Name: peptiquick, a one-step incorporation of membrane proteins into biotinylated peptidiscs for streamlined protein binding assays
Uploaded: 2019-11-02T15:00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays at JoVE.com

Vi tackar det naturvetenskapliga och tekniska forskningsrådet i Kanada. JS innehar en CGS-M CIHR stipendium. LT stöddes av bioteknik och biologisk vetenskap forskningsrådet-finansierat South West bio Sciences doktorandutbildning partnerskap [utbildning Grant Reference BB/M009122/1]. FD är en Tier II Canada forsknings stol.

1. beredning och solubilisering av membran receptor FhuA
<ol><li>Uttrycka sin6-märkta fhua i Escherichia coli stam AW740. Odla celler för 18 h vid 37 ° c i M9 media (tabell 1). Se Mills et al.16 för ett detaljerat uttrycks protokoll.</li>
	<li>Skörd celler genom centrifugering (5 000 x g, 10 min, 4 ° c) och Omsuspendera dem i 50 ml Tris-salt-glycerol (TSG) buffert (tabell 1). Dounce de återsuspenderade cellerna och tillsätt fenylmetanesulfonylfluorid (PMSF) till en slutlig koncentration av 1 mM strax före Lys. Varning: PMSF är giftig och frätande.</li>
	<li>Lyse cellerna med hjälp av en Microfluidizer (tre passager) vid 15 000 PSI eller en fransk press (tre passager) på 8 000 PSI. Pellets de olyserade cellerna och annat olösligt material genom låg hastighet centrifugering (5 000 x g, 10 min, 4 ° c).</li>
	<li>Ultracentrifuge supernatanten (200 000 x g, 40 min, 4 ° c) för att isolera den råa membran fraktionen. Kassera supernatanten, Omsuspendera membranpelleten i en minimal mängd av TSG-bufferten, och dounce med hjälp av en glas-eller metall douncer-apparat för att säkerställa homogenitet.</li>
	<li>Utför en Bradford analys för att kontrollera protein koncentrationen av den återsuspenderade råa membranet. Späd ut det råa membranet till en slutlig koncentration på 3 mg/mL med TSG-buffert före solubilisering.</li>
	<li>Tillsätt tvättmedel Triton X-100 till en slutlig koncentration av 1% (v/v) för att selektivt lösgöra bakteriens inre membran för 1 h vid 4 ° c med mild Rocking. Pelleten det olösliga materialet (yttre membran fraktion) av ultracentrifugering (200 000 x g, 40 min, 4 ° c).</li>
	<li>Kassera supernatanten som innehåller det solubiliserade membranet och Omsuspendera pelleten i TSG till en slutlig koncentration på 3 mg/mL. Tillsätt lauryldimetylaminoxid (LDAO) till en koncentration av 1% (v/v) till den återsuspenderade yttre membran fraktionen och solubilisera för 1 h vid 4 ° c med mild gunga.</li>
	<li>Utför ett slutligt centrifugeringsteg till pellets allt olösligt material (200 000 x g, 40 min, 4 ° c). Anmärkning: den resulterande supernatanten innehåller solubilized yttre membranproteiner, inklusive målet hans-märkta FhuA.</li>
</ol>2. rening och beredning av FhuA med hjälp av PeptiQuick arbetsflöde
<ol><li>Pre-equilibrate en färdigförpackad ni-NTA kolonn (5 mL hartsvolym) med två kolonnvolymer av immobiliserad metallaffinitetskromatografi (IMAC) tvättbuffert (tabell 1).</li>
	<li>Späd den solubiliserade yttre membranet från 1% LDAO till 0,04% LDAO med TSG. Tillsätt sedan Imidazol till en slutkoncentration på 5 mM. FÖRSIKTIGHET: Imidazol är giftigt och frätande.</li>
	<li>Fyll på de solubiliserade yttre Membranproteinerna på ni-NTA-kådan och samla upp flödet. Ladda flödet genom på hartset för att öka hartsbindningen av fhua och samla sekundära att. Anmärkning: Håll en alikvot på 20 μL av lösnings material som referens för senare analys av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE).</li>
	<li>Tvätta kådan med 250 mL IMAC tvättbuffert och samla in de första 50 mL eluatet. Dränera tvättbufferten till höjden av hartsbädden volym och Stäng Avstängningskranen på kolonnen.</li>
	<li>Tillsätt 1 mL koncentrerad 10 mg/mL bio-Peptidisc peptid lösning (tabell 1) till kolonnen. Tillsätt 50 mL utspädd 1 mg/mL bio-Peptidisc peptid lösning i TSG och rör om kådan med en glasstav för att Omsuspendera pärlorna i TSG.</li>
