Name: analysis of side population in solid tumor cell lines
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00
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Este trabalho foi financiado pela Fundação de Ciências Naturais da China 81572599, 81773124 e 81972787; Fundação de Ciência Natural da Cidade de Tianjin (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fundos de Pesquisa Fundamentais para as Universidades Centrais, 63191153 da Universidade de Nankai.

1. Preparação celular
<ol><li>Digestão celular e neutralização<ol>
<li>Células tumorais de sementes (como células MDA-MB-231) em uma placa de 6 poços, e cultivadas em uma incubadora de 37 °C fornecida com 5% de CO2.</li>
		<li>Células de colheita quando sua densidade atinge cerca de 90%. Aspire bem o meio de cultura e lave as células 2x com 3 mL de soro fisco tamponado (PBS). NOTA: Para examinar os efeitos dos inibidores da via de sinalização (por exemplo, inibidor FRA1) ou ativadores FRA1 (p...

<ol>
	<li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+cancer,+and+cancer+stem+cells.">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population.">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133/CD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component.">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).</li><li>Bailey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCLK1+marks+a+morphologically+distinct+subpopulation+of+cells+with+stem+cell+properties+in+preinvasive+pancreatic+cancer.">DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).</li><li>Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44++CD24(-)+prostate+cells+are+early+cancer+progenitor/stem+cells+that+provide+a+model+for+patients+with+poor+prognosis.">CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis.</a> British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD90++cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer.">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li><li>Schulenburg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+basic+science+and+in+translational+oncology:+can+we+translate+into+clinical+application.">Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application.</a> Journal of Hematology &amp; Oncolcology. 8, 16 (2015).</li><li>Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+Antigen-1+Enriches+for+a+Cancer+Stem+Cell-Like+Subpopulation+in+Mouse+Gastric+Cancer.">Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer.</a> Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+identification+and+sorting+using+the+Hoechst+33342+side+population+(SP).">Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP).</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).</li><li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABC+Transporters+in+Cancer+Stem+Cells:+Beyond+Chemoresistance.">ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).</li><li>Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumitremorgin+C+reverses+multidrug+resistance+in+cells+transfected+with+the+breast+cancer+resistance+protein.">Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein.</a> Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).</li><li>Takara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+calcium+antagonists+on+ABCG2/BCRP-mediated+drug+resistance+and+transport+in+SN-38-resistant+HeLa+cells.">Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells.</a> Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).</li><li>Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+specific+and+general+inhibitors+of+the+three+major+human+ATP-binding+cassette+transporters+P-gp,+BCRP+and+MRP2+among+registered+drugs.">Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs.</a> Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).</li><li>Challen, G. A., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+side+order+of+stem+cells:+the+SP+phenotype.">A side order of stem cells: the SP phenotype.</a> Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).</li><li>Wu, C., Alman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+in+human+cancers.">Side population cells in human cancers.</a> Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).</li><li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+is+enriched+in+tumorigenic,+stem-like+cancer+cells,+whereas+ABCG2++and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic.">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+Colivelin+treatment+ameliorates+memory+impairment+related+to+Alzheimer's+disease.">Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).</li><li>Marotta, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK2/STAT3+signaling+pathway+is+required+for+growth+of+CD44(+)CD24(-)+stem+cell-like+breast+cancer+cells+in+human+tumors.">The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).</li><li>Zhang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Lead+to+Drug+Candidate:+Optimization+of+3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine+Derivatives+as+Agents+for+the+Treatment+of+Triple+Negative+Breast+Cancer.">From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer.</a> Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).</li><li>Tam, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+alpha+is+a+central+signaling+node+and+therapeutic+target+for+breast+cancer+stem+cells.">Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).</li><li>Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analyses+as+a+critical+parameter+in+defining+the+side+population+(SP)+phenotype.">Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype.</a> Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).</li><li>Petriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+the+side+population+(SP).">Flow cytometry of the side population (SP).</a> Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).</li><li>Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells+exhibits+cancer+stem+cell-like+properties+without+higher+bone-metastatic+potential.">Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.</a> Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).</li><li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM3+mediates+inflammatory+signaling+to+promote+cancer+cell+stemness.">ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness.</a> Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).</li><li>Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baicalein+Suppresses+Stem+Cell-Like+Characteristics+in+Radio-+and+Chemoresistant+MDA-MB-231+Human+Breast+Cancer+Cells+through+Up-Regulation+of+IFIT2.">Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2.</a> Nutrients. 11 (3), 624 (2019).</li><li>Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapped+doxorubicin+nanoparticles+for+the+treatment+of+metastatic+anoikis-resistant+cancer+cells.">Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells.</a> Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).</li><li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells.">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+for+lung+cancer+risk+of+PM2.5+:+Induction+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+properties+in+human+non-small+cell+lung+cancer+cells.">The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).</li><li>Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Modeling+of+ABCG2+Transporter+Heterogeneity:+A+Quantitative,+Single-Cell+Analysis+of+the+Side+Population+Assay.">Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay.</a> PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+inhibitor+of+angiogenesis+inversely+correlates+with+side+population+phenotype+and+function+in+human+lung+cancer+cells.">An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells.</a> Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).</li><li>Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAIL-expressing+mesenchymal+stem+cells+kill+the+putative+cancer+stem+cell+population.">TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population.</a> British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).</li><li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties.">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+"side+population"+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+minor+groove-binding+ligands:+a+different+class+of+mammalian+DNA+topoisomerase+I+inhibitors.">DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).</li></ol>

