Name: a novel stromal fibroblast-modulated 3d tumor spheroid model for studying tumor-stroma interaction and drug discovery
Uploaded: 2020-02-28T12:00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery at JoVE.com

Мы благодарим д-ра Омаиду К. Веласкеса (Университет Майами) за полезное сотрудничество, консультации и обсуждение; Д-р Цзе Ли (Университет Майами) за предоставление ячеек MeWo; и д-р Meenhard Херлин (Институт Вистар) для обеспечения всех других клеток меланомы. Мы также благодарим д-ра Марсию Булину (Marcia Boulina), директора аналитического центра Imaging Core, Университет Майами, за анализ изображений. Чжао-Цзюнь Лю была поддержана грантами от Программы исследований рака Бэнкхед-Коли (Award 09BN-11), Ассоциации по борьбе с раком женщин(53-й ежегодный грант) и внутренних фондов Из Университета Майами.

<ol>
	<li>Lorusso, G., Ruegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis.">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130, 1091-1103 (2008).</li><li>Anton, K., Glod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tumor+stroma+in+cancer+therapy.">Targeting the tumor stroma in cancer therapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 10, 185-191 (2009).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response.">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501, 346-354 (2013).</li><li>Allinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+tumor+microenvironment+in+breast+cancer.">Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer.</a> Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).</li><li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression.">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li><li>Lynch, C. C., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+in+tumor-host+cell+communication.">Matrix metalloproteinases in tumor-host cell communication.</a> Differentiation. 70, 561-573 (2002).</li><li>Midwood, K. S., Williams, L. V., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+repair+and+the+dynamics+of+the+extracellular+matrix.">Tissue repair and the dynamics of the extracellular matrix.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 36, 1031-1037 (2004).</li><li>Olumi, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinoma-associated+fibroblasts+direct+tumor+progression+of+initiated+human+prostatic+epithelium.">Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium.</a> Cancer Research. 59, 5002-5011 (1999).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer:+a+novel+tumor-promoting+cell+type.">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5, 1597-1601 (2006).</li><li>Luga, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+mediate+stromal+mobilization+of+autocrine+Wnt-PCP+signaling+in+breast+cancer+cell+migration.">Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration.</a> Cell. 151, 1542-1556 (2012).</li><li>Zhang, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+bone+metastasis+seeds+by+mesenchymal+signals+in+the+primary+tumor+stroma.">Selection of bone metastasis seeds by mesenchymal signals in the primary tumor stroma.</a> Cell. 154, 1060-1073 (2013).</li><li>Orimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1/CXCL12+secretion.">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Notch1+signaling+in+stromal+fibroblasts+inhibits+melanoma+growth+by+upregulating+WISP-1.">Activation of Notch1 signaling in stromal fibroblasts inhibits melanoma growth by upregulating WISP-1.</a> Oncogene. 30, 4316 (2011).</li><li>Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+Antitumor+Immune+Response+by+Cancer-Associated+Fibroblasts.">Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts.</a> Frontier in Immunology. 9, 414 (2018).</li><li>Kraman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+antitumor+immunity+by+stromal+cells+expressing+fibroblast+activation+protein-alpha.">Suppression of antitumor immunity by stromal cells expressing fibroblast activation protein-alpha.</a> Science. 330, 827-830 (2010).</li><li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion.">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+tumor+microenvironment+models+for+anticancer+drug+discovery.">In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2007).</li><li>Santiago-Walker, A., Li, L., Haass, N. K., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocytes:+from+morphology+to+application.">Melanocytes: from morphology to application.</a> Skin Pharmacology and Physiology. 22, 114-121 (2009).</li><li>Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+melanoma+in+vitro+and+in+vivo.">Modeling melanoma in vitro and in vivo.