	<li>Efter peptidisc svällning, låt hartset att bosätta sig och dränera överskottet 1 mg/mL bio-Peptidisc lösning genom kådan.</li>
	<li>Tvätta ni-NTA bifogade peptidisc partiklar med 50 mL TSG. Elera peptidisc-partiklarna med 15 mL IMAC-elueringbuffert (tabell 1) innehållande 600 mm Imidazol i TSG. Samla 1 ml fraktioner och tillsätt omedelbart 10 μl av 0,5 M EDTA till kelat lecherade nickeljoner. FÖRSIKTIGHET: EDTA är irriterande.</li>
</ol>3. utvärdering av PeptiQuick-beredningen
<ol><li>Analys av SDS-Sidan<ol>
<li>Fyll på 10 μL alikvoter av startmaterialet, flowthrough, tvätta (ES) och eluerade fraktioner från PeptiQuick-beredningen till en 12% SDS-denaturerande gel och elektroforese i 30 minuter vid en konstant ström på 60 mA.</li>
		<li>Fläcken gelen med Coomassie blå färg, destain gelen, och visualisera på en skanner.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kromatografi (SEC) för storleks uteslutning<ol>
<li>Baserat på den 12% SDS-PAGE analys av PeptiQuick beredning, isolera och slå samman de relevanta fraktioner, och koncentrera dem med en 30 kDa cut-off centrifugalkoncentrator. Anmärkning: i den medföljande videon samlas fraktioner F3 – F7 ihop och koncentreras under 1 mL (insprutnings slingets volym på SEC-instrumentet).</li>
		<li>Injicera ~ 1 mL av de poolade IMAC-elutionsfraktionerna på en gel filtrerings S200 (300/10) kolonn med en flödeshastighet på 0,25 mL/min i TSG-buffert. Samla 1 mL fraktioner och köra dem på en 12% SDS gel för att avgöra vilka SEC fraktioner att pool och koncentrat. Anmärkning: den eluerade PeptiQuick fraktioner kan poolas utan koncentration, och en alikvot kan injiceras på SEC för att kontrollera kvaliteten på beredningen. Detta är en viktig kontroll för membranproteiner som potentiellt är känsliga för aggregering under centrifugalkoncentrationen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. biolayer interferometri
<ol><li>BLI experimentell installation<ol>
<li>Ställ in 96 väl plattan för hand. Anmärkning: alla brunnar är fyllda till en slutlig volym på 200 μL.</li>
		<li>I kolumn 1, rader A − E, Ladda 200 μl kinetikbuffert för att ge tips för att jämvikt och bilda en baslinje signal.</li>
		<li>Späd ligand (fhua i bio-peptidisc) till en koncentration av 2,5 μg/ml i kinetik buffert (tabell 1). Fyll 200 μL av denna spädning i rad A − D i kolumn 2.</li>
		<li>Tillsätt 200 μl kinetik-buffert endast till E2 (referens sensorn).</li>
		<li>Tillsätt 200 μL kinetikbuffert till kolumn 3, rader A − E för att tvätta överflödigt FhuA från spetsen.</li>
		<li>I kolumn 4 utför tvåfaldiga seriella utspädningar av analyten (ColM) ner plattan från A4 till D4. Börja med 28 nM (8 * KD) i A4 till 3,5 nM (1 * KD) i D4.</li>
		<li>Tillsätt 28 nM ColM till E4 för att mäta för icke-specifik bindning (den högsta ColM-koncentrationen som används).</li>
		<li>Tillsätt 200 μL kinetikbuffert till kolumn 5, rad A − E. Anmärkning: här kommer ColM dissociera från spetsen, och dissociation mäts.</li>
		<li>Placera inställnings plattan i BLI-instrumentet.</li>
		<li>Placera sensor spets facket i BLI-instrumentet.</li>
		<li>Öppna programvaran BLI datainsamling och välj nytt Kinetics-experiment i programguiden.</li>
		<li>Använd fliken plattdefinition för att mata in layouten på 96 väl plattan i programvaran. Anmärkning: brunnar som innehåller ligand, FhuA matas in som "Last". Brunnar som innehåller buffert är endast inmatade som "buffert". Brunnar som innehåller analyten, ColM, matas in som "provet".</li>