Existem vários pontos-chave a serem mente para o ensaio de SP. A primeira é a seleção de um bloqueador adequado, como Verapamil ou Reserpine, para cada linha celular, pois a localização do "portão" das células sp é determinada de acordo com a posição em que um grande número de células de SP desaparece após a adição do bloqueador. Para a linha de células MDA-MB-231, a Reserpine funciona bem. No entanto, para outras linhas de celular, diferentes bloqueadores podem funcionar melhor.
<p class="jove_conte...

As células-tronco cancerígenas (CSCs) são subconjuntos de células com capacidade de autoconexão e potencial de diferenciação múltipla, que desempenham um papel vital no crescimento do tumor, metástase e recidiva1,2. Atualmente, os CSCs têm sido identificados para existir em uma variedade de tumores malignos, incluindo câncer de pulmão, cérebro, pâncreas, próstata, mama e fígado3,4,5,6,7,8,9. A identificação de CSCs nesses tumores baseia-se principalmente na presença de proteínas de marcadores superficiais, como alta e/ou baixa expressão de CD44, CD24, CD133 e Sca-19,10, mas um marcador único que pode distinguir CSCs de não-CSCs não foi relatado até agora. Atualmente, várias técnicas são utilizadas para identificar e purificar CSCs em tecido tumoral ou linhas de células tumorais. Essas técnicas são projetadas com base nas propriedades específicas dos CSCs. Entre eles, ensaios e triagem de células da população lateral (SP) são dois dos métodos comumente utilizados.
As células-tronco de SP foram originalmente descobertas por Goodell et al.11, quando caracterizaram células-tronco hematopoiéticas em células de medula óssea do rato. Quando as células de medula óssea do rato foram rotuladas com o corante fluorescente Hoechst 33342, um pequeno grupo de células mal manchadas hoechst 33342 apareceu no gráfico de pontos bidimensionais de um ensaio de citometria de fluxo. Hoechst 33342 é um corante de ligação de DNA e tem pelo menos dois modos de ligação que levam a diferentes características espectrais. Ao visualizar a emissão de fluorescência em dois comprimentos de onda ao mesmo tempo, várias populações podem ser reveladas12. Em seu ensaio, o Hoechst 33342 estava animado a 350 nm e a fluorescência foi medida usando o filtro de banda-pass (BP) de 450/20 nm e o filtro de borda de 675 nm de passagem longa (EFLP)11. Comparado com toda a população de células de medula óssea, esse grupo de células foi enriquecido com células-tronco hematopoiéticas chamadas células-tronco de SP11. As células SP são capazes de expulsar rapidamente Hoechst 33342. O efflux deste corante está relacionado aos transportadores de de ligação ATP (ABC)13, que podem ser inibidos por alguns agentes como Fumitremorgin C14, Verapamil e Reserpine15,16. Depois disso, diferentes proporções de células de SP foram detectadas em uma variedade de tecidos, órgãos, tecidos tumorais e linhas de células tumorais17,18,19. Essas células de SP têm muitas características das células-tronco17,19.
Este manuscrito descreve a rotulagem e coloração de células tumorais cultivadas hoechst 33342 e a análise de células de SP por citometria de fluxo. Além disso, a otimização da concentração de Hoechst 33342 e a seleção adequada do bloqueador para uma linha celular tumoral específica usando esta abordagem são mostradas. Finalmente, os efeitos da promoção da haste ou sinais de inibição na proporção de SP nas células tumorais são demonstrados. Os exemplos experimentais demonstram que a análise de SP pode ser usada para explorar os efeitos de vários sinais, como expressão genética, pequenos inibidores, ativadores, citocinas e quimioterapias, sobre a haste tumoral. Comparado a outros métodos de isolamento e purificação de CSCs, como a classificação de CD44+/CD24– população, análise de aldeído desidrogenase (ALDH) e ensaios de formação da esfera tumoral, este método é mais fácil de manipular e é econômico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3516</td>
			<td>9.5 cm2 (approx.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colivelin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-P1061A</td>
			<td>Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries (BIOIND)</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSDiva</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352054</td>
			<td>12 x 75 mm, 5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td>(3&#946;, 16&#946;, 17&#945;, 18&#946;, 20&#945;)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKLB816</td>
			<td>Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td>5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of side population in solid tumor cell lines