</a> Healthcare (basel). 2, 27-46 (2013).</li><li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging-+and+flow+cytometry-based+analysis+of+cell+position+and+the+cell+cycle+in+3D+melanoma+spheroids.">Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).</li><li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17, 1-15 (2015).</li><li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multicellular+spheroids+formation.">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society Interface. 14, (2017).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31, 108-115 (2013).</li><li>Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems+modeling+tumor+growth+determinants+in+cancer+target+discovery.">3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery.</a> Advanced Drug Delivery Review. 69-70, 29-41 (2014).</li><li>Bulin, A. L., Broekgaarden, M., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+high-throughput+image+analysis+for+therapeutic+efficacy+of+architecturally+complex+heterotypic+organoids.">Comprehensive high-throughput image analysis for therapeutic efficacy of architecturally complex heterotypic organoids.</a> Scientific Reports. 7, 16645 (2017).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+spheroid+based+on+a+triple+coculture:+A+novel+3D+model+to+mimic+pancreatic+tumor+complexity.">Multicellular spheroid based on a triple coculture: A novel 3D model to mimic pancreatic tumor complexity.</a> Acta Biomaterialia. 78, 296-307 (2018).</li><li>Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Gu, L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+and+emerging+anticancer+therapeutics:+engineering+the+microenvironment.">Biomaterials and emerging anticancer therapeutics: engineering the microenvironment.</a> Nature Reviews Cancer. 16, 56-66 (2016).</li><li>Tevis, K. M., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedded+Spheroids+as+Models+of+the+Cancer+Microenvironment.">Embedded Spheroids as Models of the Cancer Microenvironment.</a> Advanced Biosystems. 1, (2017).</li><li>Welch, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+highly+invasive+and+spontaneously+metastatic+human+malignant+melanoma+cell+line.">Characterization of a highly invasive and spontaneously metastatic human malignant melanoma cell line.</a> International Journal of Cancer. 47, 227-237 (1991).</li><li>Balint, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Notch1+signaling+is+required+for+beta-catenin-mediated+human+primary+melanoma+progression.">Activation of Notch1 signaling is required for beta-catenin-mediated human primary melanoma progression.</a> Journal of Clinical Investigation. 115, 3166-3176 (2005).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs+:+biological+significance+of+bFGF.">Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF.</a> the American Journal of Pathology. 156, 193-200 (2000).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Notch1+Signaling+in+Cancer-Associated+Fibroblasts+Dictates+the+Plasticity+and+Stemness+of+Melanoma+Stem/Initiating+Cells.">Intracellular Notch1 Signaling in Cancer-Associated Fibroblasts Dictates the Plasticity and Stemness of Melanoma Stem/Initiating Cells.</a> Stem Cells. 37, 865-875 (2019).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+Pathway+Activity+Determines+the+Regulatory+Role+of+Cancer-Associated+Fibroblasts+in+Melanoma+Growth+and+Invasion.">Notch1 Pathway Activity Determines the Regulatory Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Melanoma Growth and Invasion.</a> PLoS One. 10, 0142815 (2015).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1-WISP-1+axis+determines+the+regulatory+role+of+mesenchymal+stem+cell-derived+stromal+fibroblasts+in+melanoma+metastasis.">Notch1-WISP-1 axis determines the regulatory role of mesenchymal stem cell-derived stromal fibroblasts in melanoma metastasis.</a> Oncotarget. 7, 79262-79273 (2016).</li><li>Kalluri, R., Neilson, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+and+its+implications+for+fibrosis.">Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 112, 1776-1784 (2003).</li><li>Price, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+models+in+immunodeficient+animals+:+I.+Nude+mice:+spontaneous+and+experimental+metastasis+models.">Xenograft models in immunodeficient animals : I. Nude mice: spontaneous and experimental metastasis models.</a> Methods in Molecular Medicine. 58, 205-213 (2001).</li><li>Spaeth, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS One. 4, 4992 (2009).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

