Name: analysis of side population in solid tumor cell lines
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines at JoVE.com

Bu çalışma Çin doğa bilimleri vakfı tarafından finanse edildi 81572599, 81773124 ve 81972787; Tianjin Şehri Doğa Bilimleri Vakfı (Çin) 19JCYBJC27300; Tianjin Halk Hastanesi & Nankai Üniversitesi İşbirlikçi Araştırma Hibesi 2016rmnk005; Nankai Üniversitesi Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları 63191153.

1. Hücre hazırlığı
<ol><li>Hücre sindirimi ve nötralizasyon<ol>
<li>Tohum tümör hücreleri (MDA-MB-231 hücreleri gibi) 6 kuyu plakasında ve % 5 CO2ile birlikte verilen 37 °C inkübatörde kültüre edilir.</li>
		<li>Yoğunlukları yaklaşık% 90'a ulaştığında hücreleri hasat edin. Kültür ortamını iyice emiş ve hücreleri 3 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 2x yıkayın. NOT: Sinyal yolu inhibitörlerinin (örneğin FRA1 inhibitörü) veya aktivatörlerin (örneğin STAT3 aktivatör...

<ol>
	<li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+cancer,+and+cancer+stem+cells.">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population.">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133/CD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component.">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).</li><li>Bailey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCLK1+marks+a+morphologically+distinct+subpopulation+of+cells+with+stem+cell+properties+in+preinvasive+pancreatic+cancer.">DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).</li><li>Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44++CD24(-)+prostate+cells+are+early+cancer+progenitor/stem+cells+that+provide+a+model+for+patients+with+poor+prognosis.">CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis.</a> British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD90++cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer.">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li><li>Schulenburg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+basic+science+and+in+translational+oncology:+can+we+translate+into+clinical+application.">Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application.</a> Journal of Hematology &amp; Oncolcology. 8, 16 (2015).</li><li>Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+Antigen-1+Enriches+for+a+Cancer+Stem+Cell-Like+Subpopulation+in+Mouse+Gastric+Cancer.">Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer.</a> Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+identification+and+sorting+using+the+Hoechst+33342+side+population+(SP).">Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP).</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).</li><li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABC+Transporters+in+Cancer+Stem+Cells:+Beyond+Chemoresistance.">ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).</li><li>Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumitremorgin+C+reverses+multidrug+resistance+in+cells+transfected+with+the+breast+cancer+resistance+protein.">Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein.</a> Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).</li><li>Takara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+calcium+antagonists+on+ABCG2/BCRP-mediated+drug+resistance+and+transport+in+SN-38-resistant+HeLa+cells.">Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells.</a> Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).</li><li>Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+specific+and+general+inhibitors+of+the+three+major+human+ATP-binding+cassette+transporters+P-gp,+BCRP+and+MRP2+among+registered+drugs.">Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs.</a> Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).</li><li>Challen, G. A., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+side+order+of+stem+cells:+the+SP+phenotype.">A side order of stem cells: the SP phenotype.</a> Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).</li><li>Wu, C., Alman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+in+human+cancers.">Side population cells in human cancers.</a> Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).</li><li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+is+enriched+in+tumorigenic,+stem-like+cancer+cells,+whereas+ABCG2++and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic.">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+Colivelin+treatment+ameliorates+memory+impairment+related+to+Alzheimer's+disease.">Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).</li><li>Marotta, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK2/STAT3+signaling+pathway+is+required+for+growth+of+CD44(+)CD24(-)+stem+cell-like+breast+cancer+cells+in+human+tumors.">The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).</li><li>Zhang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Lead+to+Drug+Candidate:+Optimization+of+3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine+Derivatives+as+Agents+for+the+Treatment+of+Triple+Negative+Breast+Cancer.">From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer.</a> Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).</li><li>Tam, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+alpha+is+a+central+signaling+node+and+therapeutic+target+for+breast+cancer+stem+cells.">Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).</li><li>Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analyses+as+a+critical+parameter+in+defining+the+side+population+(SP)+phenotype.">Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype.</a> Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).</li><li>Petriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+the+side+population+(SP).">Flow cytometry of the side population (SP).</a> Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).</li><li>Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells+exhibits+cancer+stem+cell-like+properties+without+higher+bone-metastatic+potential.">Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.</a> Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).</li><li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM3+mediates+inflammatory+signaling+to+promote+cancer+cell+stemness.">ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness.</a> Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).</li><li>Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baicalein+Suppresses+Stem+Cell-Like+Characteristics+in+Radio-+and+Chemoresistant+MDA-MB-231+Human+Breast+Cancer+Cells+through+Up-Regulation+of+IFIT2.">Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2.</a> Nutrients. 11 (3), 624 (2019).</li><li>Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapped+doxorubicin+nanoparticles+for+the+treatment+of+metastatic+anoikis-resistant+cancer+cells.">Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells.</a> Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).</li><li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells.">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+for+lung+cancer+risk+of+PM2.5+:+Induction+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+properties+in+human+non-small+cell+lung+cancer+cells.">The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).</li><li>Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Modeling+of+ABCG2+Transporter+Heterogeneity:+A+Quantitative,+Single-Cell+Analysis+of+the+Side+Population+Assay.">Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay.</a> PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+inhibitor+of+angiogenesis+inversely+correlates+with+side+population+phenotype+and+function+in+human+lung+cancer+cells.">An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells.</a> Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).</li><li>Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAIL-expressing+mesenchymal+stem+cells+kill+the+putative+cancer+stem+cell+population.">TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population.</a> British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).</li><li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties.">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+"side+population"+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+minor+groove-binding+ligands:+a+different+class+of+mammalian+DNA+topoisomerase+I+inhibitors.">DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).</li></ol>

