Name: a novel stromal fibroblast-modulated 3d tumor spheroid model for studying tumor-stroma interaction and drug discovery
Uploaded: 2020-02-28T12:00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery at JoVE.com

אנו מודים לד ר אואידה ג. ולאסקז (אונ' מיאמי) לשיתוף פעולה, ייעוץ ודיון מועילים; ד ר ג'אי לי (אוניברסיטת מיאמי) לאספקת תאים MeWo; וד ר Meenhard הרלין (מכון Wistar) עבור מתן כל תאי מלנומה אחרים. אנו מודים גם ד ר מרשה בובינה, מנהל מתקן ליבת הדמיה אנליטית, אוניברסיטת מיאמי, לניתוח דימות. ז'או-ג'ון ליו נתמך על ידי מענקים מתוכנית המחקר לסרטן בנקהד-Coley (פרס 09BN 11), האגודה לסרטן נשים (המענקהשנתי 53 ) וקרנות פנימיות מאוניברסיטת מיאמי.

1. בתאי מלנומה culturing ועור פיברותקיעות
<ol><li>מלנומה בתאים אנושיים<ol>
<li>תרבות תאים מלנומה האדם, C816131 תחת התנאים המקובלים בתרבות התא בינונית W489 מלאה (ראה שלב 1.2) ב 37 ° c החממה שסופקו עם 5% CO2 כפי שמתואר בעבר32. פצל את התאים ביחס 1:5 כאשר הם מגיעים ל-~ 90% השטף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תרבות תא מלנומה בינונית (W489)<ol>
<li>עבור W489 בינוני מלא, השימוש 80% MCDB153 בינונית, 20% L-15 בינוני (ראה טבלת חומרים), 2% סרום בקר עוברי (fbs), 5 μg/mL אינסולין, 1.68 MM cacl2, ו 0.11% נתרן ביקרבונט. עבור תרבות החברה, אל תוסיף FBS, אינסולין ו-CaCl2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בידוד עור לעכבר<ol>
<li>גזור קטע עור בגודל 1 ס מ מעכבר בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בוועדה (IACUC).</li>
		<li>מעכלים את העור על-ידי הגיאז (ראו טבלת חומרים) ב -4 ° c בלילה. להסיר את דרמיס מן האפידרמיס ועוד לעכל עם הקולגן (1 מ"ג/mL ב dmem ראה טבלה של חומרים) בטמפרטורת החדר (RT) לילה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עור העכבר פיברוהפיצוץ מקולף<ol>
<li>לשטוף את כדורי הרקמה עם PBS ותרבות אותם DMEM עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין ב 37 ° צ'/5% CO2. פצל את התאים ביחס 1:2 כאשר הם מגיעים ל-~ 90% השטף.</li>
		<li>באמצעות שיטות סטנדרטיות לפני התרבות הבין-משתמשים בשיטות העור הרגילות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אפיון של עור העכבר פיברותקיעות על ידי כתמים חיסוני<ol>
<li>הכנה לצביעת תאים<ol>
<li>הזרע העור פיברותקיעות 24 צלחת הבאר בצפיפות של 2 x 104 תאים/גם. ביום 2, לשטוף את התאים עם PBS 2x ולתקן אותם 2% המאגר ניטרלי באגירה עבור 10 דקות. הסר את פורמלין ולשטוף את התאים קבוע עם pbs פעמיים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>כתמים חיסוני<ol>
<li>הוסף 200 μL של פתרון חסימה לכל טוב ומעכלת את הצלחת 30 דקות ב RT, ואז להוסיף העכבר anti-α-SMA מדולל ב 1:200 ו-דגירה ב 37 ° c עבור 1 h. לשטוף עם PBS 3x, 5 דקות כל אחד.</li>
			<li>הוסף אלכס Fluor 488 עז אנטי עכבר IgG ב 1:400 דילול ו-דגירה ב RT עבור 1 h. שטוף את הנוגדנים 3x עם PBS, 5 דקות כל אחד.</li>
			<li>הוסף 1 μg/mL DAPI ו-דגירה ב-RT עבור 2 דקות. הסר פתרון DAPI והוסף 500 μL של PBS לתוך כל טוב.</li>
			<li>להתבונן בתאים ולצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטית.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>התוויות המקדימות ותאי מלנומה<ol>
<li>זרעי הזרע לתוך צלחת 100 מ"מ ביום 1, כך ששטף התא מגיע ~ 60% למחרת היום. ביום 2, להסיר את בינונית התרבות ולהוסיף GFP/הנגיף (~ 1:3 – 1:5 מדולל מהמלאי) לתוך בינונית תרבות רגילה עם 4 μg/mL של polybrene. התאים הדגירה בחממה 37 ° c עבור 6 h, להסיר את המדיום ולהחליף עם מדיום התרבות הרגילה טריים. לאחר יומיים, שימו לב לאות GFP מהתאים בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטית. מC8161 תאים עם DsRed/הנגיף בתנאים דומים. פרוטוקולים להכנת הנגיף gfp/הנגיף ו-dsred/לנטיטווירוס תוארו בעבר14,34.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. מתאים לתרבות
<ol><li>הזרע את התרבות הC8161-פיברובלסט.<ol>
<li>ביום 0 של שיטת היווצרות הספרואיד, יש לנתק הן את הC8161 והן את העור בעזרת 0.25% טריפסין-EDTA. לסובב את התאים ב 250 g עבור 5 דקות ב RT ולשטוף פעם אחת עם PBS.</li>
		<li>השהה מחדש את התאים בתווך התא coculture (סרום חינם, אינסולין חינם, וסידן חינם W489 בינוני מעורבב עם סרום חינם DMEM ביחס 1:1). כוונן את ריכוז התא ל-2 x 104 תאים/mL.</li>
		<li>מערבבים את התאים C8161 עם הפיברופיצוצים ביחס 1:1 ומוסיפים 2 מ ל של תערובות התא לכל טוב של הצלחת 24 הבאר. כל טוב צריך להכיל 2 x 104 של כל סוג של תאים. כל תנאי צריך להיעשות בטרילקאט. הערה: חשוב להשתמש בצלחת הטיפול בתרבות שאינה רקמה (ראה טבלת חומרים). אחרת, התאים מתחברים בחוזקה לצלחת ואינם יכולים לקבל השעיית spheroids.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מודקת תאים ב 37 ° c עבור 4 h עד התאים לצרף את הצלחת, ולאחר מכן לבצע הדמיה זמן, או סריקה קונפוקלית וקד בנקודות הזמן המצוין עבור כל שיטת.</li>
</ol>3. לחיות תא זמן הדמיה
<ol><li>לפני התרבות, הפעל את מערכת ההדמיה הזמן (ראה טבלת חומרים) בעקבות הוראות היצרן ולתת החממה להגיע 37 ° צ' ו 5% CO2. זה בדרך כלל לוקח 1 h כדי שהמערכת תגיע לשיווי משקל. הניחו בזהירות את לוחית התרבות על הבמה של המיקרוסקופ בתוך החממה ונעלו את הדלת בצורה מאובטחת.</li>
	<li>פתח את התוכנה של מערכת הדמיה הזמן לפקיעה (ראה טבלת חומרים) ולבחור את סוג הצלחת והיצרן כך המיקרוסקופ יכול לאתר את אזור הסריקה במדויק. בחר את הבארות של עניין עדשת האובייקטיבי 10x. בחר את ההגדרות עבור אזור הסריקה, את זמן המרווח בין הסריקות, לבין התחלה, כמו גם זמן סיום. בפרוטוקול זה, מספר התבנית המירבי עבור אזור הסריקה עבור 1 היטב הוא 36 והזמן המרווח הוא 1 h.</li>
	<li>שיא הדמיה בזמן ההדמיה מ-4 – 52 h. הערה: זמן ההתחלה, זמן הסיום והמשך צריכים להיות ממוטבים לפי סוג תא ומטרת הניסוי.</li>
	<li>בעת השלמת הקלטת התמונה, השתמש בתוכנת מערכת הדמיה של הזמן לאחזור הנתונים וייצוא סרטי וידאו או ערכות תמונות.</li>
</ol>4. מיקרוסקופיה קונפוקלית וסרטים תלת ממדיים
<ol><li>מניחים את צלחת התרבות התא על הבמה של מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטית (ראה טבלת חומרים) ולהשתמש בקרני לייזר אדום וירוק. להתבונן בתאים תחת עדשת המטרה 5x או 10x ובחר ספרואיד להתחיל סריקה.</li>
	<li>השתמש בצעד אחד יקרומטר z כדי לסרוק מהחלק התחתון לחלק העליון של הספרואיד. עיבוד הנתונים באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלת חומרים) כדי לשחזר תמונה תלת-ממדית שניתן לסובב עוד ולשמור כסרט תלת-ממדי.</li>
</ol>5. תרבות סולו של תאים מלנומה והיווצרות אשכולות 2D/אגרגטים
<ol><li>זרע 2 x 104 C8161 מלנומה תאים לתוך כל טוב של הצלחת 24 היטב כמתואר בסעיף 2.1. תרבות התאים 7 – 10 ימים ולצלם אותם באמצעות מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטית.</li>
</ol>6. בדיקה אם תלת-ממד הספרואידים ואשכולות תא 2D/אגרגטים מושעים במדיום או מוצמד ללוחות
<ol><li>לתרבית תאים, בדוק את הspheroids התלת-ממדיים שנוצרו ביום 7. עבור תרבות תא בודדת, בדוק את האשכולות 2D/אגרגטים שנוצרו ביום 10.</li>
	<li>הגדר צלחות של תרבות התא על מצע של מיקרוסקופ פלואורסצנטית הפוך. לשים מחט מכופף עם מזרק לתוך הבאר ובעדינות מכניס את מדיום התרבות פנימה והחוצה כדי להפריע מדיום התרבות בבארות. הקלט תהליך זה באמצעות מצב הסרט של תוכנת הסרט (ראה טבלת חומרים). הספרואידים תלת-ממדיים יהיו ניידים, אך אשכולות התא 2D/אגרגטים יישארו איתנה.</li>
