Name: analysis of side population in solid tumor cell lines
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines at JoVE.com

Эта работа финансировалась Фондом естественных наук Китая 81572599, 81773124 и 81972787; Фонд естественных наук города Тяньцзинь (Китай) 19JCYBJC27300; Тяньцзиньская народная больница и Грант на совместные исследования Университета Нанькай 2016rmnk005; Фонды фундаментальных исследований для центральных университетов, Нанькайского университета 63191153.

1. Клеточная подготовка
<ol><li>Переваривание и нейтрализация клеток<ol>
<li>Засейте опухолевые клетки (такие как клетки MDA-MB-231) в 6-колодежную пластину и культивированы в инкубаторе с 37 °C, снабженном 5% CO2.</li>
		<li>Собирают клетки, когда их плотность достигает около 90%. Тщательно аспирирова?...

<ol>
	<li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+cancer,+and+cancer+stem+cells.">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population.">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133/CD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component.">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).</li><li>Bailey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCLK1+marks+a+morphologically+distinct+subpopulation+of+cells+with+stem+cell+properties+in+preinvasive+pancreatic+cancer.">DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).</li><li>Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44++CD24(-)+prostate+cells+are+early+cancer+progenitor/stem+cells+that+provide+a+model+for+patients+with+poor+prognosis.">CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis.</a> British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD90++cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer.">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li><li>Schulenburg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+basic+science+and+in+translational+oncology:+can+we+translate+into+clinical+application.">Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application.</a> Journal of Hematology &amp; Oncolcology. 8, 16 (2015).</li><li>Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+Antigen-1+Enriches+for+a+Cancer+Stem+Cell-Like+Subpopulation+in+Mouse+Gastric+Cancer.">Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer.</a> Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+identification+and+sorting+using+the+Hoechst+33342+side+population+(SP).">Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP).</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).</li><li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABC+Transporters+in+Cancer+Stem+Cells:+Beyond+Chemoresistance.">ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).</li><li>Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumitremorgin+C+reverses+multidrug+resistance+in+cells+transfected+with+the+breast+cancer+resistance+protein.">Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein.</a> Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).</li><li>Takara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+calcium+antagonists+on+ABCG2/BCRP-mediated+drug+resistance+and+transport+in+SN-38-resistant+HeLa+cells.">Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells.</a> Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).</li><li>Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+specific+and+general+inhibitors+of+the+three+major+human+ATP-binding+cassette+transporters+P-gp,+BCRP+and+MRP2+among+registered+drugs.">Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs.</a> Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).</li><li>Challen, G. A., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+side+order+of+stem+cells:+the+SP+phenotype.">A side order of stem cells: the SP phenotype.</a> Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).</li><li>Wu, C., Alman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+in+human+cancers.">Side population cells in human cancers.</a> Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).</li><li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+is+enriched+in+tumorigenic,+stem-like+cancer+cells,+whereas+ABCG2++and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic.">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+Colivelin+treatment+ameliorates+memory+impairment+related+to+Alzheimer's+disease.">Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).</li><li>Marotta, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK2/STAT3+signaling+pathway+is+required+for+growth+of+CD44(+)CD24(-)+stem+cell-like+breast+cancer+cells+in+human+tumors.">The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).</li><li>Zhang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Lead+to+Drug+Candidate:+Optimization+of+3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine+Derivatives+as+Agents+for+the+Treatment+of+Triple+Negative+Breast+Cancer.">From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer.</a> Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).</li><li>Tam, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+alpha+is+a+central+signaling+node+and+therapeutic+target+for+breast+cancer+stem+cells.">Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).</li><li>Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analyses+as+a+critical+parameter+in+defining+the+side+population+(SP)+phenotype.">Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype.</a> Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).</li><li>Petriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+the+side+population+(SP).">Flow cytometry of the side population (SP).</a> Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).</li><li>Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells+exhibits+cancer+stem+cell-like+properties+without+higher+bone-metastatic+potential.">Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.</a> Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).</li><li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM3+mediates+inflammatory+signaling+to+promote+cancer+cell+stemness.">ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness.</a> Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).</li><li>Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baicalein+Suppresses+Stem+Cell-Like+Characteristics+in+Radio-+and+Chemoresistant+MDA-MB-231+Human+Breast+Cancer+Cells+through+Up-Regulation+of+IFIT2.">Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2.</a> Nutrients. 11 (3), 624 (2019).</li><li>Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapped+doxorubicin+nanoparticles+for+the+treatment+of+metastatic+anoikis-resistant+cancer+cells.">Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells.</a> Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).</li><li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells.">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+for+lung+cancer+risk+of+PM2.5+:+Induction+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+properties+in+human+non-small+cell+lung+cancer+cells.">The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).</li><li>Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Modeling+of+ABCG2+Transporter+Heterogeneity:+A+Quantitative,+Single-Cell+Analysis+of+the+Side+Population+Assay.">Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay.</a> PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+inhibitor+of+angiogenesis+inversely+correlates+with+side+population+phenotype+and+function+in+human+lung+cancer+cells.">An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells.</a> Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).</li><li>Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAIL-expressing+mesenchymal+stem+cells+kill+the+putative+cancer+stem+cell+population.">TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population.</a> British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).</li><li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties.">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+"side+population"+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+minor+groove-binding+ligands:+a+different+class+of+mammalian+DNA+topoisomerase+I+inhibitors.">DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).</li></ol>

