Name: peptiquick, a one-step incorporation of membrane proteins into biotinylated peptidiscs for streamlined protein binding assays
Uploaded: 2019-11-02T15:00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays at JoVE.com

نشكر مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا. JS يحمل منحه CGS-M CIHR. وكانت الشركة مدعومة بشراكه التدريب علي الدكتوراه في العلوم البيولوجية والبيولوجيا التي يمولها مجلس بحوث التكنولوجيا الحيوية [المرجع المتعلق بمنحه التدريب BB/M009122/1]. FD هو المستوي الثاني كندا كرسي البحوث.

1. اعداد والاذابه من مستقبلات الغشاء FhuA
<ol><li>أعرب له6-الموسومة fhua في القولونية سلاله AW740. تنمو الخلايا ل 18 ح في 37 درجه مئوية في وسائل الاعلام مسنومكس (الجدول 1). انظر المطاحن وآخرون16 للحصول علي بروتوكول تعبير مفصل.</li>
	<li>حصاد الخلايا بواسطة طرد (5,000 x g، 10 دقيقه ، 4 درجه مئوية) وأعاده التعليق عليها في 50 ML من تريس-الملح-الجلسرين (tsg) العازلة (الجدول 1). قم باعاده الخلايا المعاد تعليقها وأضف الفلوريد (PMSF) إلى تركيز نهائي من 1 مم قبل تحلل. تحذير: PMSF سامه وقابله للتاكل.</li>
	<li>Lyse الخلايا باستخدام microfluidizer (ثلاثه مقاطع) في 15,000 psi أو الصحافة الفرنسية (ثلاثه مقاطع) في 8,000 psi. بيليه الخلايا unlysed وغيرها من المواد غير قابله للذوبان بواسطة طرد منخفضه السرعة (5,000 x g، 10 دقيقه ، 4 درجه مئوية).</li>
	<li>الطارد الفائق (200,000 x g، 40 دقيقه ، 4 درجه مئوية) لعزل جزء الغشاء الخام. تجاهل supernatant ، وأعاده تعليق بيليه غشاء في الحد الأدنى من المخزن المؤقت TSG ، والدوس باستخدام الزجاج أو المعدن جهاز اللحام لضمان التجانس.</li>
	<li>اجراء فحص برادفورد للتحقق من تركيز البروتين من الغشاء الخام المعاد تعليقه. تمييع الغشاء الخام إلى تركيز نهائي من 3 مغ/مل باستخدام العازلة TSG قبل الذوبان.</li>
	<li>أضافه المنظفات تريتون X-100 إلى تركيز نهائي من 1 ٪ (v/v) لأذابه انتقائية الغشاء الداخلي البكتيري ل 1 ح في 4 درجه مئوية مع هزاز لطيف. بيليه المواد غير قابله للذوبان (جزء الغشاء الخارجي) من قبل نبذ حلول (200,000 x g، 40 min ، 4 درجه مئوية).</li>
	<li>تجاهل ماده طافي التي تحتوي علي الغشاء solubilized وأعاده تعليق بيليه في tsg إلى تركيز نهائي من 3 ملغ/مل. أضافه أكسيد اللويلديميثيلاميني (LDAO) إلى تركيز 1% (v/v) علي كسر الغشاء الخارجي المعاد تعليقه والاذابه لمده 1 ساعة عند 4 درجه مئوية مع هزاز لطيف.</li>
	<li>تنفيذ خطوه طرد النهائي إلى بيليه جميع المواد غير قابله للذوبان (200,000 x g، 40 min ، 4 درجه مئوية). ملاحظه: الناتجة ماده طافي يحتوي علي البروتينات الغشاء الخارجي solubilized ، بما في ذلك الهدف fhua له الموسومة.</li>
</ol>2. تنقيه وأعاده تشكيل FhuA باستخدام سير العمل بيبتيكويك
<ol><li>قبل تتوازن a معبا العمود Ni-NTA (5 مل حجم الراتنج) مع اثنين من مجلدات العمود من المعادن غير المعبئة تقارب اللوني (ايماك) غسل العازلة (الجدول 1).</li>
	<li>تمييع الغشاء الخارجي solubilized من 1 ٪ LDAO إلى 0.04 ٪ LDAO باستخدام TSG. ثم ، أضافه ايميدازول إلى تركيز نهائي من 5 ملم. تحذير: ايميدازول سام ومسبب للتاكل.</li>
	<li>تحميل البروتينات الغشاء الخارجي solubilized علي الراتنج ني-NTA وجمع تدفق. أعاده تحميل الجريان علي الراتنج لزيادة ملزمه الراتنج FhuA وجمع تدفق الثانوية. ملاحظه: الحفاظ علي 20 μl قسامه من المواد solubilized كمرجع للتحليل في وقت لاحق الصوديوم دوديسيل كبريتات بولياكرياميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) تحليل.</li>
	<li>غسل الراتنج مع 250 mL من ايماك العازلة وجمع أول 50 مل من التملص. استنزاف العازلة الغسيل إلى ارتفاع حجم السرير الراتنج وإغلاق محبس علي العمود.</li>
	<li>أضافه 1 مل من مركزه 10 ملغ/مل الحيوي بيبتيديسك الببتيد الحل (الجدول 1) إلى العمود. أضافه 50 mL من تمييع 1 ملغ/مل الحيوي البيتيديسك الببتيد محلول في TSG ويحرك الراتنج مع قضيب زجاجي لأعاده تعليق الخرز في TSG.</li>
	<li>بعد الملائمة للبيبتيديسك ، والسماح للراتنج لتسويه واستنزاف الزائدة 1 مغ/مل الحيوي-Peptidisc الحل من خلال الراتنج.</li>
	<li>غسل الجسيمات peptidisc المرفقة ني-NTA مع 50 mL من TSG. Elute جزيئات البيتيديسك مع 15 مل من المخزن المؤقت ايماك الشطف (الجدول 1) التي تحتوي علي 600 mM ايميدازول في tsg. جمع 1 مل الكسور وأضافه علي الفور 10 μL من 0.5 M أدتا إلى مخلب أيونات النيكل. تحذير: أدتا هو مهيج.</li>
</ol>3-تقييم عمليه أعاده تشكيل البيتيكويك
<ol><li>تحليل الصفحات المخزونة<ol>
<li>تحميل 10 μl قسامات من المواد البداية ، flowthrough ، يغسل (es) ، والأجزاء التي لا يمكن التملص منها من تشكيل peptiquick علي 12 ٪ SDS-ديكاتبورينج هلام و اليكتروفوريس لمده 30 دقيقه في تيار مستمر من 60 mA.</li>
		<li>وصمه عار هلام مع صبغ الأزرق كوماسي ، destain الهلام ، وتصور علي الماسح الضوئي.</li>
	</ol>
</li>
	<li>الفصل اللوني لاستبعاد الحجم (SEC)<ol>
<li>استنادا إلى تحليل الصفحات 12 ٪ من أعاده تشكيل بيبتيكويك ، عزل وتجميع الكسور ذات الصلة ، والتركيز عليها باستخدام 30 المكثف الطرد المركزي للقطع. ملاحظه: في الفيديو المصاحب ، يتم تجميع الكسور F3-F7 معا وتتركز تحت 1 مل (حجم حلقه الحقن علي الجهاز SEC).</li>
		<li>حقن ~ 1 مل من الكسور ايماك المجمعة علي هلام الترشيح S200 (300/10) عمود بمعدل تدفق 0.25 mL/min في المخزن المؤقت TSG. جمع 1 مل من الكسور وتشغيلها علي 12 ٪ من هلام SDS لتحديد الكسور SEC إلى تجمع والتركيز. ملاحظه: قد يتم تجميع الكسور PeptiQuick التي يتم التملص منها دون تركيز ، وقد يتم حقن اليكووت علي SEC للتحقق من جوده أعاده التشكيل. هذا هو عنصر تحكم هام للبروتينات الغشائية التي يحتمل ان تكون حساسة للتجميع اثناء تركيز الطرد المركزي.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4-قياس التداخل بالبياير
<ol><li>الاعداد التجريبي ل BLI<ol>
<li>اعداد لوحه البئر 96 باليد. ملاحظه: يتم تعبئة جميع الآبار إلى الحجم النهائي من 200 μL.</li>
		<li>في العمود 1 ، الصفوف ا − E ، تحميل 200 μL من المخزن المؤقت حركيه للسماح تلميحات لتتوازن وتشكيل اشاره الأساس.</li>
		<li>تمييع يجند (fhua في بيو-بيبتيديسك) إلى تركيز 2.5 ميكروغرام/مل في العازلة حركيه (الجدول 1). تحميل 200 μL من هذا التخفيف إلى صفوف ا − D في العمود 2.</li>
		<li>أضافه 200 μL من المخزن المؤقت الحركية فقط إلى E2 (مستشعر المرجع).</li>
		<li>أضافه 200 μL من المخزن المؤقت حركيه إلى العمود 3 ، صفوف ا − E لغسل FhuA الزائدة من الطرف.</li>
		<li>في العمود 4 ، اجراء التخفيفات التسلسلية مرتين من التحليلية (ColM) أسفل اللوحة من A4 إلى D4. تبدا مع 28 نانومتر (8 * Kd) في A4 إلى 3.5 nM (1 * Kd) في D4.</li>
		<li>أضافه 28 نانومتر ColM إلى E4 لقياس لربط غير محدده (اعلي تركيز ColM المستخدمة).</li>
		<li>أضافه 200 μL من المخزن المؤقت للحركية إلى العمود 5 ، صفوف ا − E. ملاحظه: هنا ، سيتم فك الColM من الطرف ، ويتم قياس التفكك.</li>
		<li>ضع لوحه الاعداد في أداه BLI.</li>
		<li>ضع صينية طرف المستشعر في أداه BLI.</li>
		<li>افتح برنامج الحصول علي بيانات BLI وحدد تجربه حركيه جديده علي معالج البرامج.</li>
		<li>استخدام علامة التبويب تعريف لوحه لإدخال تخطيط لوحه جيدا 96 في البرنامج. ملاحظه: الآبار التي تحتوي علي ligand ، fhua يتم إدخالها ك "تحميل". الآبار التي تحتوي علي المخزن المؤقت فقط يتم إدخالها ك "المخزن المؤقت". الآبار التي تحتوي علي التحاليل ، ColM ، يتم إدخالها علي انها "العينة".</li>
		<li>استخدم علامة التبويب تعريف الفحص لتحديد طول الوقت وسرعه دوران اللوحة لكل خطوه في التجربة. ملاحظه: يتم اعداد الخطوات التجريبية ك: 1) الأساس: 60 s; 2) التحميل: 250 s ؛ 3) للأساس 2:300 s ؛ 4) الجمعية: 450 s ؛ و 5) التفكك: 900 s. اترك سرعه الاهتزاز كافتراضي (1,000 دوره في الدقيقة). يتم تعيين الخطوات المذكورة أعلاه بشكل فردي لكل عمود في لوحه البئر 96 عن طريق تحديد الخطوة المطلوبة وانقر بزر الماوس الأيمن فوق أضافه خطوه فحص علي كل عمود.</li>
		<li>تعيين الخطوة الاولي عن طريق النقر بزر الأيمن علي العمود الأول وحدد بدء فحص جديد. تاكد من تعيين خطوه الأساس بشكل صحيح باستخدام اطار ايمن السفلي والتغيير مع القائمة المنسدلة حسب الحاجة.</li>
		<li>تعيين الخطوات التالية لكل عمود عن طريق النقر بزر الأيمن علي طول لوحه وتحديد أضافه الفحص الخطوة. تعيين هذه إلى العمود المناسب ، كما هو موضح في الخطوة 4.1.13.</li>