		<li>Använd fliken analys definition för att definiera tidslängden och rotationshastigheten för varje steg i experimentet. Anmärkning: de experimentella stegen ställs in som: 1) baslinje: 60 s; 2) lastning: 250 s; 3) original: 300 s; 4) förening: 450 s; och 5) dissociation: 900 s. lämna skakhastigheten som standard (1 000 rpm). Ovanstående steg tilldelas individuellt till varje kolumn i 96 väl plattan genom att välja önskat steg och högerklicka på Lägg assay steg på varje kolumn.</li>
		<li>Tilldela det första steget genom att högerklicka på den första kolumnen och välj Starta ny analys. Se till att baslinje steget är korrekt tilldelat med hjälp av nedre högra fönstret och ändra med rullgardinsmenyn efter behov.</li>
		<li>Tilldela de efterföljande stegen till varje kolumn genom att högerklicka längs plattan och välja Lägg assay steg. Tilldela dessa till lämplig kolumn, som anges i steg 4.1.13.</li>
		<li>Använd fliken sensor tilldelning för att säkerställa att oktettinstrumentet tar BLI-stift från rätt plats i sensor facket. ANMÄRKNINGAR: på fliken sensor tilldelning ska endast a1 − E1 markeras med blått. Se till att det finns en sensor spets på dessa platser i givar facket och se till att F1 − H1 är tomma.</li>
		<li>Markera F1 − H1 på skärmen, högerklicka och välj ta bort för att markera dessa som tomma. Markera Ersätt sensorer i magasin efter användning för att behålla de använda sensorerna.</li>
		<li>I den granska experiment fliken som ger en slutlig översikt över experimentet före körning, gå igenom experimentella steg för att säkerställa att hela installationen är korrekt.</li>
		<li>På fliken kör experiment väljer du en fil plats där du vill spara metodenfilerna.</li>
		<li>Ändra plattans temperatur till rumstemperatur.</li>
		<li>Välj gå att köra experimentet.</li>
	</ol></li>
	<li>BLI dataanalys<ol>
<li>Öppna Octet BLI dataanalysprogram vara.</li>
		<li>Använd fliken dataurval för att hitta experimentet och kontrollera den experimentella sammanfattningen. Importera projektfilen från dess spara plats som definierats under steg 4.1.19.</li>
		<li>Mata in koncentrationerna av analyten (här, ColM) genom att välja sensorinformation för varje experiment.</li>
		<li>Tilldela tipset i E1 som referens tips.</li>
		<li>Använd fliken bearbetning för att subtrahera referens signalen (E1) från experimentella data. Kontrollera rådata från referens tipset för icke-specifik analyt-bindning. Om ingen observeras, Fortsätt. Obs: Detta är en viktig negativ kontroll. Om icke-specifik bindning observeras, kommer detta att redovisas i steg 4.2.7.</li>
		<li>Justera y-axeln till det andra baslinje steget. Markera inte interstep-anslutningen. Välj Savitzky-GOLAY filtrering. Välj process data!.</li>
		<li>På fliken analys väljer du experimentella data i tabellen under observationsområdet för att se associationen och dissociationskurvorna med signalen från referens sensorn subtrafieras.</li>
		<li>Välj bindnings modellen 1:1 och välj en del kurvpassning. Välj Fit kurvor!.</li>
		<li>Analysera restvykomplotten för att kontrollera kurvan passning.</li>
		<li>Bläddra genom tabellen för att se beräknad Kd.</li>
		<li>Välj Spara rapport... om du vill spara ett kalkylbladsdokument med information om inställningarna, diagram över de råa och analyserade data och de beräknade dissociationskonstanterna.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Rawlings, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+always+an+insoluble+problem.">Membrane proteins: always an insoluble problem.</a> Biochemical Society Transactions. 44 (3), 790-795 (2016).</li><li>Popot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphipols,+Nanodiscs,+and+Fluorinated+Surfactants:+Three+Non+Conventional+Approaches+to+Studying+Membrane+Proteins+in+Aqueous+Solutions.">Amphipols, Nanodiscs, and Fluorinated Surfactants: Three Non Conventional Approaches to Studying Membrane Proteins in Aqueous Solutions.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 737-775 (2010).