Name: analysis of side population in solid tumor cell lines
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines at JoVE.com

Detta arbete finansierades av Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 och 81972787; Naturvetenskapliga stiftelsen i Tianjin City (Kina) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Grundforskningsfonder för de centrala universiteten, Nankai University 63191153.

1. Cellberedning
<ol><li>Cellsammanfattning och neutralisering<ol>
<li>Frötumörceller (såsom MDA-MB-231 celler) i en 6 brunnsplatta och odla dem i en 37 °C inkubator levereras med 5% CO2.</li>
		<li>Skörda celler när deras densitet når ca 90%. Aspirera odlingsmediet noggrant och tvätta cellerna 2x med 3 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). OBS: För att undersöka effekterna av signalvägshämmare (t.ex. FRA1-hämmare) eller aktivatorer (t.ex. STAT3-aktivator) på tumörcellernas stamegenskaper s?...

<ol>
	<li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+cancer,+and+cancer+stem+cells.">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population.">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133/CD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component.">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).</li><li>Bailey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCLK1+marks+a+morphologically+distinct+subpopulation+of+cells+with+stem+cell+properties+in+preinvasive+pancreatic+cancer.">DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).</li><li>Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44++CD24(-)+prostate+cells+are+early+cancer+progenitor/stem+cells+that+provide+a+model+for+patients+with+poor+prognosis.">CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis.</a> British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD90++cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer.">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li><li>Schulenburg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+basic+science+and+in+translational+oncology:+can+we+translate+into+clinical+application.">Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application.</a> Journal of Hematology &amp; Oncolcology. 8, 16 (2015).</li><li>Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+Antigen-1+Enriches+for+a+Cancer+Stem+Cell-Like+Subpopulation+in+Mouse+Gastric+Cancer.">Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer.</a> Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+identification+and+sorting+using+the+Hoechst+33342+side+population+(SP).">Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP).</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).</li><li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABC+Transporters+in+Cancer+Stem+Cells:+Beyond+Chemoresistance.">ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).</li><li>Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumitremorgin+C+reverses+multidrug+resistance+in+cells+transfected+with+the+breast+cancer+resistance+protein.">Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein.</a> Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).</li><li>Takara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+calcium+antagonists+on+ABCG2/BCRP-mediated+drug+resistance+and+transport+in+SN-38-resistant+HeLa+cells.">Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells.</a> Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).</li><li>Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+specific+and+general+inhibitors+of+the+three+major+human+ATP-binding+cassette+transporters+P-gp,+BCRP+and+MRP2+among+registered+drugs.">Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs.</a> Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).</li><li>Challen, G. A., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+side+order+of+stem+cells:+the+SP+phenotype.">A side order of stem cells: the SP phenotype.</a> Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).</li><li>Wu, C., Alman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+in+human+cancers.">Side population cells in human cancers.</a> Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).</li><li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+is+enriched+in+tumorigenic,+stem-like+cancer+cells,+whereas+ABCG2++and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic.">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+Colivelin+treatment+ameliorates+memory+impairment+related+to+Alzheimer's+disease.">Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).</li><li>Marotta, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK2/STAT3+signaling+pathway+is+required+for+growth+of+CD44(+)CD24(-)+stem+cell-like+breast+cancer+cells+in+human+tumors.">The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).</li><li>Zhang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Lead+to+Drug+Candidate:+Optimization+of+3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine+Derivatives+as+Agents+for+the+Treatment+of+Triple+Negative+Breast+Cancer.">From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer.</a> Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).</li><li>Tam, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+alpha+is+a+central+signaling+node+and+therapeutic+target+for+breast+cancer+stem+cells.">Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).</li><li>Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analyses+as+a+critical+parameter+in+defining+the+side+population+(SP)+phenotype.">Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype.</a> Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).</li><li>Petriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+the+side+population+(SP).">Flow cytometry of the side population (SP).</a> Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).</li><li>Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells+exhibits+cancer+stem+cell-like+properties+without+higher+bone-metastatic+potential.">Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.</a> Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).</li><li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM3+mediates+inflammatory+signaling+to+promote+cancer+cell+stemness.">ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness.</a> Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).</li><li>Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baicalein+Suppresses+Stem+Cell-Like+Characteristics+in+Radio-+and+Chemoresistant+MDA-MB-231+Human+Breast+Cancer+Cells+through+Up-Regulation+of+IFIT2.">Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2.</a> Nutrients. 11 (3), 624 (2019).</li><li>Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapped+doxorubicin+nanoparticles+for+the+treatment+of+metastatic+anoikis-resistant+cancer+cells.">Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells.</a> Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).</li><li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells.">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+for+lung+cancer+risk+of+PM2.5+:+Induction+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+properties+in+human+non-small+cell+lung+cancer+cells.">The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).</li><li>Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Modeling+of+ABCG2+Transporter+Heterogeneity:+A+Quantitative,+Single-Cell+Analysis+of+the+Side+Population+Assay.">Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay.</a> PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+inhibitor+of+angiogenesis+inversely+correlates+with+side+population+phenotype+and+function+in+human+lung+cancer+cells.">An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells.</a> Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).</li><li>Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAIL-expressing+mesenchymal+stem+cells+kill+the+putative+cancer+stem+cell+population.">TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population.</a> British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).</li><li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties.">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+"side+population"+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+minor+groove-binding+ligands:+a+different+class+of+mammalian+DNA+topoisomerase+I+inhibitors.">DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).</li></ol>