Есть несколько ключевых моментов, которые следует иметь в виду для анализа SP. Во-первых, это выбор правильного блокиратора, такого как Верапамил или Резерпин, для каждой клеточной линии, потому что «затворное» расположение КЛЕТОК SP определяется в соответствии с положением, в котором бо?...

Раковые стволовые клетки (CSC) представляют собой подмножества клеток с способностью к самообновлению и множественным дифференцировыванием, которые играют жизненно важную роль в росте опухоли, метастазировании и рецидиве1,2. В настоящее время было идентифицировано, что CSC существуют при различных злокачественных опухолях, включая рак легких, головного мозга, поджелудочной железы, предстательной железы, молочной железы и печени3,4,5,6,7,8,9. Идентификация CSC в этих опухолях в основном основана на присутствии поверхностных маркерных белков, таких как высокая и / или низкая экспрессия CD44, CD24, CD133 и Sca-19,10,но уникальный маркер, который может отличить CSC от не-CSC, до сих пор не сообщалось. В настоящее время несколько методов используются для выявления и очистки ЦСК в опухолевой ткани или клеточных линиях опухоли. Эти методы разработаны на основе специфических свойств CSC. Среди них анализы и сортировка клеток боковой популяции (SP) являются двумя из широко используемых методов.
SP-клетки были первоначально обнаружены Goodell et al.11,когда они характеризовали гемопоэтические стволовые клетки в клетках костного мозга мыши. Когда клетки костного мозга мыши были помечены флуоресцентным красителем Hoechst 33342, небольшая группа клеток Hoechst 33342 с тусклым окрашиванием появилась на двумерном точечном графике анализа проточной цитометрии. Hoechst 33342 является ДНК-связывающим красителем и имеет, по меньшей мере, два режима связывания, которые приводят к различным спектральным характеристикам. При просмотре флуоресцентного излучения на двух длинах волн одновременно можно выявить несколько популяций12. В их анализе Hoechst 33342 возбуждался при 350 нм, а флуоресценция измерялась с помощью полосового фильтра 450/20 нм (BP) и 675 нм краевого фильтра длинных проходов (EFLP)11. По сравнению со всей популяцией клеток костного мозга, эта группа клеток была обогащена гемопоэтическими стволовыми клетками, называемыми SP-клетками11. КЛЕТКИ SP способны быстро вытеснять Hoechst 33342. Отток этого красителя связан с АТФ-связывающими кассетными (ABC) транспортерами13,которые могут ингибироваться некоторыми агентами, такими как ФумитреморгинС14,Верапамил и Резерпин15,16. После этого различные пропорции SP-клеток были обнаружены в различных тканях, органах, опухолевых тканях и опухолевых клеточных линиях17,18,19. Эти SP-клетки имеют много характеристик стволовых клеток17,19.
Эта рукопись описывает маркировку и окрашивание культивированных опухолевых клеток Hoechst 33342 и анализ SP-клеток методом проточной цитометрии. Кроме того, показана оптимизация концентрации Hoechst 33342 и правильный выбор блокатора для конкретной линии опухолевых клеток с использованием этого подхода. Наконец, продемонстрировано влияние сигналов продвижения или ингибирования стволовойсти на долю SP в опухолевых клетках. Экспериментальные примеры демонстрируют, что анализ SP может быть использован для изучения влияния различных сигналов, таких как экспрессия генов, небольшие ингибиторы, активаторы, цитокины и хемокины, на стволовую опухоль. По сравнению с другими методами выделения и очистки ЦСК, такими как сортировка CD44+/ CD24- популяция, анализ альдегиддегидрогеназы (ALDH) и анализы образования опухолевой сферы, этот метод проще для манипуляций и является экономически эффективным.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3516</td>
			<td>9.5 cm2 (approx.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colivelin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-P1061A</td>
			<td>Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries (BIOIND)</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSDiva</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352054</td>
			<td>12 x 75 mm, 5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td>(3&#946;, 16&#946;, 17&#945;, 18&#946;, 20&#945;)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKLB816</td>
			<td>Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td>5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of side population in solid tumor cell lines