</ol>7. תמונה קונמוקד של הספרואידים תלת-ממדיים
הערה: תאים מתורשים מתחילים ליצור spheroids מ 48-72 h בהתאם לסוג של הפיברותקיעות בשימוש. בדרך כלל, הספרואידים מתרחבות בהדרגה עם הזמן. מיורואידים קטנים יכולים להיות מסוגלים ליצור מזהים גדולים יותר עד יום 7. לאחר ייצוב הספרואידים בגודל, הם יכולים להימשך יותר מ -10 ימים. לאחר מכן, הספרואידים לעתים קרובות להתנתק מהחלק התחתון של לוחית התרבות ומתאספים במרכז הבארות. במהלך התרחבות הספרואידים, התאים במרכז מתים בדרך כלל בשל תזונה לא מספקת ו/או מיקרואקולוגיה רעילה. מכאן, השיא של היווצרות 3D ספרואיד והעיתוי התמונה הספרואידים הבשיל צריך להיות ממוטב באמצעות ניסויים פיילוט. עבור פרוטוקול זה, המיקרוסקופיה בוצעה בסביבות יום 7 כאשר הרוהרואידים היו בוגרים והתאים במרכז הספרואידים עדיין בחיים על פי הקרינה הפלואורסצנטית והמבנה של התאים במרכז.
<ol><li>כדי לבצע מיקרוסקופיה קונפוקלית, השתמשו בלייזר ירוק ואדום כדי לסרוק את הספרואידים. לקבוע את אזור הסריקה תחת מטרה 10x ולעבור מהחלק התחתון לראש הספרואיד עם 1 יקרומטר z-step.</li>
	<li>צור את היווצרות וידאו תלת-ממדי וסרטוני סיבוב באמצעות פונקציית ההטלה תלת-ממדית של תוכנת עיבוד התמונה (לדוגמה, ImageJ).</li>
</ol>8. Notch1 תאיים פעילות מסלול איתות בקביעת רגולציה סטרומה של סרטן גזע/ייזום תאים
<ol><li>בידוד ואפיון של העור פיברותקיעות מתוך הפסד ואובדן פונקציה Notch1 עכברים<ol>
<li>לבודד פיברותקיעות עור משני זוגות של עכברים מהונדסים גנטית: הרווח של פונקציה Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.יצור+/-; העכבריםשל רוזה LSL-N1IC +/+) לעומת השליטה המקבילה שלהם (gofctrl : FSP1. יצור-/-; N1IC+/+) עכברים ואובדן הפונקציה Notch1 (lofNotch1: Fsp1.יצור+/-; Notch1loxp/loxp+/+) עכברים לעומת השליטה המקבילה שלהם (lofctrl : FSP1. יצור-/-; Notch1loxp/loxp+/+) עכברים31, בהתאמה. בידוד ואפיון של העור באמצעות הפרוטוקול המתואר בסעיפים 1.3-1.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>העבר את העור של העכבר. עם הוירוס הגfp<ol>
<li>ראה סעיף 1 עבור השיטה שבאמצעותה יש להתאים את התאים באמצעות הווקטור הנגיפי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>התרבות הקונומה של תאי הסרטן ומלנומה<ol>
<li>התנהלות הניסוי התאי בתרבית כמתואר בסעיף 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הערכת ההשפעה של פעילות מסלול Notch1 תאיים בפיברותקיעות על קביעת הרגולציה סטרומה של סרטן גזע/ייזום תאים על ידי מדידת הגדלים של הספרואידים 3D<ol>
<li>ביצוע הכמת של היווצרות הספרואיד תחת כל מצב על ידי צילום הספרואידים בזמן כאשר spheroids הם בוגרים (מצוין על ידי עצירת הצמיחה סביב יום 5 – 7 בהתאם לסוגי הפיברומות). למדוד את הגדלים של spheroids 3D באמצעות תוכנת עיבוד תמונה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. בדיקת תגובת התרופה לסרטן הגזע/ייזום תאים באמצעות שיטת התלת-ממד התלת-ממדית
הערה: קפה יכול לווסת הטרוגניות של הסרטן ולגרום פניטיפ של סרטן גזע/ייזום תאים. קפה גם תומך בגזע הסרטן/ייזום תאים לסבול טיפולים קליניים. תאים גזע סרטן הוכחו להיות אחראי על התנגדות לסמים. לכן, השתמשנו במודל ספרואיד תלת-ממדי זה כדי להעריך את תגובת התרופה של סרטן גזע/ייזום תאים. התוצאה יכולה להעריך את היעילות הקלינית הפוטנציאלית של תרופות נגד סרטן היטב.
<ol><li>מינהל התרופות<ol>
<li>מיד לאחר coculturing את התאים בצלחת 24 טוב, להכין את התרופות בדילול סדרתי בתווך התרבות כדי להגיע 5x של מגוון הרצוי של ריכוזי מבוסס על ניסויים פיילוט (כלומר, 1 ננומטר, 2.5 nM, 5 ננומטר, 10 ננומטר, ו 25 ננומטר). הוסף 0.5 mL של פתרונות התרופות המתאימות לכל טוב של התאים המתורגיים. התייחס לקבוצת הבקרה באמצעות מדיה רגילה של החברה כפי שהוזכר לעיל.</li>
		<li>הערה: מעכבי מק ו מסיסים במדיה של תרבות התא. לכן, פקדים ריקים הם 2.5 mL של מדיום תרבות התא. עם זאת, אם הסם אינו מסיס בתמיסה מימית ודורש ממיסים כגון DMSO, לאחר מכן מדיה לתרבות התא עם ריכוז זהה של DMSO יש להחיל על קבוצת הביקורת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכמת של תגובת הסמים על ידי ספירת מספרי כמות<ol>
<li>שימו לב לתאים המתייחסים ולתאים שאינם מטופלים בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטית ומצלמים את התאים מדי יום. לכמת את היווצרות ספרואיד בקבוצות ניסיוני שונים ולהשוות את היכולת היווצרות ספרואיד של תרבויות התא תחת ריכוזי סמים שונים. הערה: הספרואידים נוטים להופיע ~ 5-7 ימים לאחר התרבות הקוקולאידית. אפקטי התרופה יהפכו להיות מורגש באותה נקודה.</li>
		<li>השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטית לתמונה/צילום הspheroids ותאים בבארות ולאחר מכן להשתמש בתוכנת התמונה כדי לחשב את הגודל הממוצע של spheroids ואת מספר spheroids הוקמה לפי שדה כוח נמוך (LPF x 4) בכל קבוצת טיפול לאורך זמן. הערה: תאים המקבלים טיפול יעיל בסמים צריכים ליצור פחות או ללא מזהי מספר בהשוואה לקבוצת הביקורת. זהו אינדיקציה לאפקטיביות של הסם נבדק על דיכוי תאי גזע סרטניים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lorusso, G., Ruegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis.">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130, 1091-1103 (2008).</li><li>Anton, K., Glod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tumor+stroma+in+cancer+therapy.">Targeting the tumor stroma in cancer therapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 10, 185-191 (2009).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response.">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501, 346-354 (2013).</li><li>Allinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+tumor+microenvironment+in+breast+cancer.">Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer.</a> Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).</li><li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression.">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li><li>Lynch, C. C., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+in+tumor-host+cell+communication.">Matrix metalloproteinases in tumor-host cell communication.</a> Differentiation. 70, 561-573 (2002).</li><li>Midwood, K. S., Williams, L. V., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+repair+and+the+dynamics+of+the+extracellular+matrix.">Tissue repair and the dynamics of the extracellular matrix.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 36, 1031-1037 (2004).</li><li>Olumi, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinoma-associated+fibroblasts+direct+tumor+progression+of+initiated+human+prostatic+epithelium.">Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium.</a> Cancer Research. 59, 5002-5011 (1999).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer:+a+novel+tumor-promoting+cell+type.">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5, 1597-1601 (2006).</li><li>Luga, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+mediate+stromal+mobilization+of+autocrine+Wnt-PCP+signaling+in+breast+cancer+cell+migration.">Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration.</a> Cell. 151, 1542-1556 (2012).</li><li>Zhang, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+bone+metastasis+seeds+by+mesenchymal+signals+in+the+primary+tumor+stroma.">Selection of bone metastasis seeds by mesenchymal signals in the primary tumor stroma.</a> Cell. 154, 1060-1073 (2013).</li><li>Orimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1/CXCL12+secretion.">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Notch1+signaling+in+stromal+fibroblasts+inhibits+melanoma+growth+by+upregulating+WISP-1.">Activation of Notch1 signaling in stromal fibroblasts inhibits melanoma growth by upregulating WISP-1.</a> Oncogene. 30, 4316 (2011).</li><li>Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+Antitumor+Immune+Response+by+Cancer-Associated+Fibroblasts.">Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts.</a> Frontier in Immunology. 9, 414 (2018).</li><li>Kraman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+antitumor+immunity+by+stromal+cells+expressing+fibroblast+activation+protein-alpha.">Suppression of antitumor immunity by stromal cells expressing fibroblast activation protein-alpha.</a> Science. 330, 827-830 (2010).</li><li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion.">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+tumor+microenvironment+models+for+anticancer+drug+discovery.">In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2007).</li><li>Santiago-Walker, A., Li, L., Haass, N. K., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocytes:+from+morphology+to+application.">Melanocytes: from morphology to application.</a> Skin Pharmacology and Physiology. 22, 114-121 (2009).</li><li>Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+melanoma+in+vitro+and+in+vivo.">Modeling melanoma in vitro and in vivo.</a> Healthcare (basel). 2, 27-46 (2013).</li><li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging-+and+flow+cytometry-based+analysis+of+cell+position+and+the+cell+cycle+in+3D+melanoma+spheroids.">Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).</li><li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17, 1-15 (2015).</li><li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multicellular+spheroids+formation.">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society Interface. 14, (2017).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31, 108-115 (2013).</li><li>Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems+modeling+tumor+growth+determinants+in+cancer+target+discovery.">3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery.</a> Advanced Drug Delivery Review. 69-70, 29-41 (2014).</li><li>Bulin, A. L., Broekgaarden, M., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+high-throughput+image+analysis+for+therapeutic+efficacy+of+architecturally+complex+heterotypic+organoids.">Comprehensive high-throughput image analysis for therapeutic efficacy of architecturally complex heterotypic organoids.</a> Scientific Reports. 7, 16645 (2017).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+spheroid+based+on+a+triple+coculture:+A+novel+3D+model+to+mimic+pancreatic+tumor+complexity.">Multicellular spheroid based on a triple coculture: A novel 3D model to mimic pancreatic tumor complexity.</a> Acta Biomaterialia. 78, 296-307 (2018).</li><li>Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Gu, L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+and+emerging+anticancer+therapeutics:+engineering+the+microenvironment.">Biomaterials and emerging anticancer therapeutics: engineering the microenvironment.</a> Nature Reviews Cancer. 16, 56-66 (2016).</li><li>Tevis, K. M., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedded+Spheroids+as+Models+of+the+Cancer+Microenvironment.">Embedded Spheroids as Models of the Cancer Microenvironment.</a> Advanced Biosystems. 1, (2017).</li><li>Welch, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+highly+invasive+and+spontaneously+metastatic+human+malignant+melanoma+cell+line.">Characterization of a highly invasive and spontaneously metastatic human malignant melanoma cell line.</a> International Journal of Cancer. 47, 227-237 (1991).</li><li>Balint, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Notch1+signaling+is+required+for+beta-catenin-mediated+human+primary+melanoma+progression.">Activation of Notch1 signaling is required for beta-catenin-mediated human primary melanoma progression.</a> Journal of Clinical Investigation. 115, 3166-3176 (2005).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs+:+biological+significance+of+bFGF.">Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF.</a> the American Journal of Pathology. 156, 193-200 (2000).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Notch1+Signaling+in+Cancer-Associated+Fibroblasts+Dictates+the+Plasticity+and+Stemness+of+Melanoma+Stem/Initiating+Cells.">Intracellular Notch1 Signaling in Cancer-Associated Fibroblasts Dictates the Plasticity and Stemness of Melanoma Stem/Initiating Cells.</a> Stem Cells. 37, 865-875 (2019).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+Pathway+Activity+Determines+the+Regulatory+Role+of+Cancer-Associated+Fibroblasts+in+Melanoma+Growth+and+Invasion.">Notch1 Pathway Activity Determines the Regulatory Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Melanoma Growth and Invasion.</a> PLoS One. 10, 0142815 (2015).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1-WISP-1+axis+determines+the+regulatory+role+of+mesenchymal+stem+cell-derived+stromal+fibroblasts+in+melanoma+metastasis.">Notch1-WISP-1 axis determines the regulatory role of mesenchymal stem cell-derived stromal fibroblasts in melanoma metastasis.</a> Oncotarget. 7, 79262-79273 (2016).</li><li>Kalluri, R., Neilson, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+and+its+implications+for+fibrosis.">Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 112, 1776-1784 (2003).</li><li>Price, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+models+in+immunodeficient+animals+:+I.+Nude+mice:+spontaneous+and+experimental+metastasis+models.">Xenograft models in immunodeficient animals : I. Nude mice: spontaneous and experimental metastasis models.</a> Methods in Molecular Medicine. 58, 205-213 (2001).</li><li>Spaeth, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS One. 4, 4992 (2009).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