		<li>استخدم علامة التبويب تعيين المستشعر للتاكد من ان الاداه ثماني بتات تاخذ دبابيس BLI من الموقع الصحيح في علبه المستشعر. ملاحظه: في علامة التبويب تعيين المستشعر ، يجب ان يتم تمييز A1-E1 فقط باللون الأزرق. تاكد من وجود طرف مستشعر في هذه المواقع في درج المستشعر وتاكد من ان F1 − H1 فارغه.</li>
		<li>قم بتمييز F1 − H1 علي الشاشة ، ثم انقر بزر الماوس الأيمن وحدد أزاله لوضع علامة عليها كفارغه. القراد استبدال أجهزه الاستشعار في علبه بعد استخدامها للاحتفاظ أجهزه الاستشعار المستخدمة.</li>
		<li>في علامة التبويب تجربه المراجعة ، التي توفر نظره عامه نهائيه للتجربة قبل التنفيذ ، انتقل إلى الخطوات التجريبية للتاكد من صحة الاعداد بأكمله.</li>
		<li>في علامة التبويب تشغيل التجربة ، حدد موقع ملف لحفظ ملفات الأسلوب.</li>
		<li>تغيير درجه حرارة اللوحة إلى درجه حرارة الغرفة.</li>
		<li>حدد انتقال لتشغيل التجربة.</li>
	</ol></li>
	<li>تحليل بيانات BLI<ol>
<li>افتح برنامج Octet BLI لتحليل البيانات.</li>
		<li>استخدم علامة التبويب تحديد البيانات لتحديد موقع التجربة والتحقق من الملخص التجريبي. استيراد ملف المشروع من موقع الحفظ الخاص به المعرفة اثناء الخطوة 4.1.19.</li>
		<li>إدخال تركيزات التحاليل (هنا ، ColM) عن طريق تحديد معلومات المستشعر لكل تجربه.</li>
		<li>تعيين التلميح في E1 كتلميح المرجع.</li>
		<li>استخدم علامة التبويب معالجه لطرح اشاره مرجعيه (E1) من البيانات التجريبية. تحقق من البيانات الاوليه من الطرف المرجعي للربط التحليلي غير المحدد. إذا لم يتم ملاحظه اي منها ، المضي قدما. ملاحظه: هذا عنصر تحكم سلبي هام. في حاله ملاحظه الربط غير المحدد ، سيتم احتساب ذلك في الخطوة 4.2.7.</li>
		<li>محاذاة المحور ص إلى الخطوة الاساسيه الثانية. لا تقم بوضع علامة علي الاتصال interstep. حدد تصفيه سافيتزكي-جولاي. حدد معالجه البيانات!.</li>
		<li>في علامة التبويب تحليل ، حدد البيانات التجريبية في الجدول أدناه المؤامرة لرؤية الاقتران ومنحنيات التفكك مع اشاره من مستشعر المرجع طرح.</li>
		<li>حدد نموذج الربط 1:1 وحدد المنحني الجزئي المناسب. حدد تناسب المنحنيات!.</li>
		<li>تحليل مؤامرة العرض المتبقية للتحقق من تركيب المنحني.</li>
		<li>مرر عبر الجدول لرؤيةالدالةK المحسوبة.</li>
		<li>حدد حفظ التقرير. .. لحفظ مستند جدول بيانات يفصل الاعداد والمخططات الاوليه وتحليلها وثوابت التفكك المحسوبة.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Rawlings, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+always+an+insoluble+problem.">Membrane proteins: always an insoluble problem.</a> Biochemical Society Transactions. 44 (3), 790-795 (2016).</li><li>Popot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphipols,+Nanodiscs,+and+Fluorinated+Surfactants:+Three+Non+Conventional+Approaches+to+Studying+Membrane+Proteins+in+Aqueous+Solutions.">Amphipols, Nanodiscs, and Fluorinated Surfactants: Three Non Conventional Approaches to Studying Membrane Proteins in Aqueous Solutions.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 737-775 (2010).</li><li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Detergent-Free+Isolation+of+Membrane+Proteins+in+their+Local+Lipid+Environment.">A Method for Detergent-Free Isolation of Membrane Proteins in their Local Lipid Environment.</a> Nature Protocols. 11, 1149-1162 (2016).</li><li>Frauenfeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Saposin-Lipoprotein+Nanoparticle+System+for+Membrane+Proteins.">A Saposin-Lipoprotein Nanoparticle System for Membrane Proteins.</a> Nature Methods. 13, 345-351 (2016).</li><li>Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Single+Bacteriorhodopsin+Trimers+in+Bilayer+Nanodiscs.">Assembly of Single Bacteriorhodopsin Trimers in Bilayer Nanodiscs.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 450, 215-222 (2006).</li><li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Self-Assembly+of+Monodisperse+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+with+Controlled+Size.">Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size.</a> Journal of the American Chemical Society. 126, 3477-3487 (2004).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+for+Structural+and+Functional+Studies+of+Membrane+Proteins.">Nanodiscs for Structural and Functional Studies of Membrane Proteins.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 23, 481-486 (2016).</li><li>Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+Facilitate+High-Resolution+Structure+Determination+of+Membrane+Proteins.">Optimized Phospholipid Bilayer Nanodiscs Facilitate High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 1919-1925 (2013).</li><li>Carlson, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Peptidisc,+A+Simple+Method+for+Stabilizing+Membrane+Proteins+in+Detergent-Free+Solution.">The Peptidisc, A Simple Method for Stabilizing Membrane Proteins in Detergent-Free Solution.</a> eLife. 7, 34085 (2018).</li><li>Carlson, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+E.+coli+Membrane+Interactome+Captured+in+Peptidisc+Libraries.">Profiling the E. coli Membrane Interactome Captured in Peptidisc Libraries.</a> eLife. 8, 46615 (2019).</li><li>Serdakowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+residual+detergent+in+biological+samples+post+endotoxin+reduction+treatment+and+evaluation+of+strategies+for+subsequent+detergent+removal.">A novel method to determine residual detergent in biological samples post endotoxin reduction treatment and evaluation of strategies for subsequent detergent removal.</a> International Immunopharmacology. 37, 16-22 (2016).</li><li>Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+Purification+of+Membrane+Proteins.">Strategies for the Purification of Membrane Proteins.</a> Protein Chromatography. 681, 485-496 (2011).</li><li>Lin, S. H., Guidotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Membrane+Proteins.">Purification of Membrane Proteins.</a> Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).</li><li>Wolfe, A. J., Gugel, J. F., Chen, M., Movileanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+Membrane+Protein-Detergent+Interactions+Depend+on+Protein+Electrostatics.">Kinetics of Membrane Protein-Detergent Interactions Depend on Protein Electrostatics.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122 (41), 9471-9481 (2018).</li><li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Phospholipid+Exchange+between+a+Detergent-Solubilized+Membrane+Protein+and+Lipid-Detergent+Mixed+Micelles:+Brominated+Phospholipids+as+Tools+to+Follow+Its+Kinetics.">Slow Phospholipid Exchange between a Detergent-Solubilized Membrane Protein and Lipid-Detergent Mixed Micelles: Brominated Phospholipids as Tools to Follow Its Kinetics.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170481 (2017).</li><li>Mills, A. T., Le H, T., Coulton, J. W., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FhuA+Interactions+in+a+Detergent-Free+Nanodisc+Environment.">FhuA Interactions in a Detergent-Free Nanodisc Environment.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (1), 364-371 (2014).</li><li>Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-Exclusion+Chromatography+for+the+Analysis+of+Protein+Biotherapeutics+and+their+Aggregates.">Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates.</a> Journal of Liquid Chromatography Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).</li><li>Mahler, H. C., Friess, W., Grauschopf, U., Kiese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation:+Pathways,+induction+factors+and+analysis.">Protein aggregation: Pathways, induction factors and analysis.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (9), 2909-2934 (2009).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+proximity-based+labeling+methods+for+interactome+mapping.">Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping.</a> F1000Research. 8, 135 (2019).</li></ol>

