Name: a novel stromal fibroblast-modulated 3d tumor spheroid model for studying tumor-stroma interaction and drug discovery
Uploaded: 2020-02-28T12:00:00
Duration: 7 min 20 s
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오마다 C. 벨라스케스 박사(마이애미 대학교)에게 도움이 되는 협력, 상담 및 토론에 감사드립니다. MeWo 세포를 제공하기 위한 지 리 박사(마이애미 대학교); 그리고 박사 Meenhard Herlyn (위스타 연구소) 다른 모든 흑색종 세포를 제공하기위한. 우리는 또한 마시아 불리나 박사에게, 화상 진찰 분석을 위한 마이애미 대학 분석 화상 진찰 코어 시설의 이사 감사합니다. 류자오준은 뱅크헤드-콜리 암 연구 프로그램(어워드# 09BN-11), 여성암협회(53번째 연례 교부금) 및 마이애미 대학의 내부 기금의 보조금으로 지원되었다.

1. 흑색종 세포와 피부 섬유아세포 배양
<ol><li>인간 흑색종 세포 배양<ol>
<li>배양 인간 흑색종 세포,C8161(31)은 37°C 인큐베이터에서 완전한 W489 배지(단계 1.2 참조)에서 통상적인 부착 세포 배양 조건 하에서 5%CO2를 구비한 경우32. 그들은 ~ 90 % 합류에 도달 할 때 1 :5 비율로 세포를 분할.</li>
	</ol>
</li>
	<li>흑색종 세포 배양 배지 (W489)<ol>
<li>완전한 W489 배지의 경우 80% MCDB153 배지, 20% L-15 배지(재료 표참조), 2% 태아 소 혈청(FBS), 5 μg/mL 인슐린, 1.68 mM CaCl2,및 0.11% 중탄산나트륨을 사용하십시오. 공동 배양을 위해 FBS, 인슐린 및 CaCl2를추가하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스 피부 섬유아세포 분리<ol>
<li>기관의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 관련 지침 및 규정에 따라 마우스에서 1cm x 1cm 피부 조각을 잘라.</li>
		<li>하룻밤 동안 4 °C에서 디스파스 (재료 표참조)로 피부를 소화합니다. 표피에서 진피를 제거하고 콜라게나아제 (DMEM에서 1 mg / mL, 재료 표참조)로 밤새 소화하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스 피부 섬유아세포 배양<ol>
<li>37 °C /5 %CO2에서10 % FBS 및 1 % 페니실린 스트렙토 마이신으로 DMEM에서 조직 펠릿을 세척하고 배양하십시오. 그들은 ~ 90 % 합류에 도달 할 때 1 :2 비율로 세포를 분할.</li>
		<li>공동 배양 전에 표준 방법을 사용하여 GFP / 렌티 바이러스로 피부 섬유 아세포를 변환하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>면역 염색에 의한 마우스 피부 섬유아세포의 특성화<ol>
<li>염색을 위한 세포 준비<ol>
<li>2 x 104 세포 / 웰의 밀도로 24 웰 플레이트에서 피부 섬유 아세포를 씨앗. 2일째에는 PBS 2x로 세포를 세척하고 2% 중성 완충 포르말린으로 10분 동안 고정합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>면역 염색<ol>
<li>각 웰에 200 μL의 차단 용액을 추가하고 RT에서 30 분 동안 플레이트를 인큐베이션 한 다음 1 :200에서 희석 된 마우스 안티 α-SMA를 추가하고 37 °C에서 37 °C에서 배양하십시오.</li>
			<li>알렉스 플루어 488 염소 항 마우스 IgG를 1:400 희석시에 넣고 RT에서 1시간 동안 배양하고, PBS로 항체를 3x, 5분 씩 세척한다.</li>
			<li>1 μg/mL DAPI를 넣고 RT에서 2분 간 배양합니다.</li>
			<li>세포를 관찰하고 반전된 형광 현미경을 사용하여 이미지를 찍습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>사전 라벨링 섬유아세포및 흑색종 세포<ol>
<li>종자 섬유아세포는 1일째에 100mm 접시에 들어가 세포 융합이 다음날 ~60%에 도달합니다. 2일째에 배양배지를 제거하고 GFP/렌티바이러스(육수에서 희석한 것)를 폴리브레인 4 μg/mL로 일반 배양 배지에 넣습니다. 37°C 인큐베이터에서 6시간 동안 세포를 인큐베이터하고, 배지를 제거하고 신선한 정규 배양 배지로 대체한다. 2 일 후, 형광 현미경을 사용하여 세포로부터 GFP 신호를 관찰하십시오. 유사한 조건하에서 DsRed/렌티바이러스를 가진 C8161 세포를 변환합니다. GFP /렌티 바이러스 및 DsRed / 렌티 바이러스의 준비를위한 프로토콜은 이전에설명된 14,34.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세포 공동 문화
<ol><li>C8161-섬유아세포 동계를 종자화한다.<ol>
<li>스페로이드 형성 분석의 0일째에, 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 C8161 및 피부 섬유아세포 둘 다를 분리하였다. RT에서 5 분 동안 250g에서 세포를 회전시키고 PBS로 한 번 씻으하십시오.</li>
		<li>세포 동배 배지에서 세포를 재중단시하였다(혈청 프리, 인슐린 프리, 및 칼슘 프리 W489 배지와 무혈청 DMEM을 1:1 비율로 혼합). 세포 농도를 2 x 10 4 셀/mL로 조정합니다.</li>
		<li>C8161 세포를 섬유아세포와 1:1 비율로 혼합하고 24웰 플레이트의 각 웰에 세포 혼합물2 mL를 추가합니다. 각 웰은 각 유형의 셀에 2 x 104를 포함해야 합니다. 각 조건은 삼중으로 이루어져야 합니다. 참고: 비조직 배양 처리 플레이트를 사용하는 것이 중요합니다(재료 표참조). 그렇지 않으면 세포가 플레이트에 강하게 부착되어 스페로이드를 일시 중단 할 수 없습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포가 플레이트에 부착될 때까지 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션한 다음, 각 분석에 대해 표시된 시점에서 타임랩스 이미징 또는 공초점 스캐닝을 수행한다.</li>
</ol>3. 라이브 셀 타임랩스 이미징
<ol><li>공동 배양 전에 제조업체의 지침에 따라 시간 경과 이미징 시스템(재료 표참조)을 켜고 인큐베이터가 37°C 및 5%CO2에도달하도록 합니다. 시스템이 평형에 도달하는 데는 보통 1시간이 걸립니다. 조심스럽게 인큐베이터 내부 현미경의 무대에 배양 판을 배치하고 안전하게 문을 잠급전.</li>
	<li>타임랩스 이미징 시스템의 소프트웨어를 열고(재료 표참조) 현미경이 스캐닝 영역을 정확하게 찾을 수 있도록 플레이트 유형 및 제조업체를 선택합니다. 관심 있는 우물과 10배 대물 렌즈를 선택하십시오. 스캔 영역에 대한 설정, 스캔 사이의 간격 시간 및 시작 및 종료 시간을 선택합니다. 이 프로토콜에서 1웰의 스캐닝 영역에 대한 최대 형식 번호는 36이고 간격 시간은 1시간입니다.</li>
	<li>4-52 시간에서 기록 시간 경과 이미징. 참고: 시작 시간, 종료 시간 및 기간은 셀 유형 및 실험 의 목적에 따라 최적화되어야 합니다.</li>
	<li>이미지 녹화를 완료할 때 타임랩스 이미징 시스템 소프트웨어를 사용하여 데이터를 검색하고 비디오 또는 이미지 세트를 내보냅니다.</li>
</ol>4. 공초점 현미경 및 3D 영화