בשנת מתורבת 3D טכניקות תרבות תאים המועסקים באופן נרחב במשך עשורים במחקר סרטן. בהשוואה למערכות התרבות הרגילות של תאים דו-ממדיים, המיקרו-סביבה התלת-ממדית מאפשר לחקות את תאי התא ו/או את האינטראקציות של מטריצת התאים ומאפשרת חיקוי של התנאים המקוריים שנצפו ברקמות הגידול. עם זאת, מערכת תלת-ממד שהוקמה רק על-ידי תאים סרטניים ואינטראקציות תא הומותאיות לא לקחת בחשבון את החשיבות של דיבור הטרוטיפקס והוא עשוי לספק תוצאות לא מדויקות במחקר. פיתחנו לאחרונה מערכת 3D הרומן שילוב תאים סרטניים ו-בית קפה כדי לחקות טוב יותר מיקרוסביבה vivo הטרוגנית הגידול ותגובה desmoplastic מקורית ונוקשה שלה.
פיברותקיעות הם מרכיבים עיקריים של משתית גידולים. קפה מעורבים בוויסות התקדמות הגידול על ידי מעורר גורמים מסיסים, ECM/שיפוץ אנזימים10,11, אקסוזומים. בנוסף, קפה לשחק חלק בהתנגדות לסמים ולהישנות הגידול16,17. מערכת 3D שלנו ספרואיד מדור שלנו יכול להיות מנוצל כדי לחקור מנגנונים מולקולרית של אינטראקציות הגידול סטרומה וכדי לטפל בהתנגדות לסמים ולהישנות הגידול. קפה מופק בעיקר מתוך מופעל השקט המקומי פיברוהתקיעות ו מגויס מח עצם העצמות MSC, אשר עוברים בידול באתרו לתוך הסרטן ברקמות הגידול37,38,39. במחקר הנוכחי, השתמשנו בפיברוטימיט עור כדי ליצור מודל 3D ספרואיד מגוון. עם זאת, סוג אחר של פיברותקיעות (למשל, MSC-DF), גם לעבוד בצורה דומה מאוד כמו העור פיברותקיעות כדי לווסת את תא הגידול 3D ספרואיד היווצרות34. MSC-DF יכול להיווצר מח עצם מוריין MSC, אשר מועשר על ידי מח עצם culturing ברור תאים בינונית התרבות של הגוף MSC במשך כ 10 ימים עם שינויים בינוניים תקופתיים כל 3 ימים. MSC אלה מאופיינים כ-CD73+/cd105+/Lin-. כדי להבדיל את MSC לתוך פיברוהפיצוצים, MSC הם מתורבתים לאחר מכן עם DMEM להשלים 2 שבועות נוספים. MSC-DF מאופיינים α-SMA+/vimentin+/vimentin+ תאים36. MSC-DF יכול להיות הרגולטורים הגידול חשוב. מכיוון שבריר של קפה בסוגים רבים של גידולים מוצקים מובחנים מ-MSC מגויס במחזור שוחרר מח עצם36, MSC-DF יכול להיות מבטיח מטרות הטיפול. הם גם הרבה יותר בקלות מניפולציות מבחינה רפואית או ממוקד לפני שהם גויסו רקמות הגידול והבדיל לתוך קפה. כך, מודל תלת-ממד שלנו מציע מערכת אידיאלית ללמוד ולבדוק לא רק תאים סרטניים, אלא גם שברים שונים או תת אוכלוסיות של קפה. השיטה עבור היווצרות 3D ספרואיד היא פשוטה. השלבים הקריטיים כוללים שימוש בסרום חינם לתרבות החברה, ומיישם את היחס הנכון של הפיברותקיעות לתאי גידול, ובאמצעות לוחות התרבות הנכונים לתרבות החברה. המגבלה הפוטנציאלית של השיטה שלנו היא כי היווצרות של spheroids 3D הוא תא סרטן ברובו תלוי קו. פרוטוקול היווצרות הספרואיד שלנו עשוי לדרוש אופטימיזציה של היחס בין פיברותקיעות ותאי סרטן אם שונים תאים סרטניים מועסקים. יש לציין כי השתמשנו תא מלנומה של האדם והעכבר פיברוההדף מודל coculture פיצוץ המודל עבור היווצרות של 3D spheroids, כי זה הרבה יותר קל ליצור GOF או LOF תאים בתוך העכבר פיברותקיעות לחקר התפקיד של מולקולה או מסלול איתות בוויסות היווצרות הגידול ספרואיד. היכולת של תאים מלנומה אנושית והעכבר פיברותקיעות לטופס spheroids מציין כי מולקולות הדרושות עבור תקשורת תא תא עבודה לחצות מינים. יש לנו נבדק לאחרונה התרבות coculture האדם עם תאים מלנומה האדם ומצאו כי הגידול האנושי יכול גם לווסת תאים מלנומה אנושית כדי ליצור spheroids 3D.
אנו המועסקים תאים מלנומה גרורתית האדם, C8161, במודל שלנו 3D ספרוoid שלנו. בדקנו גם תאים אחרים מלנומה אנושית, למשל, 1205Lu32, אשר נושאת אתV600E braf מוטציה, ו mewo, אשר מבטא רמות גבוהות של CDK4/קיט (atcc htb-65), ומצא כי הם גם מסוגלים ליצור Spheroids 3d ב-coculture. זה מצביע על היווצרות של spheroids 3D על ידי תאים סרטניים אינו תלוי בסוגים של מוטציות אונגניים. למרות שאנחנו לא בדקנו אם סוגים אחרים של תאים סרטניים שאינם מלנומה מסוגלים להרכיב spheroids 3D עם פיברותקיעות, הממצאים שלנו מצביעים על כך היווצרות של 3D spheroids לא מוגבל לקו תא מלנומה ואולי לא תלוי קו תאים מסוים הסרטן.
הראנו שתי דוגמאות של יישומים מעשיים של המודל התלת-מימדי שלנו. דוגמא אחת הייתה להבהיר את פעילות המסלול הבין-תאיים העולה בוויסות מבנה הסרטן/הייזום של תאי התאים והיווצרות תלת-ממד. הדגמנו את מסלול האיתות התאיים העולה בקפה הוא מתג מולקולרי השולט בפנוטיפ של הגזע הסרטני/היוזם תאים באמצעות מודל זה ספרואיד תלת-ממדי. הממצאים שלנו לא רק לחשוף מנגנון מולקולרי הבסיס מסטרומה רגולציה של סרטן גזע/ייזום תאים סרטן הטרוגניות, אבל גם להדגיש כי מסלול חריץ ב-בית קפה הוא יעד קריטי עבור therapeutics מלנומה. דוגמה זו מציינת כי המודל שלנו 3D ספרואיד שימושי מאוד כדי ללמוד את המנגנונים עבור הסרטן מסטרומה תאים הטיפול בפיברופיצוץ ולזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות. דוגמה נוספת הייתה לבדוק את תגובת התרופה של סרטן גזע/מתחיל תאים בנוכחות של קפה. ידוע היטב כי תגובת התרופה של תאים סרטניים, כולל סרטן גזע/ייזום תאים, משתנה בנוכחות והעדר של קפה. נוכחות של קפה זה במערכת החוץ גופית עושה את המודל הזה יותר קליני רלוונטי תוצאות הבדיקה אמין יותר. יתר על כן, המערכת שלנו 3D ספרוoid הוא צדדי. ניתן להשתמש בו למטרות שונות. לדוגמה, אם תאים סרטניים עמידים בפני תרופות מועסקים במודל תלת-ממד זה, ניתן לשנות את הטיפול בהתנגדות לסמים ואולי להישנות הגידול. זה יכול גם להיות שונה כדי לבדוק או המסך תרופות המיועד בעיקר קפה לטיפול בסרטן. קפה הפכה לאחרונה למטרות טיפוליות מבטיחות. יש יתרונות למיקוד בקפה. ראשון, לעומת התאים הסרטניים כי הם חריגים (לעתים קרובות עם שינויים גנטיים) וחכם (בקלות לקבל עמידות כימותרפיה-רדיותרפיות), קפה ברקמת הגידול הם תאים נורמליים ויציבה יותר גנטית, כך הם פחות סביר לפתח עמידות לטיפולים. שנית, מיקוד בקפה אינו תלוי בסוג של מוטציות אונגניים בתאי הגידול. השלישי, מיקוד בקפה עשוי להשיג תופעות להיט מרובים באמצעות אנטי הגידול התלוי בגידולים, אנטי אנגיוגנזה, ו/או התגובה החיסונית של סרטן מודליטינג. מודל 3D ספרואיד שלנו הוא כלי רב עוצמה עבור גילוי של קבוצות מגוונות של אסטרטגיות טיפוליות לסרטן.