In vitro 3D методы культуры клеток были широко использованы в течение десятилетий в исследованиях рака. По сравнению с обычными 2D-системами культуры клеток, 3D микросреда резюмирует клеточные и/или клеточные матрицы и позволяет имитировать подлинные условия, наблюдаемые в опухолевых тканях. Однако 3D-система, сформированная только раковыми клетками и гомотипическими клеточными взаимодействиями, не учитывает важность гетеротипического перекрестного разговора и может обеспечить неточные результаты в исследованиях. Недавно мы разработали новую 3D-систему, сочетающую раковые клетки и CAF, чтобы лучше имитировать неоднородную микросреду опухоли vivo и ее родную и жесткую десмопластическую реакцию.
Фибробласты являются основными компонентами опухолевой стромы. CAF участвуют в регулировании прогрессирования опухоли, вызывая растворимые факторы, ECM / ремоделирования ферментов10,11, и экзосомы. Кроме того, CAF играют определенную роль в лекарственной устойчивости и рецидиве опухоли16,17. Наша многоклеточная 3D сфероидная система может быть использована для изучения молекулярных механизмов опухолево-стромальных взаимодействий и для решения проблемы лекарственной устойчивости и рецидива опухоли. CAF в первую очередь происходит от активированных местных quiescent фибробластов и набраны циркулирующих КОСТного мозга MSC, которые проходят на месте дифференциации в CAF в опухолевой ткани37,38,39. В текущем исследовании мы использовали фибробласты кожи для создания многоклеточной 3D сфероидной модели. Тем не менее, другие типы фибробластов (например, MSC-DF), также работают очень похожи, как фибробласты кожи для регулирования образования опухолевых клеток 3D сфероидов34. MSC-DF может быть полученизована из murine костного мозга MSC, который обогащается путем культивирования моноядерных клеток костного мозга в среде культуры клеток MSC в течение примерно 10 дней с периодическими средними изменениями каждые 3 дня. Эти MSC характеризуются как CD73 /CD105/Лин-. Чтобы дифференцировать MSC в фибробласты, MSC впоследствии культивируются с полным DMEM в течение дополнительных 2 недель. MSC-DF характеризуются как «З-СМА»/Виментин /FSP-1, клетки36. MSC-DF может быть важным регуляторов опухоли. Потому что доля CAF во многих типах твердых опухолей дифференцированы от набранных циркулирующих MSC освобождены от костного мозга36, MSC-DF может быть перспективным цели лечения. Они также гораздо легче терапевтически манипулировать или целевых, прежде чем они завербованы в опухолевые ткани и дифференцированы в CAF. Таким образом, наша 3D-модель предлагает идеальную систему для изучения и тестирования не только раковых клеток, но и различных фракций или субпопуляций CAF. Метод 3D сфероидного образования прост. Критические шаги включают использование сыворотки свободной среды для сокультуры, применяя правильное соотношение фибробластов к опухолевым клеткам, и использование правильных пластин культуры для сокультуры. Потенциальным ограничением нашего метода является то, что образование 3D сфероидов в значительной степени зависит от линии раковых клеток. Наш протокол формирования сфероидов может потребовать оптимизации соотношения между фибробластами и раковыми клетками, если используются различные линии раковых клеток. Следует отметить, что мы использовали клетку меланомы человека и мышь фибробластной модели сокультуры клеток для формирования 3D сфероидов, потому что это гораздо проще создать GOF или LOF клеток в фибробласты мыши для изучения роли молекулы или сигнального пути в регулировании формирования опухоли сфероидов. Способность клеток меланомы человека и фибробластов мыши образовывать сфероиды указывает на то, что молекулы, необходимые для клеточной связи, работают кросс-видом. Недавно мы протестировали кокультуру фибробластов человека с клетками меланомы человека и обнаружили, что фибробласты человека могут также регулировать клетки меланомы человека, образуя 3D сфероиды.
Мы использовали клетки метастатической меланомы человека, C8161, в нашей многоклеточной 3D сфероидной модели. Мы также протестировали другие клетки меланомы человека, например, 1205Lu32, который несет мутации BRAFV600E, и MeWo, который выражает высокий уровень CDK4/Kit (ATCC HTB-65), и обнаружили, что они также способны формировать 3D сфероиды в кокультуре. Это указывает на то, что образование 3D сфероидов опухолевыми клетками не зависит от типов онкогенных мутаций. Хотя мы не проверяли ли другие типы немеланомы опухолевых клеток способны формирования 3D сфероидов с фибробластами, наши выводы показывают, что образование 3D сфероидов не ограничивается линией клеток меланомы и не может зависеть от конкретной линии раковых клеток.
Мы показали два примера практического применения нашей 3D сфероидной модели. Одним из примеров было выяснить внутриклеточной Нотч сигнализации пути деятельности в регулировании рака стволовых / иначины фенотипа клеток и 3D сфероид образования. Мы продемонстрировали, что внутриклеточные Нотч сигнальных путей в CAF является молекулярный переключатель контроля фенотипа рака стволовых / инициирующих клеток с помощью этой 3D сфероидной модели. Наши выводы не только раскрыть молекулярный механизм, лежащий в основе стромальной регуляции рака стволовых / инициирующих клеток и гетерогени на рак, но и подчеркнуть, что Нотч путь в CAF является критической мишенью для меланомы терапии. Этот пример указывает на то, что наша 3D-модель сфероидов очень полезна для изучения механизмов взаимодействия раковых клеток-стромальных фибробластов и выявления потенциальных терапевтических целей. Другим примером было проверить лекарственный ответ рака стволовых / инициирующих клеток в присутствии CAF. Хорошо известно, что реакция препарата раковых клеток, в том числе раковых стволовых / инициирующих клеток, варьируется в присутствии и отсутствии CAF. Присутствие CAF в этой системе in vitro делает эту модель более клинически релевантной и генерируетрезультат результатов испытаний более надежным. Кроме того, наша 3D сфероидная система является универсальной. Его можно использовать для различных целей. Например, если лекарственно устойчивые раковые клетки используются в этой 3D-модели, она может быть изменена для решения лекарственной устойчивости и, возможно, рецидива опухоли. Он также может быть изменен для тестирования или скрининга препаратов, которые в первую очередь нацелены на CAF для лечения рака. CAF в последнее время стали перспективными терапевтическими целями. Есть преимущества таргетинга на CAF. Во-первых, по сравнению с опухолевыми клетками, которые являются ненормальными (часто с генетическими изменениями) и умные (легко получить устойчивость к химио- и радиотерапии), CAF в опухолевой ткани являются нормальными клетками и генетически более стабильной, поэтому они менее склонны к развитию устойчивости к лечению. Во-вторых, таргетинг CAF не зависит от типа онкогенных мутаций в опухолевых клетках. В-третьих, таргетинг CAF может достичь нескольких эффектов попадания через фибробласты-зависимые противоопухолевые, анти-ангиогенез, и / или модулирующих иммунный ответ рака. Наша 3D-модель сфероидов является мощным инструментом для открытия различных наборов терапевтических стратегий рака.