<ol><li>반전형광 현미경의 단계에 세포 동배 판을 놓고 (재료 표참조) 적색 및 녹색 레이저 빔을 사용합니다. 5x 또는 10x 대물 렌즈 의 밑에 세포를 관찰하고 스캐닝을 시작하는 스페로이드를 선택하십시오.</li>
	<li>1 μm z-스텝을 사용하여 스페로이드의 아래에서 위쪽으로 스캔합니다. 이미지 처리 소프트웨어(재료 표참조)를 사용하여 데이터를 처리하여 3D 동영상으로 더 회전하고 저장할 수 있는 3D 이미지를 재구성합니다.</li>
</ol>5. 흑색종 세포의 단독 배양 및 2D 클러스터 /응집체 형성
<ol><li>종자 2 x 104 C8161 흑색종 세포는 섹션 2.1에 기재된 바와 같이 24웰 플레이트의 각 웰내로. 7-10 일 동안 세포를 배양하고 반전 된 형광 현미경을 사용하여 사진을 찍습니다.</li>
</ol>6. 3D 스페로이드 및 2D 세포 클러스터/응집체가 중간 면에 매달려 있거나 플레이트에 부착되었는지 확인
<ol><li>세포 공조의 경우 7일째에 형성된 3D 스페로이드를 확인하십시오. 단일 셀 배양의 경우 10일째에 형성된 2D 클러스터/집계를 확인합니다.</li>
	<li>반전형광 현미경의 플랫폼에 세포 배양 판을 설정합니다. 주사기로 구부러진 바늘을 잘 넣고 배양 배지를 안팎으로 부드럽게 흡인하여 우물에서 배양 배지를 방해한다. 동영상 소프트웨어의 동영상 모드를 사용하여 이 프로세스를 기록합니다(재질 표참조). 3D 스페로이드는 이동이 되지만 2D 셀 클러스터/집계는 확고하게 유지됩니다.</li>
</ol>7. 3D 스페로이드의 공초점 이미지
참고: Cocultured 세포는 사용된 섬유아세포의 모형에 따라서 48-72 시간에서 스페로이드를 형성하기 시작합니다. 일반적으로, 스페로이드는 시간이 지남에 따라 점차적으로 확대됩니다. 작은 스페로이드는 7 일째까지 더 큰 스페로이드를 형성하기 위해 융합 할 수 있습니다. 스페로이드의 크기가 안정되면 10 일 이상 지속될 수 있습니다. 그 후, 스페로이드는 종종 배양 판의 바닥에서 분리하고 우물의 중심에 모여. 스페로이드의 확대 도중, 센터에 있는 세포는 일반적으로 부족한 영양 및/또는 유독한 미세 환경 때문에 정지합니다. 따라서, 성숙한 스페로이드를 이미지화하기 위한 3D 스페로이드 형성 및 타이밍의 피크는 파일럿 실험을 사용하여 최적화되어야 한다. 이 프로토콜을 위해, 공초점 현미경 검사는 spheroids가 성숙하고 spheroids의 센터에 있는 세포가 중앙에 있는 세포의 형광 그리고 형태에 따라 아직도 살아 있을 때 7 일의 주위에 행해졌습니다.
<ol><li>공초점 현미경 검사를 수행하려면 녹색 및 빨간색 레이저를 사용하여 스페로이드를 스캔하십시오. 10x 목표 하에서 스캐닝 영역을 결정하고 1 μm z-step으로 스페로이드의 아래에서 위쪽으로 이동합니다.</li>
	<li>이미지 프로세싱 소프트웨어(예: ImageJ)의 3D 프로젝션 기능을 사용하여 3D 스페로이드 형성 및 회전 비디오를 생성합니다.</li>
</ol>8. 세포 내 노치1 암 줄기 /발신 세포의 기질 조절을 결정하는 신호 경로 활동
<ol><li>피부 섬유아세포의 탈리 및 기능 상실 노치1 마우스의 분리 및 특성화<ol>
<li>유전자 변형 마우스의 두 쌍에서 피부 섬유 아세포 분리: 기능의 이득 Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; ROSALSL-N1IC+/+마우스 대 그들의 대응 제어 (GOFctrl : FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC+/+마우스 및 기능 상실 노치1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; Notch1LoxP/LoxP+/+마우스 대 그들의 대응 제어 (LOFctrl : FSP1. Cre-/-; 노치1LoxP/LoxP+/+마우스31개,각각. 섹션 1.3-1.5에 기재된 프로토콜을 사용하여 피부 섬유아세포를 분리하고 특성화한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>GFP/렌티바이러스로 마우스 피부 섬유아세포를 변환합니다.<ol>
<li>렌티바이러스 벡터로 세포를 변환하는 방법에 대한 섹션 1을 참조하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>섬유아세포와 흑색종 세포의 공동배양<ol>
<li>섹션 2에 기재된 바와 같이 세포 동배 실험을 수행하였다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D 스페로이드의 크기를 측정하여 암 줄기 /발사 세포의 기질 조절을 결정하는 섬유 아세포에서 세포 내 노치1 경로 활동의 효과를 평가<ol>
<li>스페로이드가 성숙 할 때 (섬유 아세포의 유형에 따라 5-7 일 의 성장 정지에 의해 표시)에 스페로이드를 촬영하여 각 조건하에서 스페로이드 형성의 정량화를 수행합니다. 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 3D 스페로이드의 크기를 측정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. 3D 스페로이드 분석실험을 사용하여 암 줄기/세포 의 약물 반응 테스트
참고: CAF는 암 이질성을 조절하고 암 줄기/세포 유발 세포의 표현형을 유도할 수 있습니다. CAF는 또한 임상 치료를 견딜 수 있도록 암 줄기/세포 를 지원합니다. 암 줄기 세포는 약물 내성을 담당하는 것으로 나타났습니다. 따라서, 우리는 암 줄기 /자극 세포의 약물 반응을 평가하기 위해이 3D 스페로이드 모델을 사용했다. 결과는 항암 약물의 잠재적인 임상 효험을 잘 평가할 수 있습니다.
<ol><li>약국<ol>
<li>24 웰 플레이트에서 세포를 규합한 직후, 파일럿 실험(즉, 1 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM 및 25 nM)에 기초하여 원하는 농도 범위의 5x에 도달하기 위해 배양 배지에서 직렬 희석으로 약물을 준비한다. cocultured 세포의 각 웰에 해당 약물 솔루션의 0.5 mL를 추가합니다. 위에서 언급한 바와 같이 대조군을 정규 동문화 매체로 취급한다.</li>
		<li>참고: MEK 억제제는 세포 배양 배지에서 용해된다. 따라서, 블랭크 대조군은 세포 배양 배지의 2.5 mL이다. 그러나, 약물이 수용성 용액에 용해되지 않고 DMSO와 같은 용매를 필요로 하는 경우, DMSO의 농도가 동일한 세포 배양 배지는 대조군에 적용되어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>스페로이드를 계수하여 약물 반응정량화<ol>
<li>형광 현미경을 사용하여 처리된 세포 및 처리되지 않은 세포를 관찰하고 매일 세포를 촬영합니다. 상이한 실험 군에서 스페로이드 형성을 정량화하고 상이한 약물 농도 하에서 세포 배양액의 스페로이드 형성 능력을 비교한다. 참고 : 스페로이드는 동문화 후 ~ 5-7 일 후에 나타나는 경향이 있습니다. 약물 효과 그 시점에서 눈에 띄는 될 것입니다.</li>