גידולים מוצקים לייצג רקמות מורכבות המורכב מתאים נאופלסטיים ומגוון גדול של תאים סטרומה1,2,3,4. סטרומה פיברותקיעות, או סרטן הקשורים פיברותקיעות (קפה), הם אחד האוכלוסיות הבולטות של תאים סטרומה ברוב סוגי גידולים מוצקים. הם מעורבים אנושות בוויסות צמיחת הגידול, סטדיות, גרורות, אנגיוגנזה, ועמידות בפני סמים באמצעות ייצור גורמי גדילה, ציטוקינים/נוגדנים, סינתזה של ecm ואנזימים שיפוץ (למשל, קולגן, פיברוטין, ומטריקס מטאלופרוטסיס), שחרור אקסוזומים, ואינטראקציה ישירה של תא לתא הטרוטיפקס5,6,7,8,9,10,11 . קפה גם לקחת חלק בקביעת גרורות האיבר הספציפי לסרטן ידי מראש בחירת תת קבוצה של שיבוטים הגידול מאוכלוסיות הטרוגנית תאים סרטניים בנגע העיקרי וטיפוח אלה שיבוטים שנבחרו להיות מוכן גרורות לאיבר מרוחק ספציפי אשר מיקרוסביבה אופטימלית לצביעה מפני השיבוטים של שיבוטים שנבחרו12. יתר על כן, פיברותקיעות וגורמים מסיסים המופרשים שלהם ecm להשתתף באפנון של אנגיוגנזה הגידול13,14, נגד הגידול התגובה החיסונית15, והם מעורבים גם התנגדות לסמים והגידול מהישנות16,17.
בשנת מתורבת 3d הגידול מודלים ספרואיד פותחו ומשמש מחקר הסרטן כמודל ביניים בין תרביות תאים מבחנה בסרטן ובדגמי גידול vivo18,19,20,21. מודלים 3D הגידול ספרואיד זכו לפופולריות במחקר תאי גזע סרטן, טרום קלינית לחקר הסרטן, והקרנת סמים משום שמודלים אלה לשכפל כמה תכונות חשובות של גידולים אמיתיים שנעדרים ב-2D מסורתית מונאולאיירס22. רבים קיימים 3D הגידול מודלים ספרואיד היוו אך ורק של תאים סרטניים וחוסר השתתפות של תאים סטרומה הגידול. זה לעתים קרובות תוצאות spheroids הגידול נתקל לא מספיק התצהיר ECM והיעדר אינטראקציות תא תאים הטרוטיפקס. קונבנציונאלי 3D spheroids נוצר באופן בלעדי על ידי תאים סרטניים הומוטיפקס תא התא הדבקה עשוי רק חלקית לחקות את התנאים vivo של רקמות הגידול. כדי להתגבר על חלק ממגבלות אלה, החוקרים הציעו לשלב סוגים מרובים של תאים סטרומה בתרבויות 3d ופיתח מספר הטרוטיפ 3d גידול ספרואיד מודלים23,24,25,26,27. בנוסף, החוקרים המועסקים מטריצות 3d אקסוגני, כולל הידרוג'לים טבעיים או פולימרים סינתטיים כגון פוליאתילן גליקול, פולי (lactide-co-גליקולדה), ו פולי (N-איזוקטילאמילאמיד), להטביע מודלים מונותאיים ומרב הספרואיד, יצירה של סביבה תומכת בתאים ומשחזר אינטראקציות תאים מטריצות28,29, ובכך להפוך את המערכות ה עם זאת, שילוב של סוגים מסוימים של תאים סטרומה, כגון תאים אנדותל, בתרבויות 3D מביא על מורכבות נוספת עבור מערכת מבחנה ומקשה על ללמוד אינטראקציות תא תאים הטרוטיפקס בין שני סוגים ספציפיים של תאים, כגון אינטראקציות תאים סרטניים הפיצוץ. יתר על כן, תאים אנדותל ברקמות אמיתי לא תמיד אינטראקציה ישירה עם תאים סרטניים ותאים אחרים סטרומה כי יש שכבה של קרום המרתף עטוף מחוץ נימים המונע תאים אנדותל מאינטראקציה ישירה עם תאים סרטניים ותאים אחרים סטרומה. במודלים ספרואיד תלת-ממדיים, משולבים בתאי האנדותל, אינם יוצרים בעצם כלי דם, אך מתקשרים ישירות עם תאים סרטניים ותאי סטרומה אחרים, דבר שלעיתים נדירות מתרחש בvivo. באופן דומה, מטריצות אקסודוגני המועסקים בכמה מודלים ספרואיד תלת-ממד אינם זהים ECM ברקמות הגידול האמיתי במונחים של מבנה וקומפוזיציה. כל התנאים המלאכותית האלה עלולים לגרום לנתונים מטעים.
לאחרונה יצרנו מודל חדש של 3D ספרואיד מגוון מורכב של תאים סרטניים ו-בית קפה. במודל שלנו, היווצרות spheroids הגידול 3D נקבע לחלוטין על ידי קפה. קפה לגרום ולווסת את הפנוטיפ של גזע הגידול/מתחיל תאים. ECM המיוצר על ידי קפה הוא טבעי ומאפשר את המבנה desmoplastic כדי לחקות טוב יותר את vivo הגידול בסביבת מיקרו. זה מודל 3D הרומן יכול להיות כלי שימושי עבור הקרנת תרופות לסרטן ומציעה פלטפורמה ייחודית ללמוד אינטראקציה הגידול משתית, להבהיר כיצד לווסת את הסרטן גזע/ייזום תאים, ולחקור את המעורבות של אינטראקציות סטרומה בסרטן רגישות לתרופות והתנגדות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-253-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351147</td>
			<td>Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 1.5 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-2674</td>
			<td>500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation</td>
			<td>Dako</td>
			<td>x0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase Grade II</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>165859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium(DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VMR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Premium Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Free for downloading, no license needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte Zoom 2016A</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte Zoom System</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 Medium (Leibovitz)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP5 Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 153 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7403-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti &#945;-SMA (smooth muscle actin), monoclone</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olymupus CellSens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Selleckchem Chemicals</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002- CI</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate 7.5%</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-035-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel stromal fibroblast-modulated 3d tumor spheroid model for studying tumor-stroma interaction and drug discovery