</li><li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Detergent-Free+Isolation+of+Membrane+Proteins+in+their+Local+Lipid+Environment.">A Method for Detergent-Free Isolation of Membrane Proteins in their Local Lipid Environment.</a> Nature Protocols. 11, 1149-1162 (2016).</li><li>Frauenfeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Saposin-Lipoprotein+Nanoparticle+System+for+Membrane+Proteins.">A Saposin-Lipoprotein Nanoparticle System for Membrane Proteins.</a> Nature Methods. 13, 345-351 (2016).</li><li>Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Single+Bacteriorhodopsin+Trimers+in+Bilayer+Nanodiscs.">Assembly of Single Bacteriorhodopsin Trimers in Bilayer Nanodiscs.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 450, 215-222 (2006).</li><li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Self-Assembly+of+Monodisperse+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+with+Controlled+Size.">Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size.</a> Journal of the American Chemical Society. 126, 3477-3487 (2004).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+for+Structural+and+Functional+Studies+of+Membrane+Proteins.">Nanodiscs for Structural and Functional Studies of Membrane Proteins.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 23, 481-486 (2016).</li><li>Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+Facilitate+High-Resolution+Structure+Determination+of+Membrane+Proteins.">Optimized Phospholipid Bilayer Nanodiscs Facilitate High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 1919-1925 (2013).</li><li>Carlson, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Peptidisc,+A+Simple+Method+for+Stabilizing+Membrane+Proteins+in+Detergent-Free+Solution.">The Peptidisc, A Simple Method for Stabilizing Membrane Proteins in Detergent-Free Solution.</a> eLife. 7, 34085 (2018).</li><li>Carlson, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+E.+coli+Membrane+Interactome+Captured+in+Peptidisc+Libraries.">Profiling the E. coli Membrane Interactome Captured in Peptidisc Libraries.</a> eLife. 8, 46615 (2019).</li><li>Serdakowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+residual+detergent+in+biological+samples+post+endotoxin+reduction+treatment+and+evaluation+of+strategies+for+subsequent+detergent+removal.">A novel method to determine residual detergent in biological samples post endotoxin reduction treatment and evaluation of strategies for subsequent detergent removal.</a> International Immunopharmacology. 37, 16-22 (2016).</li><li>Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+Purification+of+Membrane+Proteins.">Strategies for the Purification of Membrane Proteins.</a> Protein Chromatography. 681, 485-496 (2011).</li><li>Lin, S. H., Guidotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Membrane+Proteins.">Purification of Membrane Proteins.</a> Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).</li><li>Wolfe, A. J., Gugel, J. F., Chen, M., Movileanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+Membrane+Protein-Detergent+Interactions+Depend+on+Protein+Electrostatics.">Kinetics of Membrane Protein-Detergent Interactions Depend on Protein Electrostatics.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122 (41), 9471-9481 (2018).</li><li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Phospholipid+Exchange+between+a+Detergent-Solubilized+Membrane+Protein+and+Lipid-Detergent+Mixed+Micelles:+Brominated+Phospholipids+as+Tools+to+Follow+Its+Kinetics.">Slow Phospholipid Exchange between a Detergent-Solubilized Membrane Protein and Lipid-Detergent Mixed Micelles: Brominated Phospholipids as Tools to Follow Its Kinetics.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170481 (2017).</li><li>Mills, A. T., Le H, T., Coulton, J. W., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FhuA+Interactions+in+a+Detergent-Free+Nanodisc+Environment.">FhuA Interactions in a Detergent-Free Nanodisc Environment.