As células-tronco cancerígenas (CSCs) são uma importante causa de crescimento tumoral, metástase e recidiva. O isolamento e identificação dos CSCs são de grande importância para a pesquisa de tumores. Atualmente, diversas técnicas são utilizadas para a identificação e purificação de CSCs a partir de tecidos tumorais e linhas de células tumorais. A separação e análise das células da população lateral (SP) são dois dos métodos comumente utilizados. Os métodos dependem da capacidade dos CSCs de expulsar rapidamente corantes fluorescentes, como hoechst 33342. O efflux do corante está associado aos transportadores de de ligação ATP (ABC) e pode ser inibido pelos inibidores do transporte ABC. Métodos para coloração de células tumorais cultivadas com Hoechst 33342 e análise da proporção de suas células de SP por citometria de fluxo são descritos. Este ensaio é conveniente, rápido e econômico. Os dados gerados neste ensaio podem contribuir para uma melhor compreensão do efeito dos genes ou outros sinais extracelulares e intracelulares nas propriedades de tronco das células tumorais.

Foram realizadas quatro análises experimentais de SP de acordo com esse método. No primeiro, detectamos a proporção de células de SP no MDA-MB-231, que é uma linha tripla negativa de células cancerígenas de mama humana, em condições normais. Após a contagem celular, Hoechst 33342 foi adicionado em um tubo contendo 1 x 106 células a uma concentração final de 3 μg/mL. Reserpine e Hoechst 33342 foram adicionados a outro tubo para concentrações finais de 40 μM e 3 μg/mL, respectivamente. Pi foi ...

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Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Um método conveniente, rápido e econômico para medir a proporção de células da população lateral em linhas de células tumorais sólidas é apresentado.