הגידול-משתית אינטראקציות לשחק תפקיד חשוב בהתקדמות הסרטן. תלת מימדי (3D) מודלים הגידול ספרואיד הם הנפוצים ביותר במודל מבחנה במחקר של סרטן גזע/ייזום תאים, טרום קלינית לחקר הסרטן, והקרנת סמים. 3D מודלים ספרואיד הם מעולים על התרבות הקונבנציונלית תאים סרטניים ולשכפל כמה תווים חשובים של גידולים מוצק אמיתי. עם זאת, קונבנציונאלי 3D הגידול מורכב באופן בלעדי של תאים סרטניים. הם חסרי השתתפות של תאים סטרומה הגידול ואין להם מספיק מטריצה החילוץ (ECM) התצהיר, ובכך רק חלקית מחקה את התנאים vivo של רקמות הגידול. הקמנו מודל חדש מדור 3D ספרואיד מורכב מתאי הגידול סטרומה פיברותקיעות כי טוב יותר מחקה את הvivo הגידול הטרוגנית מיקרוסביבה הdesmoplasia שלה יליד. היווצרות של spheroids מוסדר באופן מוחלט על ידי מסטרומה הגידול פיברותקיעות והוא נקבע על ידי הפעילות של מסלולים מסוימים המכריע מאוד תאיים (למשל, איתות חריץ) ב פיברוביטים מסטרומה. במאמר זה, אנו מציגים את הטכניקות של התרבות התאית של תאים סרטניים מסטרומה, הדמיה זמן לשגות כדי להמחיש אינטראקציה תא תאים, ו מיקרוסקופ קונפוקלית כדי להציג את התכונות האדריכליות 3d של spheroids. אנו מראים גם שתי דוגמאות של היישום המעשי של מודל זה ספרואיד תלת-ממד. מודל זה הרומן מסחר 3D ספרואיד מציעה פלטפורמה שימושית ללימוד הגידול משתית, להבהיר כיצד סטרומה לווסת סרטן גזע/ייזום תאים, אשר קובעים את התקדמות הגידול ותוקפנות, ולחקור מעורבות של תגובת סטרומה ברגישות לתרופות בסרטן והתנגדות. הפלטפורמה הזאת יכולה להיות גם. מודל מתורבת לגילוי סמים