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (1), 364-371 (2014).</li><li>Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-Exclusion+Chromatography+for+the+Analysis+of+Protein+Biotherapeutics+and+their+Aggregates.">Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates.</a> Journal of Liquid Chromatography Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).</li><li>Mahler, H. C., Friess, W., Grauschopf, U., Kiese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation:+Pathways,+induction+factors+and+analysis.">Protein aggregation: Pathways, induction factors and analysis.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (9), 2909-2934 (2009).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+proximity-based+labeling+methods+for+interactome+mapping.">Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping.</a> F1000Research. 8, 135 (2019).</li></ol>

FD är grundare av Peptidisc Biotech att distribuera peptidisc peptider till den akademiska världen. Peptidisc Biotech samarbetar också med Industrial Biotech-och Pharma-företag för att implementera peptidisc i sina identifierings arbetsflöden. Open Access publicering av denna artikel sponsrades av FortéBio.

Medan tvätt-och rengöringsmedel förblir den enklaste metoden för att extrahera och rena membranproteiner, kan dessa tensider ha många oönskade effekter på proteiners stabilitet, funktion, och nedströms analyser1,2,3, 4,5,6,7,8,9. Dessa svårigheter har motiverat utvecklingen av membran mimetika, som strävar efter att minimera närvaron av rengöringsmedel och replikera den inhemska membran miljön så mycket som möjligt2,3,4 ,5,6. Majoriteten av berednings metoderna kräver dock en signifikant optimering av beredningsbetingelserna och kräver ofta ytterligare reningssteg, vilket minskar den slutliga avkastningen7,8. Den peptidisc anpassar spontant till målet membranprotein och jämförelsevis, kräver lite optimering och nedströms rening9,10. I detta protokoll, PeptiQuick presenteras som ett enkelt sätt att effektivisera beredning protokollet för nedströms protein-protein interaktionsanalys.
Även om det är enkelt, det finns flera experimentella varningar som kan leda till misslyckad beredning. Bland dessa, den vanligaste beror på protein aggregering. Det är därför viktigt att utföra kromatografi med storleks uteslutning för att övervaka beredningsprocessen. Till exempel är en maximal storleks uteslutning som eluerar vid tomrummet indikativt för protein aggregat (figur 3b)17,18. Membranprotein aggregat bildas vanligen vid långvarig exponering för suboptimala rengöringsmedel före beredning. I synnerhet har det koncentrerats att membranproteiner i rengöringsmedel tenderar att bilda aggregat när de koncentreras av ultrafiltrering på centrifugalenheter. I detta fall kan känsliga membranproteiner koncentreras med hjälp av vakuum Ultra-filtrering, en mjukare och mer homogen metod för koncentration, eftersom adsorption av proteiner till filtret minskar.
I allmänhet, för att undvika proteinkoncentration, den eluerade IMAC fraktioner bör poolas, och en alikvot injiceras på en storlek uteslutning kolumn för att kontrollera dess upplösning kvalitet. Det bör noteras att oinkorporerade fria peptid eluerar strax efter den huvudsakliga peptidisc topp (figur 3b). Den fria ställningen hindrar inte nödvändigtvis nedströms experiment. Men om det behövs, detta överskott kan avlägsnas genom den storlek uteslutningen kromatografi. Alternativt, att öka tvätt volymen under beredningen, och innan eluering från IMAC harts, är tillräckligt för att effektivt ta bort de flesta av de fria peptidisc peptid. Därför rekommenderas kromatografi med storleks uteslutning som ett snabbt och enkelt sätt att kontrollera rekonstitutionskvalitet.