FD هو مؤسس للتكنولوجيا الحيوية Peptidisc لتوزيع الببتيدات بيبتيديسك إلى المجتمع الأكاديمي. Peptidisc التكنولوجيا الحيوية هو أيضا شراكه مع التكنولوجيا الحيوية الصناعية وشركات الادويه لتنفيذ peptidisc في مهامهم اكتشاف سير العمل. تمت رعاية منشور "الوصول المفتوح" لهذه المقالة من قبل FortéBio.

في حين تبقي المنظفات ابسط طريقه لاستخراج وتنقيه البروتينات الغشائية ، يمكن ان يكون لهذه السطحية العديد من الآثار غير المرغوب فيها علي استقرار البروتين ، وظيفة ، وتحليلات المصب1،2،3، 4،5،6،7،8،9. وقد حفزت هذه الصعوبات تطوير الاغشيه الغشائية ، والتي تسعي إلى التقليل من وجود المنظفات وتكرار بيئة الغشاء الأصلي قدر الإمكان2،3،4 و5و6. بيد ان غالبيه أساليب أعاده التشكيل تتطلب تحسينا كبيرا في ظروف أعاده التشكيل وكثيرا ما تتطلب خطوات تنقيه اضافيه ، مما يخفض العائد النهائي7و8. و peptidisc تتكيف تلقائيا مع البروتين الغشاء الهدف ونسبيا ، يتطلب التحسين قليلا وتنقيه المصب9،10. في هذا البروتوكول ، يتم تقديم PeptiQuick كوسيلة بسيطه لتبسيط بروتوكول أعاده التشكيل لتحليل تفاعل البروتين والبروتين المصب.
علي الرغم من ان واضحة ، وهناك العديد من المحاذير التجريبية التي يمكن ان تؤدي إلى أعاده تشكيل غير ناجحه. من بين هذه, الأكثر شيوعا ويرجع ذلك إلى تراكم البروتين. ولذلك فمن الاهميه بمكان اجراء الفصل اللوني لاستبعاد الحجم لرصد عمليه أعاده التشكيل. علي سبيل المثال ، حجم الاستبعاد الذروة التملص في حجم الفراغ يدل علي مجاميع البروتين (الشكل 3 ب)17،18. تتشكل مجاميع البروتين الغشائي عاده عند التعرض لفترات طويلة لظروف المنظفات دون الأمثل قبل أعاده التشكيل. علي وجه الخصوص ، تم العثور علي ان البروتينات الغشائية في المنظفات تميل إلى تشكيل المجاميع عندما تتركز عن طريق الترشيح الفائق علي أجهزه الطرد المركزي. في هذه الحالة ، يمكن ان تتركز البروتينات الغشاء الحساسة باستخدام فراغ فائقه الترشيح ، وهو أسلوب الطف وأكثر تجانسا من التركيز منذ الامتزاز من البروتينات إلى فلتر يتناقص.
بشكل عام ، لتجنب تركيز البروتين ، يجب تجميع كسور IMAC التي لا يمكن التملص منها ، وحقن القرص الصغير في عمود استبعاد الحجم للتحقق من جوده التشكيل. وتجدر الاشاره إلى ان الحرة غير المدمجة الببتيد التملص فقط بعد ذروه peptidisc الرئيسي (الشكل 3B). السقالة الحرة لا تعيق بالضرورة التجارب المصب. ومع ذلك ، إذا لزم الأمر ، يمكن أزاله هذا الفائض بواسطة اللوني استبعاد الحجم. بدلا من ذلك ، وزيادة حجم الغسيل اثناء أعاده تشكيل ، وقبل التملص من الراتنج ايماك ، هو ما يكفي لأزاله بشكل فعال معظم الببتيد بيبتيديسك الحرة. لذلك ، يوصي بالفصل اللوني لاستبعاد الحجم كوسيلة سريعة وبسيطه للتحقق من جوده أعاده التشكيل.
تتطلب تجربه BLI التحسين الدقيق لتركيزات الربط والتحاليل. يجب ان يكون ربط ligand كافيه للحصول علي اشاره واضحة ، ولكن الحمولة الزائدة سوف يسبب تشبع الاشاره ، مما يؤدي إلى التحف البيانات من الاكتظاظ والعوائق فراغي علي سطح الطرف. ولذلك ، فان كلا من تركيز الربط وطول الوقت الذي ينفقه الطرف في الحل يجب ان يكون أمثل لكل عينه بروتين (الشكل التكميلي 2). ويجب أيضا تحسين تركيز التحاليل. إذا كانت ثابته التفكك معروفه ، تصبح هذه الخطوة أسهل ، لأنه يمكن تقريب نطاق التركيز. نقطه انطلاق جيده لهذا التحليل هو استخدام تركيزات البروتين بين 0.1-و 20-اضعاف المتوقع19د. ك.
بعد الحصول علي بيانات BLI ، يجب اجراء تحليل دقيق للبيانات لتجنب سوء التفسير. يعتمد حساب ثابت التفكك علي احتواء منحني الربط. الا إذا كانت القياسات إلزاميه الملزمة معروفه بالفعل ، يجب استخدام نموذج التفاعل الكلاسيكي 1:1 ثنائيه الجزيئات للتركيب الاولي. وتجدر الاشاره إلى ان المنحني الملزم غير المتجانس غالبا ما يكون نتيجة للسلوك الحرفي والسلوك غير المثالي الناجم عن ارتفاع تركيز التحاليل ، والذي يمكن تفسيره بأنه نموذج ملزم معقد. ولذلك ، خفض تركيز التحليلية حتى يعرض التشكيل الجانبي sensorgram 1:1 قياس الانحناء ربط يمكن ان تساعد علي التفريق بين الربط غير المتجانسة من التفاعلات أكثر تعقيدا. ثم يتم خصم اي بيانات الربط غير المتجانسة المتبقية كما هو مبين في الشكل 420.
في هذا التقرير ، يتم قياس ثابت التفكك من 2.28 ± 0.74 nM للتفاعل ColM FhuA. هذه القيمة متوافقة مع ثابت التفكك المحدد سابقا في مجموعتنا مع نانوديسك أو البيتيديسك باستخدام مركز التجارة الكترونيه أو MST ، علي التوالي (الشكل 4e)16. يوفر هذا التناسق الثقة حول أعاده تكوين البيكتيديسك وتحليل BLI كوسيلة لتحديد حركيه التفاعل. الأهم من ذلك ، تجدر الاشاره إلى ان البروتينات عاده ما يتم تعبئتها علي المواد البيولوجية العقديات اما عن طريق الربط الكيميائي البيوتين أو بالاضافه إلى موقع محدده باستخدام e. القولونية البيوتين البيره21. من الواضح ان التعكر الحيوي لسقالة البيتيديسك ، بدلا من البروتين الغشاء المستهدف ، له العديد من المزايا. الحيوية سقالة يوفر الوقت ويقلل من القدرة علي تعطيل المواقع الهامه البروتين ملزمه. وقد وجدنا أيضا ان PeptiQuick ينطبق علي مجموعه واسعه من الطبقات المستهدفة البروتين ، بما في ذلك مستقبلات G-البروتين المقرونة (GPCRs) ، قنوات أيون ، والبروتينات غشاء β-برميل. بشكل عام ، تجدر الاشاره إلى ان استخراج المنظفات الاوليه من البروتينات الغشائية في حاله الكلي الحرة أمر بالغ الاهميه ، وان أعاده التشكيل الفوري في peptidisc يقلل من مشاكل التجميع المصب. ونظرا للبساطة ، فانه من المتصور انه سيتم توسيع peptiquick ليشمل الاختبارات الملزمة الأخرى المستندة إلى العقديات ، مثل رنين البلازمون سطحي السطحي (موارد الاستخدام الخاصة) ، واختبارات اليسا ، والتقارب بين السحب باستخدام خرز سترافيدين.