Твердые опухоли представляют сложные ткани, состоящие из неопластических клеток и большого разнообразия стромальных клеток1,2,3,4. Стромальные фибробласты, или связанные с раком фибробласты (CAF), являются одним из видных популяций стромальных клеток в большинстве типов твердых опухолей. Они критически участвуют в регулировании роста опухоли, стволовые, метастазы, ангиогенез, и лекарственная устойчивость через производство факторов роста, цитокинов / хемокины, синтез ECM и ремоделирования ферментов (например, коллаген, фибронектин, и матрицы металлопротеазы), высвобождение экзосомы, и прямой гетероций кcell-взаимодействия5,7,9,11, 10, . CAF также принять участие в определении рака органа конкретных метастазов путем предварительного отбора подмножество опухолевых клонов из гетерогенных популяций опухолевых клеток в первичном поражении и содействие эти выбранные клоны, которые будут загрунтованы для метастазов к конкретному удаленному органу, микроокружение которого является оптимальным для повторной колонизации выбранных клонов12. Кроме того, фибробласты и их выделяемые растворимые факторы и ECM участвуют в модуляции опухолевого ангиогенеза13,14,противоопухолевого иммунного ответа15,и даже участвуют в лекарственной устойчивости и рецидиве опухоли16,17.
In vitro 3D опухоли сфероидмодели были разработаны и использованы в исследованиях рака в качестве промежуточной модели между in vitro раковых клеток культур и in vivo модели опухоли18,19,20,21. 3D опухоли сфероидмодели приобрели популярность в исследовании раковых стволовых клеток, доклинических исследований рака, и скрининг наркотиков, потому что эти модели воспроизводят некоторые важные особенности реальных опухолей, которые отсутствуют в традиционных 2D монослоев22. Многие существующие 3D опухолевые сфероидные модели являются исключительно образовавшиеся из опухолевых клеток и не участвуют в работе опухолевых стромальных клеток. Это часто приводит к опухолевых сфероидов, имеющих недостаточное осаждение ECM и отсутствие гетеротипических клеточных взаимодействий. Обычные 3D-сфероиды, образованные исключительно раковыми клетками и гомотипической клеточной сливкой, могут лишь частично имитировать условия in vivo опухолевых тканей. Чтобы преодолеть некоторые из этих ограничений, исследователи предложили включить несколько типов стромальных клеток в 3D-культуры и разработали несколько гетеротипов 3D опухолевых сфероидовмодели 23,24,25,26,27. Кроме того, исследователи использовали экзогенные 3D матрицы, в том числе природные гидрогели или синтетические полимеры, такие как полиэтиленгликоль, поли (лактид-ко-гликолид),и поли (N-isopropylacrylamide), для встраивания моноклеточныхи многоклеточных сфероидных моделей, создавая клеточную среду и воспроизводя клеточные матрицы28. Тем не менее, включение некоторых типов стромальных клеток, таких как эндотелиальные клетки, в 3D-кокультуры приводит к дополнительной сложности для системы in vitro и затрудняет изучение гетеротипических клеточных взаимодействий между двумя конкретными типами клеток, таких как раковые клеточные фибробластные взаимодействия. Кроме того, эндотелиальные клетки в реальных тканях не всегда напрямую взаимодействуют с раковыми клетками и другими стромальными клетками, потому что есть слой подвальной мембраны, обернутый за пределами капилляров, что предотвращает непосредственное взаимодействие эндотелиальных клеток с раковыми клетками и другими стромальными клетками. В этих 3D сфероидных моделей, включенных эндотелиальных клеток на самом деле не образуют кровеносные сосуды, но взаимодействуют непосредственно с раковыми клетками и другими стромальными клетками, то, что редко происходит in vivo. Аналогичным образом, экзогенные матрицы, используемые в некоторых 3D сфероидных моделях, не идентичны ECM в реальных опухолевых тканях с точки зрения структуры и состава. Все эти искусственные условия могут привести к вводящим в заблуждение данным.
Недавно мы создали новую многоклеточную 3D-сфероидную модель, состоящую из опухолевых клеток и CAF. В нашей модели, образование 3D опухолевых сфероидов полностью определяется CAF. CAF индуцировать и регулировать фенотип опухолевых стволовых / инициирующих клеток. ECM производства CAF является естественным и позволяет десмопластической структуры, чтобы лучше имитировать микроокружение опухоли in vivo. Эта новая 3D модель может быть полезным инструментом для скрининга наркотиков рака и предлагает уникальную платформу для изучения опухоли-стромы взаимодействия, разъяснять, как CAF регулировать рак стволовых / инициирующих клеток, и изучить участие стромальных взаимодействий в чувствительность и резистентность к раковым препаратам.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-253-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351147</td>
			<td>Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 1.5 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-2674</td>
			<td>500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation</td>
			<td>Dako</td>
			<td>x0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase Grade II</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>165859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium(DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VMR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Premium Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Free for downloading, no license needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte Zoom 2016A</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte Zoom System</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 Medium (Leibovitz)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP5 Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 153 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7403-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti &#945;-SMA (smooth muscle actin), monoclone</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olymupus CellSens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Selleckchem Chemicals</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002- CI</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate 7.5%</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-035-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel stromal fibroblast-modulated 3d tumor spheroid model for studying tumor-stroma interaction and drug discovery