Раковые стволовые клетки (CSC) являются важной причиной роста опухоли, метастазирования и рецидива. Выделение и идентификация ЦСК имеют большое значение для исследования опухолей. В настоящее время для идентификации и очистки ЦСК из опухолевых тканей и опухолевых клеточных линий используется несколько методик. Разделение и анализ клеток боковой популяции (SP) являются двумя из широко используемых методов. Методы основаны на способности CSC быстро вытеснять флуоресцентные красители, такие как Hoechst 33342. Отток красителя связан с транспортерами АТФ-связывающей кассеты (ABC) и может ингибироваться ингибиторами транспортера ABC. Описаны методы окрашивания культивируемых опухолевых клеток Hoechst 33342 и анализа доли их SP-клеток методом проточной цитометрии. Этот анализ удобен, быстр и экономичен. Данные, полученные в этом анализе, могут способствовать лучшему пониманию влияния генов или других внеклеточных и внутриклеточных сигналов на свойства стволов опухолевых клеток.

По этому методу были проведены четыре экспериментальных анализа СП. В первом мы обнаружили долю SP-клеток в MDA-MB-231, который является тройной отрицательной клеточной линией рака молочной железы человека, в нормальных условиях. После подсчета клеток Hoechst 33342 добавляли в одну трубку, содерж?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines at JoVE.com

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Представлен удобный, быстрый и экономичный метод измерения доли побочных популяционных клеток в сплошных опухолевых клеточных линиях.