وغالبا ما تستبعد البروتينات غشاء من المخدرات أو الأجسام المضادة اكتشاف البرامج البحثية بسبب الميل من البروتينات الغشاء لتجميع خارج البيئة الدهنية الطبقات ، وخاصه في وجود المنظفات1. ولذلك ، في السنوات الاخيره ، تم تطوير العديد من المحاكاة الغشائية (تسمي السقالات) لتسهيل العزلة والاستجواب من البروتينات الغشائية في بيئة خاليه تماما من المنظفات (اي ، أقراص النانو ، SMALPs ، البرمائيات ، الخ) 2،3،4،5،6. ومع ذلك ، فان أعاده تكوين البروتينات الغشائية في هذه الميميتيكس غالبا ما يتطلب التحسين الشامل ، والذي يستغرق وقتا طويلا ويرافقه عموما مع فقدان البروتين الانتعاش7،8. وللتغلب علي هذه القيود ، طور مختبرنا مؤخرا صيغه "مقاس واحد يناسب الجميع" تعرف باسم بيبتيديسك9. يتم تشكيل peptidisc عندما نسخ متعددة من مصمم 4.5 ده البرمائية البرمائيات ربط الببتيد إلى سطح مسعور من بروتين الغشاء المستهدف. أعاده مستقره في البيتيديسك يحدث عند أزاله المنظفات ، والدخول علي حد سواء الدهون الذاتية والبروتينات الغشاء solubilized في جزيئات قابله للذوبان في الماء. هذه الجزيئات استقرت الآن قابله للعديد من التطبيقات المصب.
طريقه peptidisc يقدم العديد من المزايا; علي سبيل المثال ، أعاده التشكيل واضحة ، حيث ان ربط سقالة البيتيديسك علي الهدف يسترشد بقالب البروتين نفسه9،10. القياس الببتيد هو أيضا تحديد الذات ، وأضافه الدهون الخارجية ليس من الضروري. تكوين البيتيديسك يحدث عن طريق تخفيف المنظفات بسيطه ، ميزه هامه علي غسيل الكلي أو الامتزاز علي الخرز البوليسترين ، والتي غالبا ما تؤدي إلى انخفاض البروتين الغلة بسبب غير محدده الجمعية السطحية والتجميع11،12 ،13. الجمعية بيبتيديسك النهائي هو حراريا للغاية وقابل للذوبان دائما في مخازن مختلفه أو في وجود الكاتيونات ثنائي التكافؤ (علي سبيل المثال ، Ni2 +). نقاء وتجانس الهيكلية للسقالة هو أيضا عاليه (علي سبيل المثال ، اندوتوكسين خاليه) ، ويمكن تخصيص الببتيد مع المجموعات الوظيفية وضعت في مواقف مختلفه.
نحن نقدم هنا سير عمل المختبر يسمي PeptiQuick ، والمعروف أيضا باسم الخرز أعاده تشكيل9. يجمع هذا البروتوكول بين تنقيه البروتين الغشائي وأعاده تكوين البيتيديسك في خطوه واحده وعلي نفس الدعم الكروماتوغرافي. وكما يشير الاسم ، فان PeptiQuick سريع مقارنه بطرق أعاده التشكيل الأخرى ، كما انه يقلل بشكل خطير من وقت التعرض للتنظيف. اثار المنظفات السلبية مثل البروتين تتكشف والتراكم غالبا ما تحدث بطريقه تعتمد علي الوقت; لذلك ، التقليل من التعرض للتنظيف أمر بالغ الاهميه للمحافظة علي البروتين الأصلي14،15. وهذا أمر بالغ الاهميه لدقه الطرق التي تبلغ عن تفاعلات البروتين وأوجه التقارب الملزمة.
اثناء تطوير هذا البروتوكول ، ونحن نقدم رواية النسخة الحيوية من سقالة peptidisc ، وتسمي بيو بيبتيديسك. المجموعات الوظيفية البيوتين تسمح المرفق من البروتين الغشاء المستهدف علي الأسطح المغلفة العقديات. منذ الوسم البيوتين يقتصر علي سقالة ، ومواقع ملزمه علي البروتين الغشاء الهدف تبقي دون تغيير. باستخدام بيو-بيبتيديسك ، يتم تحديد حركيه ملزمه من مستقبلات الغشاء البكتيري FhuA ومضادات الميكروبات كوليسين M (ColM)16. ويقاس هذا التقارب عن طريق قياس التداخل البسيط (BLI) ، الذي يحلل التفاعلات في الوقت الحقيقي استنادا إلى أنماط تداخل الضوء الأبيض المنعكسة من طرف مستشعر.
باستخدام هذا البروتوكول ، يتم التخلص من الحاجة إلى المنظفات اثناء تحليل BLI ، وهو تطور مهم ، حيث ان المنظفات يمكن ان تعطل التفاعلات. ويمكن قياس أوجه التقارب الملزمة بسرعة بهذه الطريقة ، وتكون النتائج مماثله لتلك التي ابلغ عنها في وقت سابق باستخدام أقراص النانو والمعايرة الحرارية للقياس الحجمي (ITC)16. يتم عرض الخطوات الهامه في سير العمل PeptiQuick ومناقشتها ، مثل اعداد البروتين ، وتخفيف المنظفات ، وأضافه الببتيد ، وأعاده التشكيل ، إلى جانب نصائح لاستكشاف الأخطاء المرتبطة بالربط والتحلل في فحص BLI. باستخدام سير العمل PeptiQuick ، وجد ان البروتينات الغشائية يمكن التقاطها في أقراص البيتينات وتفاعلاتها تقاس في غضون يوم واحد.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 kDa cut-off centrifugal concentrator</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7715</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td>Sodium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Peptidisc Peptide</td>
			<td>Peptidisc Biotech</td>
			<td>https://peptidisc.com</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Biotechnology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ettan LC (AKTA)</td>
			<td>Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td>18-1145-58</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>Anhydrous, Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>Biotechnology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryldimethylamine oxide (LDAO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>101822204</td>
			<td>~30% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidizer</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>M-110L</td>
			<td>Fit with F20Y 75&#181; diruption chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Resin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>H-320-50</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-binding 96well BLI Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655076</td>
			<td>Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red96</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>OCTET RED96E-GxP</td>
			<td>Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7626</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Dye - Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Used in the bradford assay to determine protein concentration - 5x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>Biotechnology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin (SA) Biosensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5019</td>
			<td>One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex S200 (300/10)</td>
			<td>Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td>175175-01</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>69271</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>900998-1</td>
			<td>Biotechnology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td>Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>365668</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

peptiquick, a one-step incorporation of membrane proteins into biotinylated peptidiscs for streamlined protein binding assays