Опухолево-стромноговзаимодействия играют важную роль в прогрессировании рака. Трехмерные (3D) опухолевые модели сфероидов являются наиболее широко используемыми моделью in vitro при изучении раковых стволовых/инициирующих клеток, доклинических исследованиях рака и скрининге лекарств. 3D сфероидные модели превосходят традиционную культуру опухолевых клеток и воспроизводят некоторые важные символы реальных твердых опухолей. Однако обычные 3D-опухолевые сфероиды состоят исключительно из опухолевых клеток. Они не имеют участия опухолевых стромальных клеток и имеют недостаточное внеклеточное matrix (ECM) осаждение, таким образом только частично имитируя in vivo условия туморных тканей. Мы создали новую многоклеточную 3D-сфероидную модель, состоящую из опухолевых клеток и стромальных фибробластов, которая лучше имитирует неоднородную микросреду in vivo tumor и ее родную десмоплазию. Формирование сфероидов строго регулируется опухолевыми стромальными фибробластами и определяется активностью некоторых важнейших внутриклеточных сигнальных путей (например, сигнализации Ночка) в стромальных фибробластах. В этой статье мы представляем методы кокультуры опухолевых клеток-стромневых фибробластов, замедленной визуализации для визуализации взаимодействия клеток и конфокальной микроскопии для отображения 3D архитектурных особенностей сфероидов. Мы также показываем два примера практического применения этой 3D сфероидной модели. Эта новая многоклеточная 3D сфероидная модель предлагает полезную платформу для изучения взаимодействия опухолево-стромы, разъясняя, как стромальные фибробласты регулируют раковые стволовые/инициационные клетки, которые определяют прогрессирование опухоли и агрессивность, и изучает участие стромальной реакции в чувствительности и резистентности к раковым препаратам. Эта платформа также может быть соответствующей моделью in vitro для обнаружения наркотиков.