		<li>형광 현미경을 사용하여 웰의 스페로이드와 세포를 이미지/촬영한 다음 이미지 소프트웨어를 사용하여 시간이 지남에 따라 각 치료 그룹에서 저전력 장(LPF x 4)에 형성된 스페로이드의 평균 크기와 스페로이드 수를 계산합니다. 참고: 효과적인 약물 치료를 받는 세포는 대조군에 비해 스페로이드가 적거나 전혀 없어야 합니다. 이것은 암 줄기 세포를 억제에 테스트 된 약물의 효과의 표시.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems+modeling+tumor+growth+determinants+in+cancer+target+discovery.">3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery.</a> Advanced Drug Delivery Review. 69-70, 29-41 (2014).</li><li>Bulin, A. L., Broekgaarden, M., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+high-throughput+image+analysis+for+therapeutic+efficacy+of+architecturally+complex+heterotypic+organoids.">Comprehensive high-throughput image analysis for therapeutic efficacy of architecturally complex heterotypic organoids.</a> Scientific Reports. 7, 16645 (2017).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+spheroid+based+on+a+triple+coculture:+A+novel+3D+model+to+mimic+pancreatic+tumor+complexity.">Multicellular spheroid based on a triple coculture: A novel 3D model to mimic pancreatic tumor complexity.</a> Acta Biomaterialia. 78, 296-307 (2018).</li><li>Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Gu, L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+and+emerging+anticancer+therapeutics:+engineering+the+microenvironment.">Biomaterials and emerging anticancer therapeutics: engineering the microenvironment.</a> Nature Reviews Cancer. 16, 56-66 (2016).</li><li>Tevis, K. M., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedded+Spheroids+as+Models+of+the+Cancer+Microenvironment.">Embedded Spheroids as Models of the Cancer Microenvironment.</a> Advanced Biosystems. 1, (2017).</li><li>Welch, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+highly+invasive+and+spontaneously+metastatic+human+malignant+melanoma+cell+line.">Characterization of a highly invasive and spontaneously metastatic human malignant melanoma cell line.</a> International Journal of Cancer. 47, 227-237 (1991).</li><li>Balint, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Notch1+signaling+is+required+for+beta-catenin-mediated+human+primary+melanoma+progression.">Activation of Notch1 signaling is required for beta-catenin-mediated human primary melanoma progression.</a> Journal of Clinical Investigation. 115, 3166-3176 (2005).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs+:+biological+significance+of+bFGF.">Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF.</a> the American Journal of Pathology. 156, 193-200 (2000).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Notch1+Signaling+in+Cancer-Associated+Fibroblasts+Dictates+the+Plasticity+and+Stemness+of+Melanoma+Stem/Initiating+Cells.">Intracellular Notch1 Signaling in Cancer-Associated Fibroblasts Dictates the Plasticity and Stemness of Melanoma Stem/Initiating Cells.</a> Stem Cells. 37, 865-875 (2019).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+Pathway+Activity+Determines+the+Regulatory+Role+of+Cancer-Associated+Fibroblasts+in+Melanoma+Growth+and+Invasion.">Notch1 Pathway Activity Determines the Regulatory Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Melanoma Growth and Invasion.</a> PLoS One. 10, 0142815 (2015).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1-WISP-1+axis+determines+the+regulatory+role+of+mesenchymal+stem+cell-derived+stromal+fibroblasts+in+melanoma+metastasis.">Notch1-WISP-1 axis determines the regulatory role of mesenchymal stem cell-derived stromal fibroblasts in melanoma metastasis.</a> Oncotarget. 7, 79262-79273 (2016).</li><li>Kalluri, R., Neilson, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+and+its+implications+for+fibrosis.">Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 112, 1776-1784 (2003).</li><li>Price, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+models+in+immunodeficient+animals+:+I.+Nude+mice:+spontaneous+and+experimental+metastasis+models.">Xenograft models in immunodeficient animals : I. Nude mice: spontaneous and experimental metastasis models.</a> Methods in Molecular Medicine. 58, 205-213 (2001).</li><li>Spaeth, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS One. 4, 4992 (2009).</li></ol>