البروتينات الغشائية ، بما في ذلك الناقلات والقناات والمستقبلات ، تشكل ما يقرب من ربع البروتينية الخلوية وأكثر من نصف الأهداف الحالية للمخدرات. ومع ذلك ، فان أحد العوائق الرئيسية التي تحول دون توصيفها واستغلالها في الأوساط الاكاديميه أو الصناعية هو ان معظم استراتيجيات الفحص البيوكيميائية والبيوفيزيائية والدوائية تتطلب ان تكون هذه البروتينات في حاله قابله للذوبان في الماء. طور مختبرنا مؤخرا البيتيديسك ، وهو الغشاء الذي يقدم نهج "مقاس واحد يناسب الجميع" لمشكله ذوبان البروتين الغشائي. نقدم هنا بروتوكولا مبسطا يجمع بين تنقيه البروتين وأعاده تشكيل البيتيديسك في خطوه واحده للكروماتوغرافي. هذا سير العمل ، وتسمي PeptiQuick ، يسمح لتجاوز غسيل الكلي والحضانة مع الخرز البوليسترين ، التالي الحد بشكل كبير من التعرض للتنظيف ، والبروتين التشبع ، وفقدان العينة. عندما يتم تنفيذ PeptiQuick مع السقالات الحيوية ، يمكن ربط الاعداد مباشره بالأسطح المغطية بالمكورات العقديه. ليست هناك حاجه إلى التعكر الحيوي أو تعديل هدف البروتين الغشاء. يتم عرض PeptiQuick هنا مع مستقبلات الغشاء FhuA ومضادات الميكروبات الليكوليسين M ، وذلك باستخدام قياس التداخل بالشكل الدقيق لتحديد الحركية الدقيقة للتفاعل بينهما. ويخلص إلى ان PeptiQuick هو وسيله مريحه لاعداد وتحليل غشاء البروتين-ligand التفاعلات في غضون يوم واحد في بيئة خاليه من المنظفات.

