis FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red og PI. Deretter velger du den logaritmiske skalaen for PI-parameteren.Til slutt velger du område- og breddeskalaer for parameterne FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red og PI. Kjør cellene fra reagensrøret først, og kjør deretter cellene fra blokkeringskontrollrøret ved hjelp av de samme spenningene og portene. Samle inn 20 til 100 000 hendelser fra hvert utvalg for å analysere prosentandelen SP-celler.Denne metoden ble brukt til å oppdage andelen SP-celler i cellelinjen MDA-MB-231 human brystkreft. Prikkplottet av FSC-A versus PI-A viste en populasjon av døde celler, celleavfall og hovedpopulasjonen av PI-negative celler, som ble utsatt for videre analyse. En enkeltcellet populasjon inngjerdet fra prikkplottet til FSC-A versus FSC-W og prikkplottet til SSC-A versus SSC-W ble brukt til å analysere andelen SP-celler, som var omtrent 0,9% i ubehandlede celler og ca. 0,09% i celler behandlet med reserpin.Ulike fargekonsentrasjoner av Hoechst 33342 ble testet på MDA-MB-435 celler, og det ble fastslått at to mikrogram per milliliter var optimal for SP-analyse. Lave konsentrasjoner gjorde det vanskelig å skille SP-celler fra andre populasjoner, mens høye konsentrasjoner førte til at SP-celler forsvant. Verapamil og reserpin ble testet for å bestemme riktig blokkering for MDA-MB-435-cellene.Omtrent 0,4% av cellene utviste fargestoffet etter verapamil behandling, men forholdet falt til ca 0,1% etter reserpin behandling, noe som viser at reserpin er en mer passende blokkering for denne cellelinjen. Denne protokollen ble også brukt til å bestemme andelen SP-celler i A549 humane lungeadenokarsinomceller behandlet med STAT3-aktivator colivelin og i T47D humane brystkreftceller behandlet med FRA1-hemmer SKLB816. Denne analysen gir ledetråder til den regulatoriske effekten av signalveier på egenskapene til kreftstammeceller og letter oppdagelsen av nye mekanismer, som til slutt kan lede målrettet terapi av svulster.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Harnessing DNA Dye-utløst Side Population Fenotype for å oppdage og rense kreft stamceller fra biologiske prøver

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Betinget Knockdown av genuttrykk i kreftcelle linjer å studere rekruttering av monocytter/makrofager til Tumor Microenvironment

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Enkel og rask metode å få høy kvalitet svulst DNA fra klinisk-patologisk prøver bruker Touch forlaget cytologi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase kjedereaksjon analysen for den genetisk variasjonen i en sporadisk familiær adenomatøse polypose pasient i Chip-i-en-t-format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering av magekreft pasient-avledet Xenograft modeller og primær celle Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radiosensitivity av kreft stamceller i lungekreft cellelinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering av celledød ved hjelp av cellefri supernatant av probiotika i tredimensjonale sfæroidkulturer av kolorektale kreftceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modellering av primære beintumorer og benmetastase med implantasjon av solid tumortransplantat i bein

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Sirkulerende tumorcellelinjer: et innovativt verktøy for grunnleggende og translasjonell forskning

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...