BLI-experimentet kräver noggrann optimering av både ligand-och analytekoncentrationer. Ligand bindning måste vara tillräckligt för att få en tydlig signal, men överbelastning kommer att orsaka signalmättnad, vilket resulterar i data artefakter från överbeläggning och sterisk hinder på spetsen ytan. Därför måste både den koncentration av ligand och hur länge spetsen tillbringar i ligand-lösningen optimeras för varje protein prov (kompletterande figur 2). Analytkoncentrationen måste också optimeras. Om dissociationskonstanten är känd, blir detta steg lättare, eftersom koncentrationsintervallet kan approximeras. En bra utgångspunkt för denna analys är att använda proteinkoncentrationer mellan 0,1-och 20-faldig den förväntade KD19.
Efter BLI datainsamling måste noggrann dataanalys utföras för att undvika feltolkningar. Beräkningen av dissociationskonstanten är beroende av en bindnings kurvans passform. Om inte bindande stökiometri redan är känd, bör en klassisk 1:1 bimolekylär interaktionsmodell användas för den första monteringen. Det bör noteras att en heterogen bindnings kurva ofta är resultatet av artefakter och icke-ideala beteenden orsakade av hög analytkoncentration, som kan misstolkas som en komplex bindnings modell. Därför sänks analytekoncentrationen tills sensorgramprofilen Visar 1:1 bindande stoichiometri kan bidra till att skilja heterogen bindning från mer komplexa interaktioner. Eventuella kvarvarande heterogena bindnings data diskonteras sedan som visas i figur 420.
I denna rapport mäts en dissociationskonstant på 2,28 ± 0,74 nM för interaktionen FhuA-ColM. Detta värde är förenligt med dissociationskonstanten som tidigare bestämts i vår grupp med nanodisc eller peptidisc med hjälp av ITC respektive MST (figur 4E)16. Denna konsistens ger tillförsikt om beredning av peptidisc och BLI-analys som ett sätt att bestämma interaktionskinetik. Viktigt, det bör noteras att proteiner vanligtvis immobiliseras på konjugerat biosensorer antingen genom biotin kemisk tvärbindning eller platsspecifika tillägg med hjälp av E. coli biotin Ligase bira21. Tydligen, biotinylating peptidisc ställningen, i stället för målet membranprotein, har många fördelar. SCAFFOLD biotinylation sparar tid och minimerar risken för att störa viktiga proteinbindnings ställen. Vi har också funnit att PeptiQuick är tillämplig på ett brett spektrum av protein målklasser, inklusive G-proteinkopplade receptorer (GPCRs), jonkanaler, och β-tunnor membranproteiner. I allmänhet bör det noteras att det initiala rengöringsmedlet extraktet av membranproteiner in i ett aggregat-fritt påstår är kritiskt, och det omgående upplösning i peptidisc minskningar nedströms aggregation problem. Med tanke på enkelheten, är det tänkt att peptiquick kommer att utvidgas till andra konjugerat-baserade bindande analyser, såsom yta Plasmon resonans (SPR), Elisa analyser, och affinitet pull-downs med konjugerat pärlor.

Membranproteiner är ofta uteslutna från läkemedels-eller antikropps Discovery forskningsprogram på grund av benägenheten av membranproteiner att aggregera utanför lipidbilayer miljön, särskilt i närvaro av tvättmedel1. Under senare år har därför flera membran mimetika (s.k. ställningar) utvecklats för att underlätta isolering och förhör av membranproteiner i en helt tvättmedels fri miljö (dvs. nanoskivor, SMALPs, amphipols, etc.) 2,3,4,5,6. Emellertid, beredning av membranproteiner i dessa mimetika kräver ofta omfattande optimering, vilket är tidskrävande och i allmänhet åtföljs med förlust av protein återhämtning7,8. För att övervinna dessa begränsningar, vårt laboratorium nyligen utvecklat en "One-size-fits-all" formulering kallas peptidisc9. Den peptidisc bildas när flera kopior av en designer 4,5 kDa amfipatiska bihelical peptid binder till hydrofoba ytan av ett mål membranprotein. Stabil beredning i peptidisc uppstår vid avlägsnande av rengöringsmedel, fångade både endogena lipider och solubilized membranproteiner i vattenlösliga partiklar. Dessa stabiliserade partiklar är nu mottagliga för många nedströms applikationer.