يتم التعبير عن مستقبلات الغشاء FhuA في المختبر e. كولاي سلاله. يتم حصاد الجزء الغشاء الخارجي من قبل الطرد ، والبروتينات مذابه باستخدام استخراج المنظفات من خطوتين. يتم تحميل البروتينات غشاء solubilized علي الخرز Ni-NTA معباه في عمود من البلاستيك ، تليها سير العمل PeptiQuick كما هو مبين في البروتوكول. بعد مراقبه الجودة باستخدام الفصل اللوني الاستبعاد الحجم ، يتم تعبئة جزيئات بيو-بيبتيديسك علي دبابيس المغلفة العقديات. يتم اجراء تحليل BLI لقياس حركيه التفاعلات بين FhuA و ColM. ويرد العرض التخطيطي لهذه التجربة في الشكل 1.
يتم تشغيل هلام SDS لتحديد نوعيه أعاده تشكيل بعد التملص من الجزيئات FhuA بيو-بيبتيديسك من العمود IMAC (الشكل 2). يتم تحميل aliquots من الكسور المقابلة للبدء ، تدفق ، يغسل ، والأجزاء الشطف علي SDS-هلام لتقييم نجاح أسلوب PeptiQuick. ويرتبط استنزاف FhuA في كسر الجريان مع إثراء في الكسور الشطف ، مما يدل علي ان تنقيه البروتين كانت فعاله. لوحظت عصابات البروتين الملوث الصغيرة في الكسور التي لا يمكن التملص منها. يتم استخدام تحليل الهلام SDS لتحديد الكسور التي يجب تجميعها قبل تحليل SEC. يتم تشغيل هلام الأصلي من الجزيئات FhuA بيو-بيبتيديسك لتاكيد FhuA الذوبان (الشكل التكميلي 1). الهجرة من البروتين المعاد تشكيله في هلام الأصلي يشير إلى البروتين الذوبان في بيئة خاليه من المنظفات.
يتم اجراء تحليل SEC لتقييم قابليه الذوبان في جزيئات البيتيديسك. ويظهر الكروماتوجرام في الشكل 3A الذروة واحده متناظرة التملص في حوالي 14 مل (6 مل الماضية حجم الفراغ من 8.0 مل علي الترشيح هلام S200 10/300 العمود). موقف هذه الذروة ، في الماضي حجم الفراغ ، ويؤكد ذوبان جزيئات FhuA بيو-بيبتيديسك. للرجوع اليها ، يوضح الشكل 3B اعداد البيتيديسك النظري الأمثل. في هذه الحالة ، يظهر الكروماتوجرام ذروه البروتين الكبيرة التي تفلت من حجم الفراغ ، مما يشير إلى وجود مجاميع البروتين. الذروة أصغر التملص فقط الماضية الذروة peptidisc الرئيسية يتوافق مع الببتيدات بيبتيديسك الزائدة.
يتم تحديد التفاعل من FhuA مع ColM التحليلية بعد المرفق من البيتياقراص إلى أجهزه الاستشعار المغلفة العقديات. نصائح الاستشعار هي المعايرتها الاولي في العازلة الحركية ، ثم نقلها إلى العازلة التي تحتوي علي FhuA بيو-Peptidiscs. يتم تحسين تركيز الاقراص الحيوية FhuA وطول الفترة الزمنيه التي يتم احتضانها مع الطرف قبل هذه التجربة (الشكل التكميلي 1). بعد خطوات التحميل والغسيل ، خطوه الجمعية يقيس التفاعلات بين النصائح المحملة وأربعه تركيزات مختلفه من الكوليسين م. الحركة اللاحقة من النصائح مره أخرى إلى نتائج العازلة في التفكك ، والذي يقاس بواسطة التحول الطول الموجي من الضوء الأبيض تعكس قباله غيض.
الشكل 4A يعرض الناتج sensorgram البيانات الخام من هذه التجربة. تظهر كافة التتبعات الموحدة في خطوات التحميل والخط الأساسي ، باستثناء التتبع المرجعي باللون الأصفر. التلميح المرجعي لا يحتوي علي الاربطه ولكنه يتعرض للتحليل لفحصه للربط غير المحدد ، وهو عنصر تحكم سلبي هام. لمزيد من التحليل التفصيلي للنتائج ، يتم طرح الاشاره من التلميح المرجعي من الآثار الخاصة بالتلميحات التجريبية لحساب الربط غير المحدد. تتم محاذاة البيانات إلى بداية خطوه الاقتران للسماح باجراء مقارنه مرئية مباشره ، كما هو موضح في الشكل 4B. وتظهر هذه المقارنة زيادة في تحول الطول الموجي لزيادة تركيزات الكوليسين م. ويتناسب المنحني مع البيانات ويعرض نموذجا كلاسيكيا 1:1 ملزما.
وتبين مؤامرة العرض المتبقية (الشكل 4 ب، القاع) ، التي تصف الاختلافات بين البيانات المناسبة والتجريبية ، ان التركيب لاعلي تركيز لColM (28 نانومتر) ضعيف مقارنه بالتركيزات الثلاثة المنخفضة. يفتقر التشكيل الجانبي للمنحني نفسه إلى الهضبة المنحنية الملزمة ، والتي تعتبر سمه لتشبع الموقع الملزم في تجربه ربط نموذجيه. عدم وجود هضبة يوحي ملزمه غير متجانسة ، والتي من المحتمل ان تكون قطعه أثريه من تركيز ColM عاليه. التالي ، فان هذا التركيز الأعلى ColM مخصوم من التحليل ، وتستخدم التركيزات الثلاثة الأخرى لتحديد ثابت التفكك (الشكل 4ج ، د). اختبار tالطالب ثنائي الذيل ، علي مستوي الثقة 95 ٪ ، وجدت ان ثابت التفكك لوحظ من هذه التجربة لا يختلف كثيرا عن القيم التي تم الحصول عليها باستخدام تقنيات مختلفه (الشكل 4e)16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60661/60661fig01.jpg"> الشكل 1: نظره عامه لسير العمل PeptiQuick باستخدام بيو-بيبتيديسك وتحليل BLI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60661/60661fig2a.jpg"> الشكل 2: تحليل هلام المخزون (12%) من البداية ، وتدفق ، وغسل ، والأجزاء التملص التي تم جمعها من خلال سير العمل PeptiQuick. تم تحميل حوالي 10 μL من عينه في كل حاره وتشغيل لمده 30 دقيقه في تيار مستمر من 60 mA. كان الهلام ملطخا باللون الأزرق كوماسي ، والذي تمت رؤيته علي ماسح الجل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661fig2alarge.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60661/60661fig3a.jpg"> الشكل 3: لمحات تجريبية ونظرية للثانية تمثل أعاده الدساتير المثلي وشبه الأمثل ، علي التوالي. (ا) الملف التجريبي للثانية من بيبتيكويك المعاد تشكيلها (~ 82 ده) في الاقراص الحيوية. تم تجميع كسور الامتصاص من IMAC F3-F7 وتركيزها باستخدام مكثف الطرد المركزي الذي تم قطعه لمده 30 كيلو. تم حقن هذه العينة المركزة في 0.25 mL/min علي هلام الترشيح S200 (10/300) عمود في المخزن المؤقت TSG. (ب) النظرية SEC الشخصية لأعاده تشكيل بيبتيكويك دون الأمثل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661fig3alarge.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60661/60661fig4b.jpg"> الشكل 4: التحقيق في تفاعلات ColM مع FhuA المعاد تشكيلها في بيو-بيبتيديسك. (ا) البيانات الخام sensorgram مع اشاره استشعار تتبع باللون الأصفر. (ب ، ج) الأعلى: خطوات الاقتران والتفكك مع تركيب منحني ربط 1:1 جزئيا. الأسفل: الآراء المتبقية التي تصور الفرق بين البيانات التجريبية والتركيب الحسابي. (ج) أعاده زرع (ب) مع استبعاد اعلي تركيز لColM. (د) معدلات الاقتران والتفكك الملحوظة (kon و koff، علي التوالي) وثوابت التفكك (كد). (ه) مقارنه ثوابت التفكك fhua-ColM التي تم الحصول عليها بواسطة البيتيديسك و BLI (في هذه التجربة) ، البيتيديسك والمقياس المجهري لإدرار البول (saville ، البيانات غير المنشورة) ، والأقراص النانويه والمعايرة الحرارية16. تمثل أشرطه الخطا SD واحده من عدم اليقين ، بينما نوفاسكوتيا يدل علي عدم وجود فرق كبير في مستوي الثقة 95%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661fig4alarge.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>مسنومكس ميديا (لكل لتر)</td>
		</tr>
<tr>
<td>200 mL الملح مسنومكس</td>
		</tr>
<tr>
<td>800 مل dH2س</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 مل 40 ٪ الجلوكوز</td>
		</tr>
<tr>
<td>80 μL 1 M CaCl2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.5 mL 1 M MgSO مستقره4
</td>
		</tr>
<tr>
<td>300 μL 15 ملغ/مل الثيامين</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>TSG العازلة</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 مم تريس-HCl ، pH 7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% الجلسرين</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IMAC غسل العازلة</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 مم تريس-HCl ، pH 7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ٪ الجلسرين</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.04% LDAO</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 مم ايميدازول</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الحيوي البيتيديسك الحل</td>
		</tr>
<tr>
<td>تذوب الاقراص الحيوية الجاهزة للاستخدام (> نقاء 95%) في الدرجةالثانيةمن التعقيم بالدرهم الإماراتي. تركيز وحجم الحل الببتيد يعتمد علي الخطوة في عمليه أعاده تشكيل.</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 مم تريس-HCl ، pH 7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ملاحظه: هذا المخزون الببتيد بيو-بيبتيديسك مستقره في 4 درجه مئوية لأكثر من شهر.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>المخزن المؤقت IMAC الelution</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 مم تريس-HCl ، pH 7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% الجلسرين</td>
		</tr>
<tr>
<td>600 مم ايميدازول</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>المخزن الحركي المؤقت</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 مم تريس-HCl ، pH 7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.002 ٪ توين-20</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1 في المائة</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: وصفات لاعداد وسائل الاعلام والحلول.
الشكل التكميلي 1:4% – 16% تحليل جل أصلي واضح لكسور الامتصاص التي تم جمعها من سير عمل PeptiQuick. تم تحميل حوالي 10 μL من عينه في كل حاره وتشغيل لمده 40 دقيقه في تيار ثابت من 30 مللي أمبير. كان الهلام ملطخا باللون الأزرق كوماسي ، والذي تمت رؤيته علي ماسح ضوئي. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661suppfig1alarge.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل هذا الرقم.</a>
الشكل التكميلي 2: التحسين الأمثل للتركيز باستخدام دبوس واحد. (ا) التركيزات الستة المختلفة لل fhua في بيو-بيبتيديسك التي تم اختبارها للربط بدبوس واحد مغطي بالالعقديات. هذا كان ثبتت فوق في 96 بئر لوحه مع مخزن مؤقت في الآبار بين [ليغس] تركيزات (رايت اضافيه ملف 1 لاعداد بروتوكول). (ب) البيانات الاوليه sensorgram لتجربه التحسين الأمثل. دبوس يعطي أكبر استجابه الاضافه إلى ذلك يصل إلى التشبع في تركيز رقم 4 (أو 2.5 ميكروغرام/مل). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661suppfig2alarge.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل هذا الرقم.</a>
ملف تكميلي 1. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60661/supplementalfile1.docx" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض هذا الملف (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).</a>

Watch this Scientific Journal Video about PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays at JoVE.com

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

نقدم طريقه تجمع بين تنقيه البروتين الغشائي وأعاده التشكيل إلى أقراص البيتيغرافيه في خطوه واحده للكروماتوغرافي. وتستخدم السقالات الحيوية للحصول علي المرفق السطحي المباشر وقياس التفاعلات البروتينية والبروتينات عن طريق قياس التداخل الحيوي.

PeptiQuick ، خطوه واحده لدمج البروتينات الغشائية في أقراص البيتيلات الحيوية لاختبارات ربط البروتين الانسيابية