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery at JoVE.com

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Установлена новая трехмерная сфероидная модель, основанная на гетеротипическом взаимодействии опухолевых клеток и стромальных фибробластов. Здесь мы представляем сокультуру опухолевых клеток и стромальных фибробластов, замедленной визуализации и конфокальной микроскопии для визуализации формирования сфероидов. Эта трехмерная модель предлагает соответствующую платформу для изучения опухолево-стромного взаимодействия и тестирования терапии рака.

Роман Стромальный Фибробласт-Модулированные 3D опухолевой сфероидной модели для изучения опухоли-Строма Взаимодействия и наркотиков Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Мы разработали новую модель 3D сфероидов, которая предлагает платформу для изучения раковых взаимодействий и тестирования терапии рака. На мой взгляд, эта 3D система сочетает в себе раковые клетки в стромы фибробласта, чтобы лучше имитировать подлинные условия опухоли и, следовательно, может быть очень мощным инструментом для обнаружения наркотиков. Кроме того, эта модель не ограничивается изучением меланомы.Он может быть использован для исследования других видов рака. Демонстрацией процедуры будет доктор Хунвэй Шао, старший научный сотрудник из моей лаборатории. Для человеческой культуры клеток меланомы, бросить клетки под обычными условиями культуры клеток адепта и завершить W489 среды при 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа.Когда клетки достигнут 90%-го слияния, разделите клетки в соотношении один к пяти. Для мыши кожи фибробластов культуры, мыть собранные гранулы ткани в PBS до культивирования образцов и DMEM дополнены 10 процентов плода бычьего сыворотки, и один процент пенициллин-стрептомицин в инкубаторе клеточной культуры. Разделите клетки в соотношении один к двум, когда они достигнут 90-процентного слияния.Прежде чем создать кокультуры, семена фибробластов на 100 миллиметров блюдо в концентрации, так что слияние клеток достигнет примерно 60 процентов на следующий день. На следующее утро замените супернатант концентрацией GFP от одного до трех до пяти к лентивирусу, разбавленному из бульона в обычной культурной среде, дополненной четырьмя микрограммами на миллилитр полибрена. Поместите клетки в инкубатор клеточной культуры в течение шести часов, прежде чем заменить супернатант свежей средой культуры.Через два дня наблюдайте сигнал GFP от клеток на флуоресцентный микроскоп. Когда обе клеточные культуры были стабилико трансфицированы, отсоедините обе клеточные культуры от 0,25 трипсина-ЭДТА, чтобы собрать одноклеточные суспензии на центувигации. Повторно приостановить клетки в два раза от 10 до четвертого клеток на миллилитр средней концентрации кокультуры и смешать клетки меланомы и фибробласты в соотношении один к одному.Затем посмотрите два миллилитров клеток на каждый колодец из 24 хорошо пластины и тройной для каждого состояния и поместите пластину в инкубатор культуры клеток в течение четырех часов, чтобы клетки, чтобы прикрепить к нижней пластины. Для меланомы клеточной соло культуры для оценки образования 2D-клеточных кластеров, увидеть два раза от 10 до четвертой клетки меланомы в каждый колодец из 24 хорошо пластины и культуры клеток в течение семи до 10 дней в инкубаторе клеточной культуры. Затем сфотографируют клетки на перевернутом флуоресцентном микроскопе в соответствии со стандартными протоколами флуоресцентной микроскопии.Если система визуализации промежуток времени выключена, включите ее по крайней мере за час до начала изображения. Когда система будет готова, тщательно перенесите культурную пластину на стадию микроскопа и сдвиньте инкубатор и надежно заблокив дверь. Откройте программное обеспечение системы визуализации промежуток времени и нажмите добавить судно, чтобы выбрать тип пластины и производителя, чтобы микроскоп может найти область сканирования точно.Выберите объектив 10 раз объектив и колодцы, представляющие интерес, и установите параметры области сканирования, интервал между сканированием и временем начала и окончания. Затем завехать промежуток времени изображения от четырех до 52 часов. В конце записи изображения используйте программное обеспечение системы визуализации замедленного действия для получения данных и экспорта собранных видео или наборов изображений.