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

시험관 내 3D 세포 배양 기술은 암 연구에서 수십 년 동안 널리 사용되어 왔습니다. 기존의 2D 세포 배양 시스템에 비해 3D 미세 환경은 세포 세포 및/또는 세포 매트릭스 상호 작용을 재현하고 종양 조직에서 관찰되는 진정한 조건을 모방할 수 있게 합니다. 그러나, 암세포와 상형 세포 세포 상호작용에 의해서만 형성된 3D 시스템은 이종적 상호이야기의 중요성을 고려하지 않으며 연구에서 부정확한 결과를 제공할 수 있다. 우리는 최근에 암세포와 CAF를 결합하여 생체 내 이기종 종양 미세 환경과 그 원어민 및 뻣뻣한 탈모 성 반응을 더 잘 모방하는 새로운 3D 시스템을 개발했습니다.
섬유 아세포는 종양 기질의 주요 구성 요소입니다. CAF는 용해성 인자, ECM/리모델링 효소10,11및 엑소좀을 유도하여 종양 진행을 조절하는 데 관여합니다. 또한, CAF는 약물 내성 및 종양 재발에 한 몫을 한다16,17. 당사의 다세포 3D 스페로이드 시스템은 종양-기질 상호 작용의 분자 메커니즘을 탐구하고 약물 내성 및 종양 재발을 해결하는 데 활용할 수 있습니다. CAF는 주로 활성화된 국부 적시 섬유아세포로부터 유래되고 순환하는 골수 MSC를 모집하며, 이는 종양 조직37,38,39에서CAF로 의한 분화를 겪는다. 현재 연구에서는, 우리는 다세포 3D 스페로이드 모형을 만들기 위하여 피부 섬유아세포를 이용했습니다. 그러나, 다른 유형의 섬유아세포(예를 들어, MSC-DF)는 또한 종양 세포 3D 스페로이드 형성을 조절하는 피부 섬유아세포로서 매우 유사한 방식으로 작용한다(34) MSC-DF는 MC 세포 배양 배지에서 골수 단핵 세포를 약 10일 동안 배양하여 3일마다 주기적인 배지 변화를 배양함으로써 농축되는 골수 MSC로부터 생성될 수 있다. 이러한 MSC는 CD73+/ CD105+/ 린 - 특징. MSC를 섬유아세포로 분화하기 위해, MSC는 추가로 2주 동안 완전한 DMEM으로 배양된다. MSC-DF는 α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ 세포36으로특징지어진다. MSC-DF는 중요한 종양 조절제일 수 있다. 고형 종양의 많은 모형에 있는 CAF의 분율은 골수36에서풀어 놓인 모집된 순환 MSC에서 분화되기 때문에, MSC-DF는 유망한 처리 표적일 수 있습니다. 그(것)들은 또한 종양 조직에 모집되고 CAF로 분화되기 전에 훨씬 더 쉽게 치료조작되거나 표적으로 합니다. 따라서, 우리의 3D 모델은 암세포뿐만 아니라 CAF의 다른 분획 또는 하위 집단을 연구하고 테스트하는 이상적인 시스템을 제공합니다. 3D 스페로이드 형성 방법은 간단합니다. 중요한 단계는 동문화에 대한 혈청 무료 배지를 사용하여, 종양 세포에 섬유 아세포의 적당한 비율을 적용하고, 동문화에 적합한 배양 판을 사용하는 것을 포함합니다. 우리의 방법의 잠재적인 제한은 3D 스페로이드의 대형이 주로 암 세포주 의존적이다는 것입니다. 우리의 스페로이드 형성 프로토콜은 다른 암 세포주가 채택되는 경우에 섬유아세포와 암세포 사이 비율의 최적화를 요구할 수 있습니다. 우리는 3D 스페로이드의 형성을 위한 인간 흑색종 세포 및 마우스 섬유아세포 세포 cocultureing 모형을, 마우스 섬유아세포에 있는 GOF 또는 LOF 세포를 만드는 것이 훨씬 쉽기 때문에 분자의 역할 또는 종양 구형 형성에 있는 신호 통로의 역할을 연구하기 위하여 주의해야 한다. 인간 흑색종 세포 및 마우스 섬유아세포의 능력은 세포 통신을 위해 요구되는 분자가 교차 종을 작동한다는 것을 나타냅니다. 우리는 최근에 인간 흑색종 세포를 가진 인간 섬유아세포의 cocultureculture를 시험하고 인간 섬유아세포가 또한 3D 스페로이드를 형성하기 위하여 인간 흑색종 세포를 통제할 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다.
우리는 우리의 다세포 3D 스페로이드 모형에 인간 적인 전이성 흑색종 세포, C8161를, 이용했습니다. 우리는 또한 다른 인간 흑색종 세포를 시험했습니다, 예를 들면, BRAFV600E 돌연변이를 전송하는 1205Lu32,및 CDK4/Kit (ATCC HTB-65)의 상부를 표현하는 MeWo는, 또한 coculture에 있는 3D 스페로이드를 형성할 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 이것은 종양 세포에 의한 3D 스페로이드의 형성이 종양 발생 돌연변이의 유형과 독립적임을 나타냅니다. 우리는 비 흑색종 종양 세포의 그밖 모형이 섬유아세포로 3D 스페로이드를 형성할 수 있는지 시험하지 않더라도, 우리의 사실 인정은 3D 스페로이드의 대형이 흑색종 세포주에 한정되지 않으며 특정 암 세포줄에 의존하지 않을 수 있다는 것을 표시합니다.
우리는 우리의 3D 스페로이드 모델의 실용적인 응용 프로그램의 두 가지 예를 보여 주었다. 한 가지 예는 암 줄기/세포 표현형 및 3D 스페로이드 형성을 조절하는 세포내 노치 신호화 경로 활성을 해명하는 것이었다. 우리는 CAF에 있는 세포내 노치 신호 통로가 이 3D spheroid 모형을 사용하여 암 줄기/자극 세포의 표현형을 통제하는 분자 스위치이다는 것을 설명했습니다. 우리의 사실 인정은 암 줄기/자극 세포 및 암 이질성의 근본적인 기질 규칙의 근본적인 분자 기계장치를 밝힐 뿐 아니라, 또한 CAF에 있는 노치 통로가 흑색종 치료에 대한 중요한 표적이다는 것을 강조합니다. 이 예는 우리의 3D 스페로이드 모형이 암 세포 기질 섬유아세포 상호 작용을 위한 기계장치를 공부하고 잠재적인 치료 표적을 확인하기 위하여 아주 유용하다는 것을 표시합니다. 또 다른 예는 CAF의 존재에 있는 암 줄기/자극 세포의 약 반응을 시험하기 위한 것이었다. 암 줄기/세포 를 포함한 암세포의 약물 반응이 CAF의 존재와 부재에서 다양하다는 것은 잘 알려져 있습니다. 이 시험관 내 시스템에서 CAF의 존재는 이 모형을 더 임상적으로 관련성 있고 생성된 시험 결과를 더 믿을 수 있게 합니다. 또한, 우리의 3D 스페로이드 시스템은 다재다능하다. 다양한 용도로 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 약물 내성 암세포가 이 3D 모델에서 사용되는 경우, 약물 내성 및 어쩌면 종양 재발을 해결하기 위해 변경될 수 있다. 또한 암 치료를 위해 주로 CAF를 표적으로 하는 약물을 테스트하거나 선별하기 위해 수정될 수 있습니다. CAF는 최근 유망한 치료 표적이 되었습니다. CAF를 타겟팅하는 데는 장점이 있습니다. 첫째, 비정상적인 종양 세포와 비교하여 (종종 유전 적 변경으로) 스마트 (화학 요법 및 방사선 요법에 대한 저항력을 쉽게 얻을 수 있음) 종양 조직의 CAF는 정상 세포이며 유전적으로 더 안정적이므로 치료에 대한 내성을 개발할 가능성이 적습니다. 둘째, 표적화 CAF는 종양 세포에서 종양 발생 돌연변이의 유형에 의존하지 않는다. 셋째, CAF를 표적으로 하는 것은 섬유아세포 의존성 항종양, 항혈관신생 및/또는 변조암 면역 반응을 통해 다중 히트 효과를 달성할 수 있다. 당사의 3D 스페로이드 모델은 다양한 암 치료 전략을 발견할 수 있는 강력한 도구입니다.