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

الطريقة الكلاسيكية التي يتم استخراج البروتينات الغشاء لدراستهم هي عن طريق solubilization بسيطة في المنظفات. في حين أن هذا يوفر طريقة بسيطة وعالمية ، فقد ثبت أن المنظفات تغير الهيكل الأصلي ، وظيفة ونشاط هذه البروتينات الحساسة. هنا نقدم Peptidisc كحل لتثبيت البروتينات الغشاء في محلول خال من المنظفات.يتكيف نظام Peptidisc تلقائيًا مع حجم وشكل وطبولوجيا بروتينات الأغشية التي لا تعد ولا تحصى. هذا يقف على النقيض من المحاكاة الغشاء الأخرى التي تتطلب في كثير من الأحيان التحسين مملة. سوف يتم استخدام FHUA، وهو بروتين غشاء إشريلي خارجي، كبروتين مستهدف نموذجي يتم إعادة تشكيله في هذا البروتوكول.سيتم عزل حويصلات الغشاء الخارجي تليها إضافة منظف ل solubilize البروتينات الغشاء. يتم إضافة الببتيد الببتيدي إلى solubilization ويتم تخفيف المنظفات بعيدا، وتشكيل تلقائيا جزيئات الببتيديسك. هذه الجزيئات القابلة للذوبان استقرت الآن قابلة للتطبيقات المصب العديدة.وسيدرس هذا البروتوكول قياس التداخل في الطبقة الأحيائية كتطبيق لتكنولوجيا الببتديسك. سيركز هذا البروتوكول على طريقة إعادة تشكيل PeptiQuick، وهي تقنية مفيدة تسهل تنقية وإعادة تكوين غشاء البروتينات في وقت واحد. يتم تنفيذ طريقة PeptiQuick لإعادة تشكيل على الخرز في عمود الجاذبية IMAC النيكل NTA القياسية قبل توازنها في المنظفات.يتم تحميل الغشاء سولوبيلد على الراتنج ويتم غسلها البروتينات غير المستهدفة. بعد إضافة هذا الببتيد إلى العمود ويتم تخفيف المنظفات بسرعة. الجانب الهدّاب من الببتيد الببتيزك يرتبط بالمناطق المكشوفة من الماء.الجانب المائي من الببتيد يحافظ على البروتين القابل للذوبان في المحلول. الببتيد الزائد يُغسل. يتم إضافة إيميدازول إلى غضب إعادة تشكيلها.قد تكون وظيفية سقالة Peptidisc لتسمية غير مباشرة بروتينات الذاكرة وبالتالي فتح الباب أمام مجموعة أوسع من تحليلات المصب. هنا نستغل الببتيد الحيوي للتعلق بأجهزة الاستشعار المغلفة بالـ streptavidin لتحليل BLI. قياس التداخل في الطبقة الحيوية هو تقنية قوية خالية من التسميات للتحقيق في التفاعلات الجزيئية الحيوية في الحل.بالإضافة إلى إظهار التفاعلات ببساطة، تعطي هذه التقنية قراءات حركية في الوقت الحقيقي وتمكن من حساب ثابت الانفصال الملزم. من خلال هذا البروتوكول ، نلغي الحاجة إلى المنظفات أثناء تحليل BLI ، لأن هذا يمكن أن يغير النشاط. تحليل التداخل البيولوجي يحلل انتقال انتقال الضوء الأبيض المنعك من المستشعر، أو التلميح، وجزيئات الماكرو المقيدة أثناء التفاعل.لقياس التفاعلات، يتم تمرير تلميح الإحساس بين الحلول والإشارة المسجلة في كل خطوة. كل طرف ثم يعطي أثرها الخاص على sensogram. أولاً، يتم تأسيس أساس المخزن المؤقت فقط.ثانياً، الليغاند مرتبط. في هذه الحالة، FhuA وpetidiscs biotinylated يربط تلميح streptavidin منفوش. بعد ذلك، يتم غسل التلميح في المخزن المؤقت لإزالة أي FhuA غير منضم.الآن يتم نقل تلميح إلى حل مع تركيز المعروفة من التحليلات، هنا ColM. في حالة حدوث تفاعل، هذا سيعطي منحنى ربط. وأخيرا، يتم نقل طرف في العازلة والتفكك تقاس.يمكن استخدام المعدلات الملاحظة للارتباط والتفكك عند كل تركيز عمود لحساب ثابت الانفصام. يتم التعبير عن الهيكساهيستيدين الموسومة FhuA في سلالة E-القولونية AW740 لمدة 18 ساعة في وسائل الإعلام أمين. يتم حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 5،000 G 10 دقائق في أربع درجات مئوية.يتم إعادة تعليق بيليه الخلية الناتجة في المخزن المؤقت TSG ومن ثم dounced لتفريق كتل الخلوية وضمان تحلل شامل. يضاف TMSF إلى الخلايا التي أعيد تعليقها إلى تركيز نهائي من ملليمتر واحد فقط قبل تحلل. ويتحقق تحلل الخلية من خلال ثلاثة ممرات إما من خلال microfluidizer في 15، 000 PSI أو الصحافة الفرنسية في 8،000 PSI.يتم جمع الخلايا المهدرجة ويتم تنفيذ الطرد المركزي منخفض السرعة عند 5,000 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات. يتم تحميل افرا من دوران بطيئة السرعة في دوار TI70 الطرد المتطرف وطاردة في 200، 000 G لمدة 40 دقيقة في أربع درجات لبيد الغشاء القولونية الخام. بعد الطرد فائقة التركيز، يتم التخلص من المابير و غشاء بيليه الخام هو إعادة تعليق في كمية ضئيلة من المخزن المؤقت TSG.يتم dounced غشاء الخام لضمان تجانسه. يتم إجراء فحص برادفورد للتحقق من تركيز البروتين للغشاء الخام الذي أعيد تعليقه. يستخدم المخزن المؤقت TSG لتمييع الغشاء الخام إلى ما يقرب من ثلاثة ملليغرام لكل ملليلتر قبل solubilization.يتم إضافة تريتون X-100 إلى الغشاء الخام إعادة تعليق في تركيز نهائي من 1٪ ل سولوبيبليز انتقائي الغشاء الداخلي البكتيري. يتم تنفيذ Solubilization لمدة ساعة واحدة في أربع درجات، مع هزاز لطيف. يتم عزل الغشاء الخارجي غير المنمق عن طريق الطرد فائق التركيز عند 200، 000 G لمدة 40 دقيقة، في أربع درجات.يتم التخلص من المابير الناتجة التي تحتوي على الغشاء الداخلي المُنمق. في حين أن بيليه، التي تحتوي على الغشاء الخارجي، هو إعادة تعليق كما كان من قبل في TSG. يضاف LDAO إلى تركيز نهائي بنسبة 1٪ إلى الغشاء الخارجي الذي تم تعليقه ، ويتم تجميله لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات.وأخيرا، يتم تنفيذ طرد فائقة، كما كان من قبل، إلى بيليه المواد غير قابلة للذوبان. يحتوي المابير الناتج عن ذلك على غشاء خارجي مُنمق ، بما في ذلك هدفنا ، FhuA الموسوم له ، وهو جاهز الآن لتنقية IMAC وإعادة تشكيل Peptidisc. يتم توازن عمود جاذبية IMAC من النيكل NTA مسبقًا مع مجلدين من وحدات التخزين غسيل IMAC.يتم إضافة إيميدازول بتركيز نهائي من خمسة ملليمولار إلى الغشاء الخارجي سولوبيلي، مخففة إلى 0.04٪ LDAO. يتم تحميل الغشاء الخارجي solubilized على راتنج النيكل NTA، وتدفق من خلال جمعها. يتم إعادة تحميل هذا التدفق من خلال على الراتنج لزيادة ربط راتنج FhuA.بعد التحميل، يتم غسل الراتنج مع 250 ملليلتر من عازل غسل IMAC وأول 50 ملليلتر التي تم جمعها. بعد الغسيل ، يتم تصريف مخزن الغسيل إلى أعلى فقط من ارتفاع سرير الراتنج وأغلق العمود stopcock. يتم إضافة ملليلتر واحد من تتركز، 10 مليغرام لكل ملليلتر، الببتيد الببتيدي إلى العمود.بعد إضافة الببتيد المركز، 50 ملليلتر من التخفيف، واحد ملليغرام لكل ملليلتر، الببتيد الببتيدي في TSG يضاف. يحرك الراتنج لإعادة تعليق الخرز في TSG، تحت CMC من LDAO، وبالتالي تشكيل جزيئات Peptidisc. بعد الزخارف Peptidisc، ويسمح للراتنج لتسوية ويتم استنزاف واحد مليغرام لكل ميل الببتيد الملي من خلال الراتنج.يتم غسل الراتنج مع 50 ملليلتر TSG لإزالة الببتيد الببتيديس الزائد. وأخيراً، يتم تخفيف جزيئات الببتيش مع 50 ملليلتر من إيميدازول 600 ملليمولار في TSG. يتم جمع كسور ملليلتر واحدة وإضافة 10 ميكرولترات من 0.5 EDTA 0.5 edta الزرس، وهو أحد الأيونات النيكل الخفيفة الرئيسية المرشّبة.