Det finns flera viktiga punkter att tänka på för SP-analysen. Den första är valet av en riktig blockerare, till exempel Verapamil eller Reserpine, för varje cellinje, eftersom SP-cellernas "gate" -plats bestäms enligt den position där ett stort antal SP-celler försvinner efter tillsats av blockeraren. För MDA-MB-231-cellinjen fungerar Reserpine bra. Men för andra cellinjer kan olika blockerare fungera bättre.
Den andra är koncentrationen av Hoechst 33342. Andelen SP-celler ökade ...

Cancerstamceller (CSCs) är delmängder av celler med självförnyelseförmåga och multipla differentieringspotential, som spelar en viktig roll i tumörtillväxt, metastasering och återkommande1,2. För närvarande har CSCs identifierats för att existera i en mängd maligna tumörer, inklusive lunga, hjärna, bukspottkörtel, prostata, bröstochlevercancer3,4,5,6,7,8,9. Identifiering av CSCs i dessa tumörer är huvudsakligen baserat på förekomsten av ytmarkörproteiner, såsom högt och/ eller lågt uttryck av CD44, CD24, CD133 och Sca-19,10, men en unik markör som kan skilja CSCs från icke-CSCs har hittills inte rapporterats. För närvarande används flera tekniker för att identifiera och rena CSCs i tumörvävnad eller tumör cellinjer. Dessa tekniker är utformade baserat på CSC:s specifika egenskaper. Bland dem är analyser och sortering av sidopopulationsceller (SP) två av de vanliga metoderna.
SP-celler upptäcktes ursprungligen av Goodell et al.11, när de karakteriserade hematopoetiska stamceller i musbenmärgsceller. När mus benmärg celler var märkta med fluorescerande färgämne Hoechst 33342, en liten grupp av Hoechst 33342 svagt färgade celler uppträdde i den tvådimensionella pricken plot av ett flöde cytometri analys. Hoechst 33342 är ett DNA-bindande färgämne och har minst två bindningslägen som leder till olika spektralegenskaper. När man tittar på fluorescensutsläpp vid två våglängder samtidigt kan flera populationer avslöjas12. I sin analys var Hoechst 33342 upphetsad på 350 nm och fluorescensen mättes med hjälp av filtret 450/20 nm bandpass (BP) och 675 nm kantfilter långpass (EFLP)11. Jämfört med hela populationen av benmärgsceller berikades denna grupp av celler med hematopoetiska stamceller som kallas SP-celler11. SP-celler kan snabbt utvisa Hoechst 33342. Utflödet av detta färgämne är relaterat till ATP-bindande kassett (ABC) transportörer13, som kan hämmas av vissa medel som Fumitremorgin C14,Verapamil och Reserpine15,16. Därefter upptäcktes olika proportioner av SP-celler i en mängd olika vävnader, organ, tumörvävnader och tumörcelllinjer17,18,19. Dessa SP-celler har många egenskaper hos stamceller17,19.
Detta manuskript beskriver Hoechst 33342 märkning och färgning av odlade tumörceller och analys av SP-celler genom flöde cytometri. Dessutom visas optimering av Hoechst 33342 koncentrationen och rätt blockerare urval för en specifik tumör cellinje med hjälp av detta tillvägagångssätt. Slutligen demonstreras effekterna av stamning marknadsföring eller hämning signaler på andelen SP i tumör celler. De experimentella exemplen visar att analys av SP kan användas för att utforska effekterna av olika signaler, såsom genuttryck, små hämmare, aktivatorer, cytokiner och kemokiner, på tumörstamhet. Jämfört med andra metoder för isolering och rening av CSCs, såsom sortering av CD44+/ CD24- population, aldehyd dehydrogenas (ALDH) analys och tumör sfärbildning analyser, är denna metod lättare för manipulation och är kostnadseffektiv.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3516</td>
			<td>9.5 cm2 (approx.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colivelin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-P1061A</td>
			<td>Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries (BIOIND)</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSDiva</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352054</td>
			<td>12 x 75 mm, 5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td>(3&#946;, 16&#946;, 17&#945;, 18&#946;, 20&#945;)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKLB816</td>
			<td>Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td>5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of side population in solid tumor cell lines