고형 종양은 신생물 세포와 다양한 기질세포로구성된 복잡한 조직을 나타냅니다1,2,3,4. 기질 섬유아세포, 또는 암 관련 섬유아세포 (CAF)는, 고형 종양의 대부분의 모형에 있는 눈에 띄는 기질 세포 인구의 한개입니다. 그(것)들은 종양 성장 통제에서 비판적으로 관련시, 줄기, 전이, 혈관 신생, 및 성장 인자의 생산을 통한 약물 내성, 사이토 카인 / 케모카인, ECM 합성 및 리모델링 효소 (예를 들어, 콜라겐, 섬유넥틴 및 매트릭스 금속 loprotroteases), 엑소좀 의 방출 및 직접 이종 세포 상호 작용5,7,7,8,10,10 . CAF는 또한 1차 병변에서 이질적인 종양 세포 집단으로부터 종양 클론의 서브세트를 미리 선택하고, 선택된 클론을 특정 원거리 기관으로 전이하기 위해 프라이밍될 수 있도록 육성함으로써 암 장기 특이적 전이를 결정하는 데 참여한다12. 더욱이, 섬유아세포 및 이들의 분비된 용해인자 및 ECM은 종양 혈관신생13,14,항종양 면역 반응15의변조에 참여하고, 약물 내성 및 종양재발도 16,17에관여한다.
체외 3D 종양 스페로이드 모델은 시험관내 암 세포 배양및 생체내 종양 모델18,19,20,21사이의 중간 모델로서 암 연구에서 개발 및 사용되고 있다. 3D 종양 스페로이드 모델은 이러한 모델이 전통적인 2D 단층22에없는 실제 종양의 몇 가지 중요한 특징을 재현하기 때문에 암 줄기 세포 연구, 전임상 암 연구 및 약물 스크리닝에서 인기를 얻고 있다. 많은 기존 3D 종양 spheroid 모형은 종양 세포의 전적으로 구성되고 종양 기질 세포의 참가가 결여됩니다. 이것은 수시로 이종 세포 세포 상호 작용의 부족한 ECM 증착 그리고 부재를 갖는 종양 spheroids 귀착됩니다. 암세포 및 상동성 세포 세포 접착에 의해 독점적으로 형성된 종래의 3D 스페로이드는 종양 조직의 생체 내 조건을 부분적으로만 모방할 수 있다. 이러한 한계 중 일부를 극복하기 위해, 연구자들은 3D 배양에 여러 유형의 기질 세포를 통합할 것을 제안하고 여러 개의 이형형 3D 종양 스페로이드 모델23,24,25,26,27을개발하였다. 또한, 연구자들은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(락티드-코-글리콜) 및 폴리(N-isopropylacrylamide)와 같은 천연 하이드로겔 또는 합성 폴리머를 포함한 외인성 3D 매트릭스를 채택하여 단세포 및 다세포 스페로이드 모델을 포함하고, 세포 지원 환경을 조성하고 세포 매트릭스 상호 작용 28, 이와 관련된28, 28,이와 관련된28,이와 같은 생물학적 상호 작용을 재현하고 있습니다. 그러나, 3D cocultures에서 내피 세포와 같은 기질 세포의 특정 모형의 혼입은 시험관 내 시스템에 대한 추가 복잡성을 가져오고 암 세포 섬유아세포 상호 작용과 같은 세포의 2개의 특정 모형 사이 이종 세포 세포 상호 작용을 공부하는 것을 어렵게 만듭니다. 더욱이, 실제 조직에 있는 내피 세포는 암세포 및 그밖 기질 세포와 직접 상호 작용하는 내피 세포를 방지하는 모세혈관의 외부로 감싸진 지하 막의 층이 있기 때문에 항상 암세포 및 그밖 기질 세포와 직접 상호 작용하는 것은 아닙니다. 그 3D spheroid 모형에서는, 통합된 내피 세포는 실제로 혈관을 형성하지 않습니다, 아직 암세포 및 그밖 기질 세포와 직접 상호 작용합니다, 거의 생체 내에서 생기지 않는 무언가. 유사하게, 일부 3D 스페로이드 모델에서 채택된 외인성 행렬은 구조 및 조성측면에서 실제 종양 조직에서 ECM과 동일하지 않다. 이러한 모든 인공 적인 조건 오해의 소지가 데이터를 발생할 수 있습니다.
우리는 최근에 종양 세포와 CAF로 구성된 새로운 다세포 3D 스페로이드 모델을 만들었습니다. 우리의 모형에서, 3D 종양 스페로이드의 대형은 전적으로 CAF에 의해 결정됩니다. CAF는 종양 줄기/세포 의 표현형을 유도하고 조절한다. CAF에 의해 생성된 ECM은 자연적이고 탈모플라스틱 구조가 생체 내 종양 미세 환경을 더 잘 모방할 수 있게 한다. 이 새로운 3D 모델은 암 약물 스크리닝에 유용한 도구가 될 수 있으며 종양-기질 상호 작용을 연구하고, CAF가 암 줄기/세포 를 조절하는 방법을 설명하며, 암 약물 민감성 및 내성에서 기질 상호 작용의 개입을 탐구하는 독특한 플랫폼을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-253-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351147</td>
			<td>Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 1.5 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-2674</td>
			<td>500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation</td>
			<td>Dako</td>
			<td>x0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase Grade II</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>165859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium(DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VMR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Premium Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Free for downloading, no license needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte Zoom 2016A</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte Zoom System</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 Medium (Leibovitz)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP5 Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 153 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7403-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti &#945;-SMA (smooth muscle actin), monoclone</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olymupus CellSens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Selleckchem Chemicals</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002- CI</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate 7.5%</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-035-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel stromal fibroblast-modulated 3d tumor spheroid model for studying tumor-stroma interaction and drug discovery

종양 기질 상호 작용은 암 진행에 있는 중요한 역할을 합니다. 3차원(3D) 종양 스페로이드 모델은 암 줄기/세포, 전임상 암 연구 및 약물 스크리닝에 대한 연구에서 가장 널리 사용되는 시험관내 모델이다. 3D 스페로이드 모델은 기존의 종양 세포 배양보다 우수하며 실제 고형 종양의 몇 가지 중요한 문자를 재현합니다. 그러나, 통상적인 3D 종양 스페로이드는 종양 세포로만 구성된다. 그(것)들은 종양 기질 세포의 참가가 결여되고 부족한 세포외 매트릭스 (ECM) 침착이, 따라서 종양 조직의 생체 내 조건을 부분적으로 모방합니다. 우리는 더 나은 생체 내 이기종 종양 미세 환경과 그 네이티브 desmoplasia을 모방 종양 세포와 기질 섬유 아세포로 구성된 새로운 다세포 3D 스페로이드 모델을 설립했다. 스페로이드의 형성은 종양 기질 섬유아세포에 의해 엄격하게 조절되며 기질 섬유아세포에서 특정 중요한 세포 내 신호 경로 (예를 들어, 노치 신호)의 활성에 의해 결정됩니다. 이 문서에서는, 우리는 spheroids의 3D 건축 특징을 표시하기 위하여 종양 세포-기질 섬유아세포의 공동 배양, 세포 세포 상호 작용을 구상하는 시간 경과 화상 진찰 및 공초점 현미경 검사법을 제시합니다. 또한 이 3D 스페로이드 모델의 실용적인 적용사례두 가지예도 보여줍니다. 이 새로운 다세포 3D 스페로이드 모델은 종양-기질 상호 작용을 연구하고, 기질 섬유아세포가 암 줄기/시작 세포를 조절하는 방법을 설명하며, 종양 진행과 공격성을 결정하는 방법을 설명하며, 암 약물 민감성 및 내성에 대한 기질 반응의 개입을 탐구하는 유용한 플랫폼을 제공합니다. 이 플랫폼은 또한 약물 발견을 위한 시험관 내 모델일 수 있다.