SP tahlilleri için akılda tutulması gereken birkaç önemli nokta vardır. Birincisi, her hücre hattı için Verapamil veya Reserpine gibi uygun bir engelleyicinin seçilmesidir, çünkü SP hücrelerinin "kapı" konumu, engelleyicinin eklenmesinden sonra çok sayıda SP hücresinin kaybolduğu konuma göre belirlenir. MDA-MB-231 hücre hattı için Reserpine iyi çalışır. Ancak, diğer hücre hatları için farklı engelleyiciler daha iyi çalışabilir.
İkincisi Hoechst 33342 konsant...

Kanser kök hücreleri (CSC' ler), tümör büyümesi, metastaz ve nüks1,2'dehayati rol oynayan, kendini yenileme yeteneğine ve çoklu farklılaşma potansiyeline sahip hücrelerin alt kümeleridir. Şu anda, CSC'lerin akciğer, beyin, pankreas, prostat, meme ve karaciğer kanserleri 3, 4 , 5 ,6,7,8,9dahil olmak üzere çeşitli kötü huylu tümörlerde varolduğutanımlanmıştır. Bu tümörlerde CSC'lerin tanımlanması esas olarak CD44, CD24, CD133 ve Sca-19,10 'un yüksek ve/veya düşük ekspresyosu gibi yüzey belirteç proteinlerinin varlığına dayanmaktadır, ancak CSC'leri CSC olmayanlardan ayırt edebilecek benzersiz bir belirteç şimdiye kadar bildirilmemiştir. Şu anda tümör dokusunda veya tümör hücre hatlarında CSC'leri tanımlamak ve arındırmak için çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Bu teknikler CSC'lerin belirli özelliklerine göre tasarlanmıştır. Bunlar arasında, yan popülasyon (SP) hücrelerinin tahlilleri ve sıraları yaygın olarak kullanılan yöntemlerden ikisidir.
SP hücreleri başlangıçta Goodell ve ark.11, fare kemik iliği hücrelerinde hematopoetik kök hücreleri karakterize ettiklerinde keşfedildi. Fare kemik iliği hücreleri floresan boya Hoechst 33342 ile etiketlendiğinde, bir akış sitometrisi testinin iki boyutlu nokta grafiğinde hoechst 33342 loş lekeli hücrelerin küçük bir grubu ortaya çıktı. Hoechst 33342 DNA bağlayıcı bir boyadır ve farklı spektral özelliklere yol açan en az iki bağlama moduna sahiptir. Floresan emisyonu aynı anda iki dalga boyunda görüntülerken, birden fazla popülasyon ortaya çıkabilir12. Tahlillerinde Hoechst 33342 350 nm'de heyecanlandı ve floresan 450/20 nm bant geçişi (BP) filtresi ve 675 nm kenar filtresi uzun geçiş (EFLP)11kullanılarak ölçüldü. Kemik iliği hücrelerinin tüm popülasyonu ile karşılaştırıldığında, bu hücre grubu SP hücreleri11adı verilen hematopoetik kök hücreler ile zenginleştirilmiştir. SP hücreleri Hoechst 33342'yi hızla dışarı atabilir. Bu boyanın efflux ile ilgilidir ATP bağlayıcı kaset (ABC) transporters13Fumitremorgin C14, Verapamil ve Reserpine 15,16gibi bazı ajanlar tarafından inhibe edilebilir. Bundan sonra, çeşitli dokularda, organlarda, tümör dokularında ve tümör hücre hatlarında farklı oranlarda SP hücreleri tespit edildi17,18,19. Bu SP hücreleri kök hücrelerin birçok özelliğine sahiptir17,19.