Cancerstamceller (CSCs) är en viktig orsak till tumörtillväxt, metastasering och återkommande. Isolering och identifiering av CSCs är av stor betydelse för tumör forskning. För närvarande används flera tekniker för identifiering och rening av CSCs från tumör vävnader och tumör cellinjer. Separation och analys av sidopopulationsceller (SP) är två av de vanliga metoderna. Metoderna förlitar sig på CSC: s förmåga att snabbt utvisa fluorescerande färgämnen, såsom Hoechst 33342. Färgämnets utflöde är förknippat med ATP-bindande kassett (ABC) transportörer och kan hämmas av ABC transportörhämmare. Metoder för färgning odlade tumörceller med Hoechst 33342 och analysera andelen av deras SP celler genom flöde cytometri beskrivs. Denna analys är bekväm, snabb och kostnadseffektiv. Data som genereras i denna analys kan bidra till en bättre förståelse av effekten av gener eller andra extracellulära och intracellulära signaler på tumörcellernas stamegenskaper.

Fyra experimentella SP-analyser utfördes enligt denna metod. I den första upptäckte vi andelen SP-celler i MDA-MB-231, som är en trippelnegativ mänsklig bröstcancer cellinje, under normala förhållanden. Efter cellräkning tillsattes Hoechst 33342 i ett rör som innehöll 1 x 106 celler till en slutlig koncentration på 3 μg/ml. Reserpine och Hoechst 33342 tillsattes i ett annat rör till slutkoncentrationerna 40 μM respektive 3 μg/ml. PI lades till i båda rören. Punktdiagramt för FSC-A (X-axel) j...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines at JoVE.com

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

En bekväm, snabb och kostnadseffektiv metod för att mäta andelen sidopopulationsceller i solida tumör cellinjer presenteras.