우리는 생체 내 종양 미세 환경을 모방하는 체외 이종 세포 동문화 시스템을 사용하여 3D 스페로이드를 생성하는 새로운 방법을 개발했습니다. 섬유 아세포는 마우스 피부 섬유 아세포에서 파생됩니다. 피부 섬유아세포는 전술한 바와 같이 생성되었고 α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ 세포로 특징지어졌다. 인간 전이성 흑색종 세포(C8161)는32에기재된 바와 같이 W489 배지에서 배양되었다. 섬유아세포를 종양 세포로부터 구상하고 구별하기 위해, 섬유아세포와 흑색종 세포는 세포 배양 전에 각각34,36,GFP/렌티바이러스 및 DsRed/lentivirus로 전멸시켰다.
도 1은 흑색종 세포 및 섬유아세포를 coculturing으로써 형성된 다세포 3D 스페로이드의 예를 나타낸다. 섬유아세포의 부재에서 배양된 흑색종 세포는 전형적인 3D 스페로이드를 형성하지 않았지만, 일부 흑색종 세포는 확장된 배양체를 가진 2D 군집/응집체를 형성한다. 스페로이드의 평균 크기는 약 170-360 μm의 직경(평균 = 275, SD = 37)이었다~ 5−7. 타임랩스 이미징을 사용하여, 우리는 섬유아세포와 종양 세포가 동문화에서 상호작용하고 비디오 1에나타난 바와 같이 약 36시간 의 동문화에 3D 스페로이드를 형성하기 시작했다는 것을 관찰했습니다. 타임랩스 이미징은 세포-세포 상호 작용의 동적 과정과 동문화의 ~4-52시간에서 스페로이드 형성의 초기 단계를 기록했습니다. 3D 스페로이드 형성의 피크는 하루 ~ 5−7 주위에 일어났다. 형성된 3D 스페로이드는 섬유아세포와 흑색종 세포로 구성되었으며, 여기서 대다수(~80%)가 종양 세포였다. 비디오 2는 단일 배양에서 ~ 4-52 h에서 시작하는 세포 클러스터 / 응집체의 형성에서 단일 배양 흑색종 세포 (DsRed+/C8161)의 동적 과정을 보여줍니다. 2D 클러스터/응집체의 형성은 하루 ~7-10일 경에 정점에 달했습니다. 비디오 3 및 비디오 4는 공초점 현미경으로 각각 가시화된 3D 스페로이드 및 2D 종양 세포 클러스터의 구조를 보여 준다. 3D 스페로이드 및 2D 종양 세포 클러스터는 세포 공조의 7일째에 공초점 현미경으로 조사되었다. 비디오 5는 3D 스페로이드가 배양 배지 및 이동식에서 중단되었다는 것을 보여주고, 비디오 6은 2D 종양 세포 클러스터가 배양판에 부착되고 움직이지 않음을 보여준다. 배지내의 현탁액은 2D 클러스터와 구별되는 3D 스페로이드의 특징이다. 세포 배양 접시에서 배지가 배양 배지를 떨어뜨리거나 부드럽게 피펫팅하여 잘 교란될 때, 부유된 3D 스페로이드는 움직이지 않는 반면, 2D 세포 클러스터는 움직이지 않는다. 단 몇 개의 죽은 셀만 이동합니다.
그림 2A는 종양-기질 상호 작용을 연구하고 CAF에서 세포 내 노치1 신호 통로 활동이 암 줄기/발동 세포 및 스페로이드 형성을 조절하는 방법을 설명하는 독특한 플랫폼역할을 하는 이 3D 모델의 예를 보여줍니다. 기능 의 이득 노치1의 피부에서 분리 섬유 아세포의 두 쌍(Fb1: Fsp1.Cre+/-; ROSALSL-N1IC+/+마우스 대 그들의 대응 제어 (GOFctrl : FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC+/+마우스 및 기능 상실 노치1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; Notch1LoxP/LoxP+/+마우스 대 그들의 대응 제어 (LOFctrl : FSP1. Cre-/-; 노치1LoxP/LoxP+/+마우스35개,각각. 모든 섬유아세포는 GFP/렌티바이러스에 의해 변환되고 DsRed/lentivirus로 전이된 C8161 흑색종 세포로 배양되었습니다. 타임랩스 이미징은 Fb-GOFNotch1이 세포 공조의 첫 번째 ~4-52시간 동안 Fb-GOFctrl에 비해 3D 스페로이드를 형성하는 C8161 흑색종 세포를 중단했다는 것을 보여줍니다. 대조적으로, Fb-LOFNotch1은 Fb-LOFctrl에비해 C8161 흑색종 세포에 의한 3D 스페로이드의 형성을 촉진시켰다. 도 2B,상단은, 다양한 노치 경로 활동을 수행하는 상이한 섬유아세포와 세포 공문화의 7일째에 형성된 3D 스페로이드의 대표적인 이미지를 나타낸다. 도 2B,하단은, 다양한 노치 경로 활동을 운반하는 상이한 섬유아세포를 가진 세포 공문화의 7일째에 형성된 3D 스페로이드의 평균 크기에 대한 정량적 데이터를 나타낸다.
도 3은 암 줄기/시동기 세포의 약물 반응을 시험하기 위해 사용되는 이 3D 모델의 예를 나타낸다. 암 줄기/발신 세포는 약물 내성 및 암 재발에 대한 책임이 있는 것으로 나타났습니다. 따라서 이 3D 모델을 사용하여 약물 반응을 평가하면 암 치료에 대한 잠재적 약물의 임상 적 효능을 더 잘 알 수 있습니다. C8161 흑색종 세포는 세포 성장 및 침략을 위한 액티브한 MAPK 신호에 의존합니다. 그들은 또한 CDK4/Kit의 높은 수준을 표현하지만 BRAF 돌연변이를 가지고 있지 않습니다. 이 3D 모형을 사용하여 MAPK 억제제를 향해 암 줄기/발사 세포의 약 반응을 시험하기 위하여는, 우리는 24개의 우물 격판덮개에 있는 C8161 흑색종 세포 및 섬유아세포를 배양했습니다. PD0325901(물질표 참조), MAPK 억제제, 1 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM, 및 25 nM으로부터의 농도범위에서 연속 희석을 제조하였다. PD0325901은 세포 혼합물을 도금했을 때 세포 배양체에 첨가되었다. 처리되지 않은 코컬쳐된 세포를 대조군으로 사용하였다. 우리는 다른 약 농도의 밑에 세포 공문화의 스페로이드 형성 능력을 평가하고 처리되지 않은 통제와 비교했습니다. 도 3A는 상이한 약물 농도하에서 세포 공문화의 5일째에 형성된 3D 스페로이드의 대표적인 이미지를 나타낸다. 도 3B는 상이한 약물 농도 하에서 세포 공조의 5일째에 저전력 장(LPF x 4)당 형성된 스페로이드 및 3D 스페로이드의 평균 크기및 수의 정량적 데이터이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig01.jpg"> 그림 1: 3D 스페로이드 및 2D 클러스터의 형성. (A)인간 C8161 흑색종 세포 및 마우스 피부 섬유아세포의 동문화에 의해 형성된 3D 스페로이드의 대표적인 이미지. 3D 스페로이드는 흑색종 세포와 섬유아세포의 동문화의 7일째에 촬영되었다. 스페로이드의 평균 크기는 ~5−7일째에 직경이 ~170-360 μm(평균 = 275, SD = 37)이었다. 