פיתחנו שיטה הרומן כדי ליצור spheroids תלת-ממד עם מערכת הטרוטיפקס תא מבחנה הטרוסקסואלים שמחקה את vivo מיקרוסביבה גידול. פיברותקיעות נגזרת מעור העכבר פיברותקיעות. העור פיברותקיעות נוצרו כמתואר לעיל היו מאופיינים כα-SMA+/vimentin+/vimentin+ תאים. תאים מלנומה גרורתית האדם (C8161) היו מתורבתים במדיום W489 כמתואר32. כדי להמחיש ולהבחין בפיברוהכדורים מתאי הגידול, פיברותקיעות ותאי מלנומה התעברו מראש עם gfp/הנגיף ו-dsred/הנגיף, בהתאמה34,36, לפני התרבותcoculture תאים.
איור 1 מציג דוגמה של מטבעות 3d spheroids הנוצר על ידי תאי מלנומה coculturing ופיברופיצוצים. מלנומה תאים תרבותיים בהעדר פיברופיצוצים לא הטופס האופייני spheroids 3D, למרות כמה תאים מלנומה טופס אשכולות 2D/אגרגטים עם התרבות המורחבת. הגודל הממוצע של spheroids היה כ 170 – 360 יקרומטר בקוטר (ממוצע = 275, SD = 37) ביום ~ 5-7. באמצעות הדמיה בזמן ההדמיה, הבחנו כי גידולים בתאי הגידול המגע בתרבות coculture החלה ליצור spheroids 3D בסביבות 36 h של התרבות הcoculture כפי שמוצג בווידאו 1. הדמיה זמן לפקיעה הקליט את התהליך הדינמי של אינטראקציה תא התא ואת השלב ההתחלתי של היווצרות ספרואיד ב ~ 4-52 h של התרבות הקובית. השיא של מבנה ספרואיד תלת-ממדי התרחש בסביבות יום ~ 5-7. Spheroids שנוצרו 3D היו מורכבים מסרטן התאים ומלנומה, שם הרוב (~ 80%) היו תאי גידול וידאו 2 מראה את התהליך הדינמי של תאים מלנומה בודדת תרבותית (dsred+/c8161) בהקמת אשכולות תא/אגרגטים החל מ ~ 4 – 52 h בתרבות אחת. היווצרות אשכולות 2D/אגרגטים לשיאה בסביבות יום ~ 7 – 10. וידאו 3 ו- video 4 הצג את המבנים של ספרואיד תלת-ממד ואת האשכול תא הגידול 2d דמיינו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, בהתאמה. 3D ספרואיד ואשכולות תא הגידול 2D נבדקו על ידי המיקרוסקופיה מיקוד ביום 7 של תרבות התאים. וידאו 5 מראה כי spheroids 3d הושעו במדיום התרבות וניידים, בעוד וידאו 6 מראה כי האשכול תא הגידול 2d היה מצורף לצלחת התרבות משותק. השעיה במדיום היא תכונה של spheroids 3D המבדיל אותם מאשכולות 2D. כאשר המדיום בצלחת תרבות התא או היטב מופרע על ידי שחרור או בעדינות ללטף את מדיום התרבות, להעביר את התלת-ממד מושעה 3d, ואילו אשכולות תא 2d הם משותק. רק כמה תאים מתים. בודדים ניידים
איור 2מראה דוגמא של דגם תלת-ממד זה המשמש כפלטפורמה ייחודית לחקר אינטראקציות הגידול משתית וכדי להבהיר כיצד Notch1 מסלול הפעילות המסלול בבית קפה מווסת גזע הסרטן/ייזום תאים והיווצרות ספרואיד. שני זוגות של פיברותקיעות (פנסיון מלא) מבודדים מן העור של רווח הפונקציה Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.היצור+/-; העכבריםשל רוזה LSL-N1IC +/+) לעומת השליטה המקבילה שלהם (gofctrl : FSP1. יצור-/-; N1IC+/+) עכברים ואובדן הפונקציה Notch1 (lofNotch1: Fsp1.יצור+/-; Notch1loxp/loxp+/+) עכברים לעומת השליטה המקבילה שלהם (lofctrl : FSP1. יצור-/-; Notch1loxp/loxp+/+) עכברים35, בהתאמה. כל פיברוהפיצוצים התעברו על ידי GFP/לנטיגוירוס ו cocultured תרבית עם תאי מלנומה C8161 מראש עם DsRed/הנגיף. זמן הדמיה מראה כי Fb-GOFNotch1 עצר C8161 תאים מלנומה מיצירת 3d spheroids לעומת FB-gofctrl במהלך הראשון ~ 4-52 h של התרבות הסלולרית. לעומת זאת, Fb-LOFNotch1 היווצרות קידם של 3d spheroids על ידי C8161 תאים מלנומה לעומת FB-lofctrl. איור 2B, טופ, מציג תמונות מייצגות של Spheroids 3d שנוצרו ביום 7 של התרבות התאית עם שונים בעלי שונות ביצוע פעילויות מסלול מגוונות. איור 2B, למטה, מציג את הנתונים הכמותיים על הגודל הממוצע של 3d spheroids שנוצרו ביום 7 של התרבות התאית עם שונים בגידולים שנושאים מגוון פעילויות מסלול.
איור 3 מראה דוגמה של דגם תלת-ממד זה המשמש כדי לבדוק את תגובת התרופה של הסרטן גזע/מתחיל תאים. סרטן גזע/ליזום תאים הוכחו להיות אחראי על עמידות לסמים וסרטן הישנות. לכן, הערכת תגובת התרופה באמצעות דגם תלת-ממד זה יכול לחשוף טוב יותר את היעילות הקלינית של התרופה לטיפול בסרטן. התאים מלנומה C8161 להסתמך על איתות MAPK פעיל עבור צמיחת תאים ופלישה. הם גם מבטאים רמות גבוהות של CDK4/Kit, אבל לא לשאת מוטציה BRAF. כדי לבדוק את תגובת התרופה של סרטן גזע/ליזום תאים כלפי מעכבי MAPK באמצעות מודל זה 3D, אנו מC8161 תאים מלנומה ופיברופיצוצים ב 24 לוחות טוב. PD0325901 (ראה טבלת חומרים), מעכב mapk, הוכן בדילול סדרתי בטווח של ריכוזים מ-1 ננומטר, 2.5 nm, 5 ננומטר, 10 ננומטר, ו 25 ננומטר. הPD0325901 התווסף לתרביות התא כאשר תערובות תאים מצופה. תאים שאינם מטופלות בשימוש שימשו כשליטה. אנו העריכו את היכולת היווצרות ספרואיד של התרבויות התא תחת ריכוזי סמים שונים והשווה אותו עם שליטה ללא טיפול. איור 3מראה תמונות מייצגות של Spheroids 3d שנוצרו ביום 5 של התרבות התא תחת ריכוזי סמים שונים. איור 3ב הוא נתונים כמותיים של הגודל הממוצע לבין ספרואיד ומספרים של Spheroids תלת-ממד שנוצרו לפי שדה כוח נמוך (lpf x 4) ביום 5 של התרבות התאית בתוך ריכוזי סמים שונים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig01.jpg"> איור 1: היווצרות הספרואידים תלת-ממדיים ואשכולות דו-ממדיים. (A) דמות מייצגת של spheroids 3d נוצר על ידי התרבות האנושית של תאים מלנומה C8161 האדם והעור העכבר פיברותקיעות. Spheroids 3D צולמו ביום 7 של התרבות הקומדית של תאים מלנומה ופיברופיצוצים. הגדלים הממוצעים של הספרואידים היו ~ 170 – 360 יקרומטר בקוטר (ממוצע = 275, SD = 37) ביום ~ 5-7. המספר הממוצע של spheroids היה 18-26 (20.5 ± 3.6) לכל שדה כוח נמוך (LPF x4). (ב) דמות מייצגת של אשכולות תא הגידול 2d שנוצרו על ידי תרבות אחת של תאים מלנומה C8161. האשכולות תא מלנומה 2D צולמו ביום 7 של תרבות אחת של תאים מלנומה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig1alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig02.jpg"> איור 2: ההסבר של התפקיד של פעילות Notch1 מסלול איתות בקפה בתוך ויסות הסרטן גזע/ייזום תאים באמצעות מודל 3D ספרוoid. (A) תאיים Notch1 איתות פעילות מסלול בבית קפה נקבע את היווצרות של spheroids על ידי תאים מלנומה בתרבית התא. זמן פקיעה וידאו מראה כי Fb-GOFNotch1 עצר את היווצרות של 3d spheroids על ידי תאים מלנומה C8161, בעוד FB-LofNotch1 קידם את היווצרות של יותר 3d spheroids על ידי מלנומה C8161 תאים במהלך הראשון 4-52 h של התרבות התאית. (ב) למעלה: תמונות מייצגות של spheroids תלת-ממדיים שנוצרו ביום 7 של התרבות התאית עם בריפומות שונים הנושאים מגוון פונקציות מסלול חריץ. למטה: הנתונים הכמותיים של הגודל הממוצע (קוטר [μm]/ספרואיד) של 3D spheroids שנוצרו ביום 7 של התרבות התאית עם פיברופיצוצים שונים הנושאים פעילויות מסלול מגוונות. מבחן ה-t של סטודנט דו-זנבי שימש לניתוח סטטיסטי. הנתונים מבוטאים כמשמעות של ± סטיית תקן (SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig2alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig03.jpg"> איור 3: הערכת תגובת התרופה של הסרטן גזע/ייזום תאים באמצעות מודל ספרואיד תלת-ממד. (א) דמויות מייצגות של spheroids תלת-ממדיים שנוצרו ביום 5 של התרבות התא בריכוזים שונים של סמים. (ב) הנתונים הכמותיים של הגודל הממוצע (קוטר [μm]/ספרואיד) ומספר התלת-ממד של spheroids לכל שדה כוח נמוך (lpf x 4) נוצר ביום 5 של התרבות התאית בריכוזים של תרופות שונות. נתונים כמותיים מבוטאים כמשמעות של ± סטיית תקן (SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig3alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Screenshot 1" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid01.jpg"> וידאו 1: תהליך דינמי של היווצרות spheroids 3D בשלב המוקדם של התרבות התאית. זמן הדמיה ההדמיה מראה אינטראקציה תא תא דינמי בין תאים סרטניים ותאי הגידול בתרבות coculture היווצרות של 3D spheroids במהלך הראשון ~ 4-52 h של התרבות coculture. התאים החלו ליצור spheroids 3D סביב 48 h לאחר תחילת התרבות הקומדית. השיא של מבנה ספרואיד תלת-ממדי התרחש ביום ~ 5-7 (לא מוצג כאן). Spheroids תלת-ממד היו מורכבים בתאי הסרטן מלנומה, שם רוב (~ 80%) היו תאי גידול <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_1.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
<img alt="Screenshot 2" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid02.jpg"> וידאו 2: תהליך דינמי של היווצרות אשכולות 2D בשלב המוקדם של התרבות התאית. הדמיה של הזמן מראה את התהליך הדינמי של אשכולות דו-ממדיים שנוצרו על ידי C8161melanoma תאים בתרבות אחת. היווצרות אשכולות דו-ממדיים התרחשו בסביבות יום ~ 7 – 10. הדמיה זמן ההדמיה רשומות את התקופה של ~ 4 – 52 h בתרבות אחת של DsRed+/C8161 תאים מלנומה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_2.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
<img alt="Screenshot 3" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid03.jpg"> וידאו 3: אדריכלות וסיבוב של 3d ספרואיד כפי דמיינו על ידי קונפוקלית יקרוסקופיה. ארכיטקטורה וסיבוב של 3D ספרואיד. לייזרים ירוקים ואדומים שימשו כדי לסרוק את הספרואידים שנוצרו ביום 7 בתרבית תאים. אזור הסריקה נקבע תחת מטרה 10x. הסריקה מתחילה מלמטה לחלק העליון של הספרואיד ב-1 יקרומטר z-step. הסרט סיבוב 3D שספרואיד נוצר באמצעות תוכנת פיג'י. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_3.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
<img alt="Screenshot 4" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid04.jpg"> וידאו 4: אדריכלות וסיבוב תא הגידול 2d אשכול כפי שדמיינו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. ארכיטקטורה וסיבוב של אשכול דו-ממדי. תמונות confocal וקד של אשכולות התא נלקחו ביום 7 של התרבות היחידה של מלנומה תא. אזור הסריקה נקבע תחת מטרה 10x. הסריקה מתחילה מלמטה לחלק העליון של הספרואיד ב-1 יקרומטר z-step. הסרט סיבוב האשכול הדו נוצר באמצעות תוכנת פיג'י. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_4.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
<img alt="Screenshot 5" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid05.jpg"> וידאו 5: התנועה של 3D spheroids. הספרואידים התלת-ממדיים הושעו במדיום התרבותי ואינם דבקים בכלי התרבות. כאשר עדיין בינוני בתרבות התאים היטב היה מופרע על ידי ליטוף עדין, את הspheroids מושעה 3D זז. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_5.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
<img alt="Screenshot 6" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid06.jpg"> וידאו 6: יציבות של אשכולות תא הגידול 2D. אשכול תא הגידול 2D היה מעוגן ללוח התרבות ו משותק למרות הפרעה של מדיום התרבות. כמה תאים מתים. בודדים היו ניידים <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_6.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery at JoVE.com