Анализ боковой популяции в линиях солидных опухолевых клеток

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Анализ боковых популяций клеток является одним из широко используемых методов выделения и идентификации раковых стволовых клеток из опухолевых тканей и линий опухолевых клеток. Этот анализ удобен, быстр и экономичен. Этот метод может способствовать лучшему пониманию влияния генов или других внеклеточных и внутриклеточных сигналов на свойства стволовых клеток опухолевых клеток.Многие факторы могут влиять на процент SP-клеток в этом анализе, поэтому очень важно изучить надлежащие условия до формального эксперимента. Засевают опухолевые клетки в шестиямяцную пластину и инкубируют их в инкубаторе с 37 градусами Цельсия, снабженном 5% углекислым газом. Когда плотность клеток достигнет около 90%, аспирируют культурную среду и дважды промывают клетки тремя миллилитрами PBS.Затем добавьте 500 микролитров 0,25% трипсина-ЭДТА в каждую лунку и инкубируем пластину при 37 градусах Цельсия в течение одной-трех минут. Осторожно постучите по пластине, чтобы отсоединить клетки, добавьте три миллилитра PBS, дополненных 2% FBS, в каждую лунку, и пипеткой клетки вверх и вниз три-пять раз, чтобы рассеять сгустки клеток. Исследуйте клеточную суспензию под микроскопом.Если клеточные сгустки присутствуют, пропустите суспензию через 70-микрометровый сетчатый фильтр. Переложите ячейки в 15-миллилитровую центрифужную трубку и центрифугируют их в 200 раз в г в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно суспендировать клетки в трех миллилитрах PBS, дополненных 2% FBS, пипетируя клетки вверх и вниз три-пять раз для смешивания.Подсчитайте клетки под микроскопом с помощью гемоцитометра и разбавьте их в PBS, дополненном 2% FPS, до конечной концентрации в один раз 10 до шести клеток на миллилитр. Подготовьте две пятимиллилитровую, полистирольные, круглодонные пробирки и добавьте по одному миллилитру клеточной суспензии в каждую пробирку. Пометьте одну трубку как пробирку, а другую как блокируруюруюрую управляя трубку.Готовят раствор блокатора, разбавляя его до соответствующей концентрации. Добавьте его в блокатор контрольной трубки и хорошо перемешайте, затем инкубируйте трубку при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут. Встряхивая тюбик каждые 10 минут.Готовят раствор Hoechst 33342, разбавляя его до соответствующей концентрации. Добавьте его в пробирку и блокатор контрольной трубки отдельно и хорошо перемешайте, затем инкубируйте пробирки при 37 градусах Цельсия в течение 60 минут. Встряхивая тубы каждые 10 минут.После инкубации центрифугируют клетки в течение пяти минут при 200 раз г и четырех градусах Цельсия, затем осторожно аспирируют супернатант. Повторно суспендировать клетки в каждой трубке одним миллилитром ледяного PBS, дополненного 2% FBS, затем пипеткой клетки вверх и вниз для смешивания. Добавьте один микролитр одного миллиграмма на миллилитр йодида пропидия, или PI, в каждую трубку и перемешайте.Перейдите на вкладку Параметры в программном обеспечении проточного цитометра. Сначала выберите параметры FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red и PI соответственно. Во-вторых, выберите логарифмическую шкалу для параметра PI.Наконец, выберите шкалы площади и ширины для параметров FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red и PI соответственно. Сначала запустите ячейки из пробирки, затем запустите ячейки из блокаторной контрольной трубки, используя те же напряжения и затворы. Соберите от 20 до 100 000 событий из каждого образца, чтобы проанализировать процент SP-клеток.Этот метод был использован для определения доли SP-клеток в клеточной линии рака молочной железы человека MDA-MB-231. Точечный график FSC-A против PI-A показал популяцию мертвых клеток, клеточного мусора и основную популяцию PI-отрицательных клеток, которая была подвергнута дальнейшему анализу. Для анализа доли клеток, обработанных резерпином, была использована популяция одной клетки, выделенной из точечного графика FSC-A против FSC-W и точечного графика SSC-A против SSC-W, которая составляла около 0,9% в необработанных клетках и около 0,09% в клетках, обработанных резерпином.Различные концентрации окрашивания Hoechst 33342 были протестированы на клетках MDA-MB-435, и было определено, что два микрограмма на миллилитр были оптимальными для анализа SP. Низкие концентрации затрудняли различие SP-клеток от других популяций, в то время как высокие концентрации вызывали исчезновение SP-клеток. Верапамил и резерпин были протестированы для определения правильного блокатора для клеток MDA-MB-435.Около 0,4% клеток изгоняли краситель после лечения верапамилом, но соотношение снизилось примерно до 0,1% после лечения резерпином, демонстрируя, что резерпин является более подходящим блокатором для этой клеточной линии. Этот протокол также использовался для определения доли SP-клеток в клетках аденокарциномы легкого A549 человека, обработанных активатором STAT3 коливелином, и в клетках рака молочной железы человека T47D, обработанных ингибитором FRA1 SKLB816. Этот анализ дает ключ к регуляторным эффектам сигнальных путей на особенности раковых стволовых клеток и облегчает открытие новых механизмов, которые в конечном итоге могут направлять таргетную терапию опухолей.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Использование фенотипированного бокового популяционного фенотипа ДНК для обнаружения и очистки раковых стволовых клеток от биологических образцов

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Условное нокдаун экспрессии генов в рак клеточных линий для изучения набора моноцитов/макрофагов в микроокружения опухоли

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Простой и быстрый метод для получения высокого качества опухоли ДНК от клинических патологических образцов с помощью касания отпечаток цитологии

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Assay цифровой полимеразной цепной реакции для генетической вариации в спорадических семейное аденоматозное Polyposis пациента, используя формат чип в трубе

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Создание желудка рака пациента полученных Ксенотрансплантат Модели и первичные линии клеток

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Радиочувствительность стволовых клеток рака в линиях клеток рака легких

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Оценка гибели клеток с использованием бесклеточного супернатанта пробиотиков в трехмерных сфероидных культурах колоректальных раковых клеток

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Моделирование первичных опухолей костей и метастазов в кости с имплантацией солидного опухолевого трансплантата в кость

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Циркулирующие линии опухолевых клеток: инновационный инструмент для фундаментальных и трансляционных исследований

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...