Bu makalede Hoechst 33342 kültürlü tümör hücrelerinin etiketlenerek boyanması ve SP hücrelerinin akış sitometrisi ile analizi açıklanmaktadır. Ayrıca Hoechst 33342 konsantrasyonunun optimizasyonu ve bu yaklaşım kullanılarak belirli bir tümör hücre hattı için uygun bloker seçimi gösterilmiştir. Son olarak, saplanma terfisi veya inhibisyon sinyallerinin tümör hücrelerindeki SP oranı üzerindeki etkileri gösterilmiştir. Deneysel örnekler, SP'nin analizinin gen ekspresyatörleri, küçük inhibitörler, aktivatörler, sitokinler ve kemokinler gibi çeşitli sinyallerin tümör saplığı üzerindeki etkilerini araştırmak için kullanılabileceğini göstermektedir. CD44+/CD24– popülasyonun sıralenmesi, aldehit dehidrogenaz (ALDH) analizi ve tümör küre oluşumu tahlilleri gibi CSC'lerin izolasyonu ve saflaştırılması için diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem manipülasyon için daha kolaydır ve uygun maliyetlidir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3516</td>
			<td>9.5 cm2 (approx.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colivelin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-P1061A</td>
			<td>Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries (BIOIND)</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSDiva</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352054</td>
			<td>12 x 75 mm, 5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td>(3&#946;, 16&#946;, 17&#945;, 18&#946;, 20&#945;)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKLB816</td>
			<td>Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td>5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of side population in solid tumor cell lines

Kanser kök hücreleri (KSS) tümör büyümesi, metastaz ve nüksün önemli bir nedenidir. CSC'lerin izolasyonu ve tanımlanması tümör araştırmaları için büyük önem taşımaktadır. Günümüzde CSC'lerin tümör dokularından ve tümör hücre hatlarından tanımlanması ve saflaştırılması için çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Yan popülasyon (SP) hücrelerinin ayrılması ve analizi yaygın olarak kullanılan yöntemlerden ikisidir. Yöntemler, CSC'lerin Hoechst 33342 gibi floresan boyaları hızla dışarı atma yeteneğine dayanır. Boyanın efflux'u ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları ile ilişkilidir ve ABC taşıyıcı inhibitörleri tarafından engellenebilir. Hoechst 33342 ile kültürlü tümör hücrelerini boyama ve SP hücrelerinin akış sitometrisi ile oranını analiz etme yöntemleri açıklanmıştır. Bu test kullanışlı, hızlı ve uygun maliyetlidir. Bu testte oluşturulan veriler, genlerin veya diğer hücre dışı ve hücre içi sinyallerin tümör hücrelerinin köklük özellikleri üzerindeki etkisinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir.