Analys av sidopopulation i solida tumör cellinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Analys av sidopopulationsceller är en av de vanliga metoderna för att isolera och identifiera cancerstamceller från tumörvävnader och tumörcellslinjer. Denna analys är bekväm, snabb och kostnadseffektiv. Denna metod kan bidra till en bättre förståelse av effekten av gener eller andra extracellulära och intracellulära signaler på stamstamningsegenskaper hos tumörceller.Många faktorer kan påverka andelen SP-celler i denna analys, så det är viktigt att utforska rätt förhållanden före det formella experimentet. Frö tumör celler i en sex-brunn platta, och inkubera dem i en 37-graders Celsius inkubator levereras med 5%koldioxid. När celltätheten når ca 90% aspirerar odlingsmediet och tvätta cellerna två gånger med tre milliliter PBS.Tillsätt sedan 500 mikroliter på 0,25% trypsin-EDTA till varje brunn och inkubera plattan vid 37 grader Celsius i en till tre minuter. Knacka försiktigt på plattan för att lossa cellerna, tillsätt tre milliliter PBS kompletterat med 2%FBS till varje brunn och pipettera cellerna upp och ner tre till fem gånger för att sprida cellklumparna. Undersök cellfjädringen under mikroskopet.Om cellklumpar förekommer, passera suspensionen genom en 70-mikrometer sil. Överför cellerna till ett 15 milliliter centrifugeringsrör och centrifugera dem vid 200 gånger g i fem minuter. Ta bort supernatanten och återanvänd cellerna i tre milliliter PBS kompletterat med 2%FBS, pipetting cellerna upp och ner tre till fem gånger för att blanda.Räkna celler under mikroskopet med hjälp av en hemocytometer och späd dem i PBS kompletterat med 2%FPS till en slutlig koncentration på en gånger 10 till de sex cellerna per milliliter. Förbered två fem milliliter, polystyren, runda botten provrör och tillsätt en milliliter av cellfjädringen till varje rör. Märk det ena röret som ett provrör och det andra som ett blockerkontrollrör.Förbered en lösning av blockeraren genom att späda ut den till lämplig koncentration. Tillsätt det i blockeraren kontrollrör och blanda väl och inkubera sedan röret vid 37 grader Celsius i 30 minuter. Skaka röret var 10:e minut.Bered en lösning av Hoechst 33342 genom att späda ut den till lämplig koncentration. Tillsätt det i provröret och blockeraren kontrollröret separat och blanda väl och inkubera sedan rören vid 37 grader Celsius i 60 minuter. Skaka rören var 10:e minut.Efter inkubationen, centrifugera cellerna i fem minuter vid 200 gånger g och fyra grader Celsius och aspirera sedan försiktigt supernatanten. Återanvänd cellerna i varje rör med en milliliter iskallt PBS kompletterat med 2%FBS, sedan pipett cellerna upp och ner för att blanda. Tillsätt en mikroliter av en milligram per milliliter propidiumididid, eller PI, till varje rör och blanda.Klicka på fliken Parametrar i flödescytometerprogramvaran. Välj först parametrarna för FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red respektive PI. För det andra väljer du den logaritmiska skalan för PI-parametern.Välj slutligen områdes- och breddskalor för parametrarna FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red respektive PI. Kör cellerna från provröret först och kör sedan cellerna från blockerarens kontrollrör med samma spänningar och grindar. Samla in 20 till 100 000 händelser från varje prov för att analysera procentandelen SP-celler.Denna metod användes för att upptäcka andelen SP-celler i MDA-MB-231 mänskliga bröstcancer cellinjen. Prick plot av FSC-A kontra PI-A visade en population av döda celler, cell skräp och den största populationen av PI negativa celler, som utsattes för ytterligare analys. En enda cellpopulation gated från pricken tomt av FSC-A kontra FSC-W och prick plot av SSC-A kontra SSC-W användes för att analysera andelen SP celler, som var ca 0,9%i obehandlade celler och ca 0,09%i celler behandlas med reserpine.Olika färgningskoncentrationer av Hoechst 33342 testades på MDA-MB-435 celler, och det fastställdes att två mikrogram per milliliter var optimalt för SP-analys. Låga koncentrationer gjorde det svårt att skilja SP-celler från andra populationer, medan höga koncentrationer fick SP-celler att försvinna. Verapamil och reserpine testades för att bestämma rätt blockerare för MDA-MB-435 celler.Cirka 0,4%av cellerna utvisade färgämnet efter verapamil behandling, men förhållandet sjönk till ca 0,1%efter reserpine behandling, visar att reserpine är en lämpligare blockerare för denna cellinje. Detta protokoll användes också för att bestämma andelen SP-celler i A549 humana lungadoarcinomceller behandlade med STAT3-aktivatorkolivelin och i T47D mänskliga bröstcancerceller behandlade med FRA1-hämmaren SKLB816. Denna analys ger ledtrådar till den regulatoriska effekten av signaleringsvägar på cancerstamcellers egenskaper och underlättar upptäckten av nya mekanismer, vilket i slutändan kan vägleda den riktade behandlingen av tumörer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Användning av DNA-färgutlösad sidob populationsfenotyp för att detektera och rena cancer stamceller från biologiska prov

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Villkorliga Nedslagning av genuttryck i Cancer cellinjer att studera rekrytering av monocyter/makrofager att den tumör mikromiljö

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Enkel och snabb metod att få hög kvalitet tumör DNA från klinisk-patologiska exemplar med Touch avtryck cytologi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitala polymeras Chain Reaction Assay för den genetiska variationen i en sporadisk familjär adenomatös polypos Patient med formatet Chip-i-ett-rör

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Inrättande av patienter med Ventrikelhärledd xenograft-modell och primära cellinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radio känslighet av cancer stamceller i Lung cancer cellinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Utvärdera celldöd med hjälp av cellfri supernatant av probiotika i tredimensionella sfäroidkulturer av kolorektalcancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modellering av primära bentumörer och benmetastaser med solid tumörtransplantatimplantation i ben

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Cirkulerande tumör cellinjer: ett innovativt verktyg för grundläggande och translationell forskning

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...