يتم تحميل البداية ، وتدفق من خلال ، وغسل ، وتهرب الكسور على هلام 12 ٪ SDS وكهرباء لمدة 30 دقيقة في 60 مللي amp. الجل ملطخة ومتخيلة على ماسح هلام. يظهر الهلام الناتج استنفاد FhuA في التدفق من خلال، والإثراء في elution.كما لوحظت نطاقات ملوثات طفيفة في الكسور المراوغة. يتم اختيار الكسور من ثلاثة إلى سبعة لوني استبعاد الحجم لتأكيد ذوبان FhuA Peptidisc ونضوب الملوثات. ويستخدم 30 كيلودوم قطع المكثف الطرد المركزي لتركيز الكسور من ثلاثة إلى سبعة.يتم حقن ملليلتر واحد من كسور التلميحات المجمعة من IMAC في عمود S200 بمعدل تدفق قدره 0.25 ملليلتر في الدقيقة في المخزن المؤقت لـ TSG. يتم جمع كسور ملليلتر واحد ويتم تشغيل هلام SDS 12٪ من الكسور. يتم تجميع الكسور ذات الصلة ويمكن الآن أن تستخدم في التطبيقات المتلقين للمعلومات.أجريت BLI في FORTEBio ثماني RED96. هذا الصك يتحرك دبابيس BLI عبر لوحة 96 جيدا الذي تم إعداده لأول مرة باليد. يتم تعبئة جميع الآبار إلى حجم النهائي من 200 ميكرولترات.العمود الأول محمل بمخزن حركي للسماح للنصائح بالتكدير وتشكيل إشارة خط الأساس. يتم تحميل العمود الثاني مع تركيز محدد مسبقا من العازلة يغاند والحركية. في هذه الحالة، FhuA هو يغاند، ويضاف إلى تركيز 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر.سيتم استخدام الطرف في الصف E كمرجع، ويتم تحميله بالمخزن المؤقت فقط. يتم تحميل العمود الثالث مع المخزن المؤقت الحركية لغسل FhuA الزائدة من الطرف. يتم تحميل مضاعفة مزدوجة التسلسلي من التحليلات، في هذه الحالة ColM، من أعلى إلى أسفل في العمود الرابع.وتستخدم أعلى هذه التركيزات للصف المرجعي، لقياس الربط غير المحدد من التحليل إلى طرف. العمود الخامس محمل بالمخزن المؤقت. هنا، سوف تتفكك العقيدة، والتفكك يقاس.بمجرد إعداد اللوحة، يتم تحميل صينية تلميح المستشعر واللوحة المعدة في أداة BLI. يتم فتح برنامج الحصول على البيانات BLI وبدأت تجربة حركية جديدة. يتم استخدام علامة التبويب "تعريف لوحة" لإدخال تخطيط لوحة 96-well في البرنامج.هنا في FhuA liga هو الإدخال والحمولة بينما التحليل ColM هو الإدخال كما عينة. يتم استخدام علامة التبويب تعريف Assay لتحديد طول الوقت وسرعة دوران اللوحة لكل خطوة في التجربة. هنا نشمل خطوة خط الأساس من 60 ثانية، تليها خطوة تحميل 250 ثانية، وخطوة خط الأساس الثانية من 300 ثانية، وخطوة اقتران التحليلات من 450 ثانية، وأخيرا خطوة فصل من 900 ثانية.يتم تعيين هذه الخطوات بشكل فردي لكل عمود في لوحة 96-جيدا عن طريق تحديد الخطوة المطلوبة والنقر بزر الماوس الأيمن على إضافة مُتَصَلّم على كل عمود. يتم استخدام علامة التبويب تعيين المستشعر للتأكد من أن أداة ثمانيت تأخذ دبابيس BLI من موقعها الصحيح في علبة المستشعر. توفر علامة التبويب مراجعة التجربة نظرة عامة نهائية على التجربة، قبل تنفيذها.سيتم الآن تنفيذ BLI من قبل RED ثمانيت. وستنتج عن ذلك صورة بيانات أولية من أجل تحليلها. يتم إجراء التحليل عن طريق فتح أولا برنامج تحليل البيانات الحيوية ثمانيه.يتم استخدام علامة التبويب تحديد البيانات لتحديد موقع التجربة والتحقق من الملخص التجريبي. تركيزات التحليل ColM هي الإدخال هنا. بعد ذلك، يتم استخدام علامة التبويب معالجة لطرح الإشارة المرجعية من البيانات التجريبية.يتم تعريف خط الأساس لمحاذاة المحور Y كما لو تم تطبيق معدل إزالة السبائك. وأخيراً، يتم تحديد "بيانات العملية". يتم عزل البيانات لهذه التجربة، ويتم تحديد Fit Curves.يتم اختيار اقتران جزئية وتركيب منحنى الانفصام. يتم حساب KD من هذا المناسب. يتم استخدام الكروماتوغرام استبعاد الحجم للتحقق من صحة إعادة تشكيل ambute.يُظهر الكروماتوغرام ذروة واحدة متناظرة، مما يشير إلى إعداد بروتين أحادي الصوت. ذروة elutes عدة ملليلتر بعد حجم الفراغ، مما يدل على جزيئات بيبديسك غير مجمعة قابلة للذوبان. سوف المجاميع البروتين تتر في حجم الفراغ، في حين أن المنظفات الزائدة والببتيد سوف تتر بعد الذروة الرئيسية.زيادة غسل Peptidiscs شكلت في حين لا تزال تعلق على حبات النيكل NTA ينبغي أن تستنفد هذه الذروة الأخيرة. المجاميع البروتين غالبا ما تكون نتيجة لتعرض بروتينات الذاكرة لمحلول المنظفات الحرة قبل إعادة تشكيل. هذا آخر استبعاد الكروماتوجرام هو تشخيص مفيدة لاستكشاف إعادة تشكيل واحد.بعد معالجة البيانات التجريبية، منحنى يصلح ل sensogram. دقة هذا التركيب ضروري لحساب ثابت الانفصام. ويصف مخطط العرض المتبقي الفرق بين البيانات التجريبية والتركيب الحسابي.وهذا يدل على أن لتركيزات العمود الأربعة المختلفة ثلاثة من المنحنيات تناسب جيدا. ومع ذلك، للحصول على أعلى تركيز المنحنى لا تنتج مناسباً. وهذا يشير إلى أنه في هذا التركيز الأعلى، هناك ربط غير متجانس من العمود إلى الدبوس.ولذلك فإن هذه الإشارة أعلى تركيز لا تدرج من التحليل الحركي وفقا لملاحظات التطبيق ForteBio. وتستخدم المنحنيات الثلاثة المتبقية للتحليل الحركي. ثابت الانفصام بين FhuA و ColM، يحدد باستخدام أسلوب BLI و Peptidisc، يتسق مع الثوابت التي تحددها أساليب أخرى.اثمر قياس التحلل الحراري والتوحيدي، والحرارة الدقيقة وPetidisc ثوابت الانفصام التي لا تختلف كثيرا عن قيمة تحديدنا. هذا الاتساق يؤكد صحة طريقة Peptidisc BLI لقياس حركية التفاعل. حسناً، لذلك، بعد مشاهدة هذا الفيديو، نأمل أن تكون قد اكتسبت فهمًا عمليًا لقوة وتحذير أساليب PeptiQuick.لقد وجدنا هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لتحديد حجم التفاعل FhuA ColM في الغياب الكامل للمنظفات. ونحن نشك في أن نفس سير العمل يمكن تطبيقها لتوصيف أي تفاعل مستقبلات يغاند أخرى. حظا سعيدا مع تجاربك.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

تنقية البروتينات السطحية للبروتينات الخلية من<em&gt; ريبيسفالوس ميكروبلوس</em&gt; الخلايا الظهارية الظهارية

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

الببتيدات اختراق الخلية بيوتينيلاتيد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين داخل الخلايا

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

خالية من المنظفات فائق السرعة إعادة تشكيل بروتينات الغشاء إلى بليرس الدهن باستخدام فوسوجينيك بروتيوليبوسوميس تكميلية مشحونة.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

عزل جزيئات البروتين الدهني من صفار بيض الدجاج لدراسة دمج الأحماض الدهنية المسببة للأمراض البكتيرية في الدهون الفوسفاتية الغشاء

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

إعادة تشكيل المستحضرات المؤتلفة Drosophila Atlastin في Liposomes لفحوصات خلط الدهون

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

قياس ارتباط النوكليوتيدات ببروتينات الغشاء الوظيفية السليمة في الوقت الفعلي

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...