Bu yönteme göre dört deneysel SP analizi yapıldı. İlkinde üç negatif insan meme kanseri hücre hattı olan MDA-MB-231'deki SP hücrelerinin oranını normal şartlarda tespit ettik. Hücre sayımından sonra Hoechst 33342, 1 x 10 6 hücre içeren bir tüpe3 μg/mL'lik son konsantrasyona eklendi. Reserpine ve Hoechst 33342, sırasıyla 40 μM ve 3 μg/mL'lik son konsantrasyonlara başka bir tüpe eklendi. Pi her iki tüpe de eklendi. FSC-A'nın (X ekseni) PI-A'ya (Y ekseni) karşı noktasal grafiği ü?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines at JoVE.com

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Katı tümör hücre hatlarındaki yan popülasyon hücrelerinin oranını ölçmek için uygun, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sunulmuştur.

Solid Tümör Hücre Hatlarında Yan Popülasyon analizi

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Yan popülasyon hücrelerinin analizi, kanser kök hücrelerini tümör dokularından ve tümör hücre çizgilerinden izole etmek ve tanımlamak için yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir. Bu test kullanışlı, hızlı ve uygun maliyetlidir. Bu yöntem, genlerin veya diğer hücre dışı ve hücre içi sinyallerin tümör hücrelerinin köklük özellikleri üzerindeki etkisinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir.Birçok faktör bu analizde SP hücrelerinin yüzdesini etkileyebilir, bu nedenle resmi deneyden önce uygun koşulları araştırmak önemlidir. Tümör hücrelerini altı kuyulu bir tabakta tohumlayın ve %5 karbondioksitle birlikte verilen 37 santigrat derecelik bir inkübatörde kuluçkaya yatır. Hücre yoğunluğu yaklaşık% 90'a ulaştığında kültür ortamını aspire edin ve hücreleri üç mililitre PBS ile iki kez yıkayın.Ardından, her kuyuya% 0.25 tripsin-EDTA'nın 500 mikrolitresini ekleyin ve plakayı bir ila üç dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Hücreleri ayırmak için plakaya hafifçe dokunun, her kuyuya%2 FBS ile desteklenmiş üç mililitre PBS ekleyin ve hücre kümelerini dağıtmak için hücreleri üç ila beş kez yukarı ve aşağı borulayın. Hücre süspansiyonu mikroskop altında incele.Hücre kümeleri varsa, süspansiyonu 70 mikrometrelik bir süzgeçten geçirin. Hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve beş dakika boyunca 200 kez g'da santrifüjleyin. Üstnatantı çıkarın ve hücreleri %2 FBS ile desteklenmiş üç mililitre PBS'de yeniden biriktirin ve hücreleri karıştırmak için üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipetleme.Hemositometre kullanarak mikroskop altındaki hücreleri sayın ve mililitre başına altı hücreye bir kez 10 kez nihai konsantrasyona% 2 FPS ile desteklenmiş PBS'de seyreltin. İki adet beş mililitre, polistiren, yuvarlak tabanlı test tüpleri hazırlayın ve her tüpe bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Bir tüpü test tüpü, diğerini engelleyici kontrol tüpü olarak etiketle.Uygun konsantrasyona seyrelterek bir bloker çözeltisi hazırlayın. Bloker kontrol tüpüne ekleyin ve iyice karıştırın, ardından tüpü 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya bırakın. Tüpü her 10 dakikada bir sallayın.Uygun konsantrasyona seyrelterek Hoechst 33342 çözeltisi hazırlayın. Test tüpüne ve bloker kontrol tüpüne ayrı ayrı ekleyin ve iyice karıştırın, ardından tüpleri 37 santigrat derecede 60 dakika kuluçkaya bırakın. Tüpleri her 10 dakikada bir sallayın.Kuluçkadan sonra, hücreleri 200 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin, ardından süpernatantı dikkatlice epire edin. Her tüpteki hücreleri%2 FBS ile desteklenmiş bir mililitre buz gibi PBS ile yeniden depolayın, ardından karıştırmak