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

המודל הרומן תלת מימדי המבוסס על האינטראקציה הטרולימית של תאי הגידול והריטרותקיעות מסטרומה. כאן, אנו מציגים התרבות הcoculture של תאים סרטניים מסטרומה, הדמיה של הזמן, ו מיקרוסקופ קונפוקלית כדי להמחיש את היווצרות של spheroids. זה מודל תלת מימדי מציע פלטפורמה רלוונטית ללמוד אינטראקציות הגידול משתית ולבדוק therapeutics סרטן.

סטרומה הרומן פיברוהפיצוץ-מודנן 3D הגידול מודל ספרואיד ללמוד אינטראקציה סרטניים-סטרומה וגילוי הסמים

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

פיתחנו מודל חדשני של כדוריות תלת מימדיות המציע פלטפורמה לחקר אינטראקציות סרטן-סטרומה ולבדוק טיפולים בסרטן. לדעתי, מערכת תלת מימד זו משלבת תאים סרטניים בסטרומה פיברובלסט כדי לחקות טוב יותר תנאי גידול אמיתיים ולכן יכולה להיות כלי רב עוצמה לגילוי תרופות. בנוסף, מודל זה אינו מוגבל ללמוד מלנומה.זה יכול לשמש כדי לחקור סוגים אחרים של סרטן. הדגמת ההליך תהיה ד"ר Hongwei שאו, מדען בכיר מהמעבדה שלי. עבור תרבות תאי מלנומה אנושית, לזרוק את התאים תחת תנאי תרבות תאים חסידים קונבנציונליים להשלים W489 בינוני ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני.כאשר התאים מגיעים ל- 90%confluency, פצל את התאים ביחס של 1 עד 5. עבור תרבות פיברובלסט עור העכבר, לשטוף את כדורי רקמה שנקטפו PBS לפני culturing הדגימות ו DMEM בתוספת 10 אחוז סרום שור עוברי, ואחוז אחד פניצילין-סטרפטומיצין באינקובטור תרבות התא. לפצל את התאים ביחס של אחד לשניים כאשר הם מגיעים לקונפליה של 90 אחוז.לפני הגדרת cocultures, fibroblasts זרע על צלחת 100 מילימטר בריכוז, כך הקונפדרציה התא יגיע כ 60 אחוז למחרת. למחרת בבוקר, להחליף את supernatant עם ריכוז של אחד עד שלושה עד חמישה של GFP כדי lentivirus מדולל מהמלאי בתרבות הרגילה בינוני בתוספת ארבעה מיקרוגרם למיליליטר של פוליברן. מניחים את התאים לתוך אינקובטור תרבות התא במשך שש שעות לפני החלפת supernatant עם מדיום תרבות טרי.לאחר יומיים, יש להתבונן באות GFP מהתאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאשר שתי תרבות התאים נותפו באופן הדוק, נתק את שתי תרבות התאים מ- 0.25 טריפסין-EDTA כדי לאסוף את המתלים של תא יחיד על ידי קנטוביגציה. להשעות מחדש את התאים פעמיים 10 עד 4 תאים למיליליטר של ריכוז בינוני coculture ולערבב את תאי מלנומה fibroblasts ביחס של אחד לאחד.לאחר מכן לראות שני מיליליטר של תאים לכל באר של צלחת 24 היטב ו triplicate עבור כל תנאי ולה מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך ארבע שעות כדי לאפשר לתאים לצרף לתחתית הצלחת. עבור תרבות סולו תא מלנומה להעריך היווצרות אשכול תאים 2D, לראות פעמיים 10 לתאי מלנומה הרביעי לתוך כל באר של 24 גם צלחת ותרבות התאים במשך שבעה עד 10 ימים באינקובטור תרבות התא. ואז לצלם את התאים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך על פי פרוטוקולים מיקרוסקופיים פלואורסצנטיים סטנדרטיים.אם מערכת ההדמיה של זמן ההדמיה כבויה, הפעל אותה לפחות שעה אחת לפני ההדמיה. כאשר המערכת מוכנה, בזהירות להעביר את צלחת התרבות לשלב של מיקרוסקופ להחליק את החממה ולנעול את הדלת בבטחה. פתח את התוכנה של מערכת הדמיה לשגות זמן ולחץ להוסיף כלי כדי לבחור את סוג הלוח ואת היצרן כך מיקרוסקופ יכול לאתר את אזור הסריקה במדויק.בחר עדשה אובייקטיבית 10 פעמים ואת הבארות של עניין ולהגדיר את הפרמטרים עבור אזור הסריקה, את זמן המרווח בין הסריקות ואת זמן ההתחלה והסיום. ואז להקליט את הדמיה לשגות זמן מארבע עד 52 שעות. בסוף הקלטת התמונה, השתמש בתוכנת מערכת ההדמיה של זמן לשגות כדי לאחזר את הנתונים ולייצא את קטעי הווידאו שנאספו או ערכות תמונה.להדמיה מיקרוסקופית קונפוקאלית של cocultures, מניחים את הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך ולבחור את קרני לייזר אדום וירוק. שימו לב לתאים תחת מטרה של פי 5 או 10 ובחרו את הכדור כדי להתחיל בסריקה. באמצעות מיקרון z-צעד אחד, לסרוק מלמטה לראש הכדור.לאחר מכן עבד את הנתונים באמצעות תוכנת עיבוד התמונה המתאימה כדי לבנות מחדש תמונה תלת-מימדית שניתן לסובב ולשמר עוד יותר כסרט תלת-מימדי. כאן מוצגות תמונות של כדוריות תלת-מימדיות רב-תאיות שנוצרו על ידי תאי מלנומה ותאי פיברובלסטים. תאי מלנומה מתורבתים בהעדר פיברובלסטים אינם יוצרים כדוריות תלת-מימדיות טיפוסיות, אם כי חלק מתאים מלנומה יוצרים אשכולות דו-מימדיים עם תרבות מורחבת.באמצעות הדמיה לשגות זמן, fibroblasts ותאי הגידול ניתן לראות אינטראקציה coculture, החל ספרואידים בערך 36 שעות. בסרט זה, ניתן לראות את התהליך הדינמי של היווצרות צבירה של תאי מלנומה מתורבתים בודדים מארבע עד 52 שעות של תרבות. כאן, מבנה ספרואיד 3D ניתן לראות על ידי מיקרוסקופיה confocal לאחר שבעה ימים של תרבות, בעוד בסרט זה, אשכול תאים 2D ניתן לדמיין.כדוריות תלת מימדיות נשארות תלויות בתרבות בינונית וניידות, בעוד אשכולות תאים סרטניים 2D נוטים לצרף את צלחת התרבות והם חסרי תנועה. מודל תלת מימד זה משמש כפלטפורמה ייחודית לחקר אינטראקציות גידול-סטרומה. לדוגמה, להבהרת האופן שבו Notch1 בין תאי איתות פעילות מסלול וסרטן הקשורים fibroblasts לווסת את גזע הסרטן וייזום היווצרות תאים וספורואידים.בנוסף, מודל זה יכול לשמש כדי לבדוק את התגובות התרופה של גזע סרטן וייזום תאים. למרות ששיטה זו היא פשוטה וישר קדימה, יש לדאוג להשתמש בצפיפות התאים ויחס התאים הנכונים, ולהשתמש בצלחות התרבות המתאימות כפי שהוכח. מודל 3D זה יכול להיות מיושם גם עבור או sedating חיוני פעילות מסלול איתות תאית לקביעת פנוטיפים של תאי גזע סרטניים, כמו גם הקרנת תרכובות מולקולה קטנה אשר תאי גזע סרטניים רגישים מאוד.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

טיפול בדיקות במודל תרבות המבוסס ספרואיד Cell תלת-ממד עבור קרצינומה של תאים קשקשיים בצוואר ואחראי

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

מהדור בתפוקה גבוהה תלת מימדי הגידול Spheroids להקרנה סמים

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

ניתוח גידול ורקמות התפלגות של נוגדן טיפולי ספציפי אנטיגן היעד

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

מודל ביומימטי לסרטן הכבד לחקר אינטראקציות גידול-סטרומה בסביבה תלת מימדית עם תכונות ביו-פיזיקליות מתכווננות

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

מודל ספרואידי תלת מימדי לחקר האינטראקציה בין גידולים סרטניים בקרצינומה הפטוקולרית

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis

פלטפורמת גילוי חזקה לזיהוי מתווכים חדשים של גרורות מלנומה

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was ...