Для конфокальных микроскопических изображений кокультур поместите пластину на стадию перевернутого микроскопа флуоресценции и выберите красные и зеленые лазерные лучи. Наблюдайте за клетками под целью 5 или 10 раз и выберите сфероид, чтобы начать сканирование. Используя один микрон z-шаг, сканирование снизу вверху сфероида.Затем обработайте данные с помощью соответствующего программного обеспечения для обработки изображений для восстановления 3D-изображения, которое может быть дополнительно повернуто и сохранено в качестве 3D-фильма. Здесь показаны изображения многоклеточных 3D сфероидов, образованных кокультурными клетками меланомы и фибробластов. Клетки меланомы, образоваваемые при отсутствии фибробластов, не образуют типичных 3D сфероидов, хотя некоторые клетки меланомы образуют 2D кластеры с расширенной культурой.Использование промежуток времени изображения, фибробласты и опухолевые клетки могут наблюдаться взаимодействующих в кокультуре, начиная с сфероидов около 36 часов. В этом фильме, динамический процесс одного культурного образования клеток меланомы совокупности от четырех до 52 часов культуры можно наблюдать. Здесь 3D-структуру сфероидов можно наблюдать с помощью конфокальная микроскопия после семи дней культуры, в то время как в этом фильме можно визуализировать 2D-клеточный кластер.3D сфероиды остаются приостановленными в среде культуры и являются мобильными, в то время как 2D опухолевые клеточные кластеры, как правило, прикрепляются к культурной пластине и неподвижны. Эта 3D-модель служит уникальной платформой для изучения взаимодействий опухоли и стромы. Например, для выяснения того, как межклеточный Notch1 сигнализации пути деятельности и рака связанных фибробластов регулировать стволовых рака и инициирования клеточной и сфероидной формирования.Кроме того, эта модель может быть использована для проверки реакции препарата рака стволовых и инициируя клетки. Хотя этот метод прост и прямо вперед, позаботьтесь, чтобы использовать правильную плотность клеток и соотношение клеток, и использовать соответствующие пластины культуры, как попродемонстрировано. Эта 3D модель может быть применена либо для усердства важнейших внутриклеточных сигнальных путей для определения фенотипов раковых стволовых клеток, а также скрининга небольших молекул соединений, к которым раковые стволовые клетки очень чувствительны.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Использование функциональной геномики скрининг для выявления потенциально новых целей наркотиком в сфероида культур раковых клеток

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Терапия, тестирование в модели культуры на основе сфероида 3D клеток для головы и шеи плоскоклеточный рак

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Поколение высокопроизводительных трехмерных опухоли сфероидов для скрининга наркотиков

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Модель 3D Organotypic меланомы кожи сфероида

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

3D сфероидная модель как более физиологическая система для рака связанных фибробластов дифференциации и вторжения в vitro исследований

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Анализ опухоли и распределения тканей целевого антигена специфических терапевтических антител

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

3D сфероидная модель для глиобластомы

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Биомиметическая модель рака печени для изучения взаимодействия опухоли и стромы в 3D-среде с настраиваемыми био-физическими свойствами

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Трехмерная сфероидная модель для исследования опухоле-стромального взаимодействия при гепатоцеллюлярной карциноме

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis

Надежная платформа discovery для идентификации новых медиаторов метастазирования меланомы

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was ...