Análise da população lateral em linhas celulares tumorais sólidas

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A análise de células populacionais laterais é um dos métodos comumente utilizados para isolar e identificar células-tronco cancerígenas de tecidos tumorais e linhas de células tumorais. Este ensaio é conveniente, rápido e econômico. Este método pode contribuir para uma melhor compreensão do efeito de genes ou outros sinais extracelulares e intracelulares sobre as propriedades de tronco das células tumorais.Muitos fatores podem influenciar o percentual de células de SP nesta análise, por isso é fundamental explorar as condições adequadas antes do experimento formal. Células tumorais de sementes em uma placa de seis poços, e incubar-as em uma incubadora Celsius de 37 graus fornecida com 5% de dióxido de carbono. Quando a densidade celular atinge cerca de 90% aspirar o meio de cultura, e lavar as células duas vezes com três mililitros de PBS.Em seguida, adicione 500 microliters de 0,25% trypsin-EDTA a cada poço, e incubar a placa a 37 graus Celsius por um a três minutos. Bata suavemente na placa para desprender as células, adicione três mililitros de PBS suplementados com 2% de FBS em cada poço, e pipete as células para cima e para baixo três a cinco vezes para dispersar os aglomerados celulares. Examine a suspensão da célula sob o microscópio.Se houver aglomerados de células, passe a suspensão através de um filtro de 70 micrômetros. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrifuá-las a 200 vezes g por cinco minutos. Remova o supernasce, e resuspense as células em três mililitros de PBS suplementados com 2%FBS, esbofiando as células para cima e para baixo três a cinco vezes para misturar.Conte células sob o microscópio usando um hemótmetro, e dilui-as em PBS complementadas com 2%FPS para uma concentração final de uma vez 10 para as seis células por mililitro. Prepare dois cinco mililitros, poliestireno, tubos de teste de fundo redondo, e adicione um mililitro da suspensão celular a cada tubo. Rotule um tubo como tubo de ensaio e o outro como um tubo de controle bloqueador.Prepare uma solução de bloqueador diluindo-a à concentração apropriada. Adicione-o ao tubo de controle do bloqueador e misture bem, depois incubar o tubo a 37 graus Celsius por 30 minutos. Agite o tubo a cada 10 minutos.Prepare uma solução de Hoechst 33342 diluindo-a para a concentração apropriada. Adicione-o ao tubo de ensaio e ao tubo de controle bloqueador separadamente e misture bem, em seguida, incubar os tubos a 37 graus Celsius por 60 minutos. Agite os tubos a cada 10 minutos.Após a incubação, centrifugar as células por cinco minutos a 200 vezes g e quatro graus Celsius, em seguida, aspirar cuidadosamente o supernante. Resuspend as células em cada tubo com um mililitro de PBS gelado suplementado com 2%FBS, em seguida, pipeta as células para cima e para baixo para misturar. Adicione um microliter de iodeto de propídio de um mililículo por mililitro, ou PI, a cada tubo e misture.Clique na guia Parâmetros no software do citômetro de fluxo. Primeiro, escolha os parâmetros de FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red e PI, respectivamente. Em segundo lugar, escolha a escala logarítmica para o parâmetro PI.Finalmente, escolha escalas de área e largura para os parâmetros FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red e PI, respectivamente. Execute as células do tubo de ensaio primeiro, em seguida, execute as células do tubo de controle bloqueador usando as mesmas tensões e portões. Coletar de 20 a 100.000 eventos de cada amostra para analisar o percentual de células de SP.Este método foi utilizado para detectar a proporção de células de SP na linha de células cancerígenas de mama humana MDA-MB-231. O gráfico de pontos de FSC-A versus PI-A mostrou uma população de células mortas, detritos celulares e a população principal de células negativas do PI, que foi submetida a análises posteriores. Uma única população celular fechada a partir do gráfico de pontos de FSC-A versus FSC-W e o gráfico de pontos de SSC-A versus SSC-W foi usado para analisar a proporção de células de SP, que foi de cerca de 0,9% em células não tratadas e cerca de 0,09% em células tratadas com reserpina.Diferentes concentrações de coloração de Hoechst 33342 foram testadas em células MDA-MB-435, e foi determinado que dois microgramas por mililitro foram ideais para análise de SP. Baixas concentrações dificultaram a distinção das células de SP de outras populações, enquanto altas concentrações fizeram com que as células de SP desaparecessem. Verapamil e reserpine foram testados para determinar o bloqueador adequado para as células MDA-MB-435.Cerca de 0,4% das células expeliram o corante após o tratamento de verapamil, mas a proporção caiu para cerca de 0,1% após o tratamento de reserpine, demonstrando que a reserpina é um bloqueador mais adequado para esta linha celular. Este protocolo também foi utilizado para determinar a proporção de células de SP em células de adenocarcinoma pulmonar humano A549 tratadas com colivelina ativadora STAT3 e em células cancerígenas de mama humanas T47D tratadas com inibidor FRA1 SKLB816. Este ensaio fornece pistas para o efeito regulatório da sinalização de caminhos sobre as características das células-tronco do câncer e facilita a descoberta de novos mecanismos, que podem, em última análise, orientar a terapia-alvo dos tumores.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Aprovação do DNA Dye-desencadeada fenótipo de população lateral para detectar e purificar células-tronco de câncer de amostras biológicas

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Pesquisa do câncer

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Knockdown condicional de expressão gênica em linhas de células de câncer para estudar o recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do Tumor

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Método simples e rápido para obter alta qualidade Tumor DNA de espécimes clínico-patológica usando toque citologia de impressão

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Estabelecimento de modelos de xenoenxertos derivados de câncer gástrico e linhas celulares primárias

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radiosensibilidade de células-tronco cancerosas em linhas celulares de câncer de pulmão

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Avaliação da morte celular usando supernanato livre de células de probióticos em culturas esferoides tridimensionais de células cancerígenas colorretais

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modelagem de Tumores Ósseos Primários e Metástases Ósseas com Implante de Enxerto Sólido de Tumor em Osso

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Linhas celulares tumorais circulantes: uma ferramenta inovadora para pesquisa fundamental e translacional

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...