스페로이드의 평균 수는 저전력 장당 18-26(20.5±3.6)이었다(LPF x4). (B)C8161 흑색종 세포의 단일 배양에 의해 형성된 2D 종양 세포 클러스터의 대표적인 이미지. 2D 흑색종 세포 클러스터는 흑색종 세포의 단일 배양7일째에 촬영되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig1alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig02.jpg"> 그림 2: 3D 스페로이드 모델을 사용하여 암 줄기/개시 세포를 조절하는 과정에서 CAF에서 세포내 노치1 신호화 경로 활성의 역할의 해명. (a)CAF에서 세포내 노치1 신호화 경로 활성은 세포 공조에서 흑색종 세포에 의한 스페로이드의 형성을 결정하였다. 타임랩스 비디오는 Fb-GOFNotch1이 C8161 흑색종 세포에 의한 3D 스페로이드 형성을 중단시켰으며, Fb-LOFNotch1은 세포 공문화의 첫 4-52시간 동안 C8161 흑색종 세포에 의해 더 많은 3D 스페로이드 형성을 촉진시켰다. (B)상단 : 다양한 노치 경로 기능을 운반하는 다른 섬유 아세포를 가진 세포 공문화의 7 일째에 형성된 3D 스페로이드의 대표적인 이미지. 바닥: 다양한 노치 경로 활동을 운반하는 다른 섬유아세포를 가진 세포 공문화의 7일째에 형성된 3D 스페로이드의 평균 크기(직경[μm]/스페로이드)의 정량적 데이터. 두 꼬리 학생의 t-테스트는 통계 분석을 위해 사용되었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig2alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig03.jpg"> 그림 3: 3D 스페로이드 모델을 사용하여 암 줄기/세포 의 약물 반응 평가. (A)세포 공조의 5일째에 형성된 3D 스페로이드의 대표적인 이미지는 다른 약물 농도하에서. (B)상이한 약물 농도하에서 세포 공문화의 5일째에 형성된 저전력장당 평균 크기(직경[μm]/스페로이드)와 3D 스페로이드의 수의 정량적 데이터. 정량적 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig3alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Screenshot 1" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid01.jpg"> 비디오 1: 세포 공문화의 초기 단계에서 3D 스페로이드 형성의 동적 과정. 시간 경과 화상 진찰은 세포 공문화의 첫번째 ~ 4-52 시간 도중 3D 스페로이드의 동시 배양 그리고 대형에 있는 섬유아세포와 종양 세포 사이 동적 세포 세포 상호 작용을 보여줍니다. 세포는 동문화의 개시 후에 약 48 시간 의 3D 스페로이드를 형성하기 시작했습니다. 3D 스페로이드 형성의 피크는 ~5-7 (여기에 표시되지 않음)에 발생했습니다. 3D 스페로이드는 섬유아세포와 흑색종 세포로 구성되었으며, 여기서 대다수(~80%)가 종양 세포였다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_1.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Screenshot 2" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid02.jpg"> 비디오 2: 세포 공동 배양의 초기 단계에서 2D 클러스터의 형성의 동적 과정. 타임랩스 이미징은 단일 배양에서 C8161 흑색종 세포에 의해 형성된 2D 클러스터의 동적 과정을 나타낸다. 2D 클러스터의 형성은 하루 ~ 7-10 주위에 일어났다. 시간 경과 화상 진찰은 DsRed +/C8161흑색종 세포의 단 하나 배양에서 ~4-52 시간의 기간을 기록합니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_2.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Screenshot 3" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid03.jpg"> 비디오 3: 공초점 현미경으로 시각화된 3D 스페로이드의 아키텍처 및 회전. 3D 스페로이드의 아키텍처 및 회전. 녹색 및 적색 레이저는 세포 공양에서 7일째에 형성된 스페로이드를 스캔하는 데 사용되었다. 스캔 영역은 10x 목표 하에서 결정되었습니다. 스캔은 1 μm z-스텝에서 스페로이드의 바닥에서 위쪽으로 시작됩니다. 3D 스페로이드 회전 동영상은 피지 소프트웨어를 사용하여 만들어졌습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_3.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Screenshot 4" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid04.jpg"> 비디오 4: 공초점 현미경검사법에 의해 가시화된 바와 같이 2D 종양 세포 클러스터를 건축 및 회전한다. 2D 클러스터의 아키텍처 및 회전. 세포 클러스터의 공초점 이미지는 흑색종 세포 단일 배양7일째에 촬영되었다. 스캔 영역은 10x 목표 하에서 결정되었습니다. 스캔은 1 μm z-스텝에서 스페로이드의 바닥에서 위쪽으로 시작됩니다. 2D 클러스터 회전 동영상은 피지 소프트웨어를 사용하여 만들어졌습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_4.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Screenshot 5" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid05.jpg"> 비디오 5: 3D 스페로이드의 이동. 3D 스페로이드는 배양 배지에 중단되었고 배양 접시/웰을 준수하지 않았다. 세포 배양에서 여전히 배지가 잘 교란되었을 때, 부유된 3D 스페로이드가 이동하였다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_5.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Screenshot 6" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid06.jpg"> 비디오 6: 2D 종양 세포 클러스터의 확고함. 2D 종양 세포 클러스터는 배양 배지의 교란에도 불구하고 배양판및 움직이지 않는 배양판에 고정되었다. 몇 개의 죽은 세포가 이동했습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_6.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