için hücreleri yukarı ve aşağı borulayın. Her tüpe mililitre başına bir miligram propidium iyot veya PI mikrolitre ekleyin ve karıştırın.Akış sitometresi yazılımında Parametreler sekmesini tıklatın. İlk olarak, sırasıyla FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red ve PI parametrelerini seçin. İkinci olarak, PI parametresi için logaritmik ölçeği seçin.Son olarak, sırasıyla FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red ve PI parametreleri için alan ve genişlik ölçeklerini seçin. Hücreleri önce test tüpünden çalıştırın, sonra aynı voltajları ve kapıları kullanarak bloker kontrol tüpünden hücreleri çalıştırın. SP hücrelerinin yüzdesini analiz etmek için her örnekten 20 ila 100.000 olay toplayın.Bu yöntem MDA-MB-231 insan meme kanseri hücre hattındaki SP hücrelerinin oranını tespit etmek için kullanılmıştır. FSC-A ile PI-A arasındaki nokta grafiği, daha fazla analize tabi tutulan ölü hücre, hücre enkazı ve PI negatif hücrelerinin ana popülasyonu popülasyonu gösterdi. Tedavi edilmeyen hücrelerde yaklaşık %0,9 ve reserpine ile tedavi edilen hücrelerde yaklaşık %0,09 olan SP hücrelerinin oranını analiz etmek için FSC-A ile FSC-W ve SSC-A'nın noktasal grafiğinden kapılı tek bir hücre popülasyonu kullanıldı.Hoechst 33342'nin farklı boyama konsantrasyonları MDA-MB-435 hücreleri üzerinde test edildi ve mililitre başına iki mikrogramın SP analizi için en uygun olduğu belirlendi. Düşük konsantrasyonlar SP hücrelerini diğer popülasyonlardan ayırt etmeyi zorlaştırırken, yüksek konsantrasyonlar SP hücrelerinin kaybolmasına neden oldu. MDA-MB-435 hücreleri için uygun engelleyiciyi belirlemek için verapamil ve reserpine test edildi.Hücrelerin yaklaşık% 0.4'ü verapamil tedavisinden sonra boyayı dışarı attı, ancak reserpine tedavisinden sonra oran yaklaşık% 0.1'e düştü ve reserpinin bu hücre hattı için daha uygun bir engelleyici olduğunu gösterdi. Bu protokol ayrıca STAT3 aktivatör kolivelin ile tedavi edilen A549 insan akciğer adenokarsinom hücrelerinde ve FRA1 inhibitörü SKLB816 ile tedavi edilen T47D insan meme kanseri hücrelerinde SP hücrelerinin oranını belirlemek için kullanılmıştır. Bu test, sinyal yollarının kanser kök hücrelerinin özellikleri üzerindeki düzenleyici etkisine dair ipuçları sağlar ve sonuçta tümörlerin hedeflenen tedavisine rehberlik edebilecek yeni mekanizmaların keşfini kolaylaştırır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Biyolojik Örneklerden Kanser Kök Hücrelerini Algılamak ve Arıtmak İçin DNA Boya Tarafından Tetiklenen Yan Populasyon Fenotipi Kullanmak

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Monosit/makrofajlar tümör Microenvironment için işe alım çalışmaya kanser hücre hatlarında gen ifadesinin koşullu nakavt

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Mide kanseri hasta-türetilen xenograft modelleri ve primer hücre hatları kurulması

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Akciğer Kanseri Hücre Hatlarında Kanser Kök Hücrelerinin Radyosensitivite

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Kolorektal Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Küresel Kültürlerinde Probiyotiklerin Hücresiz Süpernatantı Kullanılarak Hücre Ölümünün Değerlendirilmesi

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Primer Kemik Tümörleri ve Kemik Metastazlarının Solid Tümör Grefti İmplantasyonu ile Modellenmesi

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Dolaşımdaki Tümör Hücre Hatları: Temel ve Çevirisel Araştırmalar için Yenilikçi Bir Araç

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...