종양 세포와 기질 섬유아세포의 이질적 상호작용에 기초한 새로운 3차원 스페로이드 모델이 확립된다. 여기에서, 우리는 spheroids의 대형을 구상하기 위하여 종양 세포 및 기질 섬유아세포, 시간 경과 화상 진찰 및 공초점 현미경 검사법의 공동 배양제시합니다. 이 3차원 모델은 종양-기질 상호 작용을 연구하고 암 치료제를 테스트하는 적절한 플랫폼을 제공합니다.

종양-기질 상호 작용 및 약물 발견을 연구하기 위한 새로운 기질 섬유아세포 변조 3D 종양 스페로이드 모델

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

우리는 암 기질 상호 작용을 공부하고 암 치료제를 시험할 수있는 플랫폼을 제공하는 새로운 3D 스페로이드 모델을 개발했습니다. 내 관점에서, 이 3D 시스템은 더 나은 진짜 종양 조건을 모방하기 위하여 기질 섬유세포에 있는 암세포를 결합하고, 그러므로, 약 발견을 위한 아주 강력한 공구일 수 있습니다. 또한, 이 모델은 흑색종을 연구하는 데 만전을 기하지 않는다.그것은 암의 그밖 모형을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 선임 과학자 인 Hongwei Shao 박사가 될 것입니다. 인간 흑색종 세포 배양을 위해, 기존의 부착 세포 배양 조건 하에서 세포를 던져 5%의 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 W489 배지를 완성한다.세포가 90%의 합류에 도달하면 세포를 1 대 5 비율로 분할합니다. 마우스 피부 섬유아세포 배양의 경우, PBS에서 수확된 조직 펠릿을 세척한 후 표본을 배양하고 DMEM은 10%의 태아 소 혈청과 세포 배양 배양기에서 페니실린-연쇄 절제술을 보충합니다. 90%의 합류에 도달하면 세포를 일대일 비율로 분할합니다.공동 문화를 설정하기 전에, 세포 합류가 다음 날 약 60 %에 도달 할 정도로 농도에서 100 밀리미터 접시에 섬유 아세포. 다음 날 아침, 상체를 폴리브레인 밀리리터 당 4 마이크로그램으로 보충된 일반 배양 배지의 재고에서 희석된 렌즈티바이러스에 GFP의 1대 3-5 농도로 대체한다. 상복부를 신선한 배양 배지로 대체하기 전에 세포를 세포 배양 인큐베이터에 6시간 동안 넣습니다.이틀 후, 형광 현미경에 세포로부터 GFP 신호를 관찰한다. 두 세포 배양이 안정적으로 전염되었을 때, 두 세포 배양을 0.25 트립신-EDTA에서 분리하여 단일 세포 현탁액을 백분비화하여 수집한다. 다시 는 공동 배양 배지 농도의 밀리리터 당 2 회 10 ~ 4 세포에서 세포를 일시 중단하고 흑색종 세포와 섬유 아세포를 일대일 비율로 혼합한다.그런 다음 각 조건에 대해 24 개의 우물 판과 삼중 판의 각 우물에 2 밀리리터의 세포를 보고 세포가 플레이트 바닥에 부착 할 수 있도록 4 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 흑색종 세포 솔로 배양의 경우 2D 세포 클러스터 형성을 평가하는 경우, 세포 배양기인큐베이터에서 7~10일 동안 세포를 배양하고 24개의 웰내로 각각 10~제4 흑색종 세포를 2회 참조한다. 그런 다음 표준 형광 현미경 프로토콜에 따라 반전된 형광 현미경으로 세포를 촬영합니다.시간 경과 이미징 시스템이 꺼져 있으면 이미징 전에 적어도 한 시간 동안 켜십시오. 시스템이 준비되면 배양 판을 현미경의 단계로 조심스럽게 옮기고 인큐베이터를 밀어 도어를 단단히 잠급합니다. 시간 경과 이미징 시스템의 소프트웨어를 열고 선박을 클릭하여 플레이트 유형및 제조업체를 선택하여 현미경이 스캔 영역을 정확하게 찾을 수 있도록 합니다.10배의 객관적인 렌즈와 관심 있는 우물을 선택하고 스캔 영역과 시작 및 종료 시간 사이의 간격 시간에 대한 매개 변수를 설정합니다. 그런 다음 4 시간에서 52 시간까지 시간 경과 이미징을 기록합니다. 이미지 녹화가 끝나면 시간 경과 이미징 시스템 소프트웨어를 사용하여 데이터를 검색하고 수집된 비디오 또는 이미지 세트를 내보냅니다.동배의 공초점 현미경 이미징의 경우, 반전형 형광 현미경의 단계에 플레이트를 배치하고 빨간색과 녹색 레이저 빔을 선택합니다. 5 배 또는 10 배 목표하에서 세포를 관찰하고 스캐닝을 시작하는 스페로이드를 선택합니다. 하나의 미크론 z-스텝을 사용하여 스페로이드의 바닥에서 상단으로 스캔합니다.그런 다음 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하여 3D 동영상으로 더 회전하고 저장할 수 있는 3D 이미지를 재구성합니다. 여기서, 공동 배양된 흑색종 세포및 섬유아세포에 의해 형성된 다세포 3D 스페로이드의 심상이 도시된다. 일부 흑색종 세포는 확장된 배양으로 2D 클러스터를 형성하더라도 섬유아세포가 없는 상태에서 배양된 흑색종 세포는 전형적인 3D 스페로이드를 형성하지 않습니다.시간 경과 이미징을 사용하여 섬유아세포및 종양 세포는 약 36시간 에서 스페로이드에서 시작하여 공동 배양에서 상호 작용하는 것을 관찰할 수 있다. 본 영화에서, 단일 배양 흑색종 세포 응집 형성의 동적 과정을 4~52시간의 배양으로부터 관찰할 수 있다. 여기서, 3D 스페로이드 구조는 7일간의 배양 후 공초점 현미경검사법에 의해 관찰될 수 있으며, 이 영화에서는 2D 세포 클러스터가 시각화될 수 있다.3D 스페로이드는 배양 배지에서 일시 중단된 상태로 유지되며 이동성이며, 2D 종양 세포 클러스터는 배양판에 부착되는 경향이 있으며 움직이지 않습니다. 이 3D 모델은 종양-스트로마 상호 작용을 연구하기위한 독특한 플랫폼역할을합니다. 예를 들면, 세포 간 Notch1 신호 통로 활동 및 암 관련 된 섬유아세포암암의 줄기 및 시동 세포 및 스페로이드 형성을 어떻게 해명.또한, 이 모델은 암 줄기및 세포의 약물 반응을 시험하는 데 사용될 수 있다. 이 방법은 간단하고 직선이지만 올바른 세포 밀도 및 세포 비를 사용하고 입증 된 바와 같이 적절한 배양 판을 사용하십시오. 이 3D 모델은 또한 암 줄기 세포의 표현형을 결정하기 위한 중요한 세포내 신호 경로 활성을 진정시키고 암 줄기 세포가 매우 민감한 작은 분자 화합물을 선별하는 데 적용 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

연구

암 연구학

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

3D Organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

표적 항원 특이적 치료 항체의 종양 및 조직 분포 분석

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

튜닝 가능한 바이오 물속성과 3D 환경에서 종양-스트로마 상호 작용을 연구하는 간암을 위한 생체 모방 모형

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

간세포 암에서 종양-기질 상호 작용을 조사하는 3차원 스페로이드 모델

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis

흑색종 전이의 새로운 중재자 식별을 위한 강력한 발견 플랫폼

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was ...