Den peptidisc metoden erbjuder flera fördelar; till exempel är beredning enkel, eftersom bindningen av peptidisc ställningen på målet styrs av proteinet mallen själv9,10. Peptidstoichiometri är också själv bestämd, och tillsats av exogena lipider är inte nödvändigt. Peptidisc bildas genom enkel tvättmedel utspädning, en viktig fördel jämfört med dialys eller adsorption på polystyren pärlor, som ofta resulterar i låg protein avkastning på grund av icke-specifik yta Association och aggregation11,12 ,13. Den slutliga peptidisc församlingen är mycket Termostabil och undantagslöst löslig i olika buffertar eller i närvaro av divalenta katjoner (t. ex., ni2 +). Den renhet och strukturella homogenitet av ställningen är också hög (t. ex., endotoxin-fri), och peptiden kan anpassas med funktionella grupper placeras på olika positioner.
Vi presenterar här ett laboratorium arbetsflöde som kallas PeptiQuick, även känd som på-pärlor beredning9. Detta protokoll kombinerar membran Proteinrening och peptidisc-beredning till ett enda steg och på samma kromatografiska stöd. Som namnet antyder, PeptiQuick är snabb jämfört med andra beredningsmetoder, och det också allvarligt minskar exponeringstiden till tvättmedel. Negativa rengöringsmedel effekter som proteinveckning och aggregering förekommer ofta på ett tidsberoende sätt; Därför är det viktigt att minimera exponeringen av rengöringsmedel för att bibehålla den inhemska protein konformation14,15. Detta är avgörande för riktigheten av metoder som rapporterar om proteininteraktioner och ligand bindande tillhörighet.
Samtidigt utveckla detta protokoll, presenterar vi romanen en version av peptidisc scaffold, kallas bio-peptidisc. De biotin funktionella grupperna tillåter fastsättning av mål membranproteinet på streptavidin-belagda ytor. Eftersom biotin märkning är begränsad till ställningen, bindningsställen på mål membranproteinet förblir oförändrad. Med hjälp av bio-Peptidisc bestäms bindningskinetiken hos bakterie membran receptorn FhuA och antimikrobiell peptid colicin M (ColM)16. Denna affinitet mäts via biolayer interferometri (BLI), som analyserar interaktioner i realtid baserat på vitt ljus störnings mönster reflekteras från en sensor spets.
Genom att använda detta protokoll elimineras behovet av tvättmedel under BLI-analys, vilket är en viktig utveckling, eftersom tvätt-och rengöringsmedel kan störa interaktioner. Bindande tillhörighet kan mätas snabbt med denna metod, och resultaten är jämförbara med de som rapporterades tidigare med hjälp av nanoskivor och isotermisk titrering calorimetri (ITC)16. De kritiska stegen i PeptiQuick arbetsflöde visas och diskuteras, såsom protein beredning, tvättmedel utspädning, peptid addition, och beredning, tillsammans med tips för att felsöka ligand och analyt bindning i BLI-analysen. Med hjälp av PeptiQuick arbetsflöde, det visar sig att membranproteiner kan fångas i peptidiscs och deras interaktioner mäts inom en dag.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 kDa cut-off centrifugal concentrator</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7715</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td>Sodium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Peptidisc Peptide</td>
			<td>Peptidisc Biotech</td>
			<td>https://peptidisc.com</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Biotechnology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ettan LC (AKTA)</td>
			<td>Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td>18-1145-58</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>Anhydrous, Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>Biotechnology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryldimethylamine oxide (LDAO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>101822204</td>
			<td>~30% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidizer</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>M-110L</td>
			<td>Fit with F20Y 75&#181; diruption chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Resin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>H-320-50</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-binding 96well BLI Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655076</td>
			<td>Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red96</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>OCTET RED96E-GxP</td>
			<td>Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7626</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Dye - Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Used in the bradford assay to determine protein concentration - 5x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>Biotechnology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin (SA) Biosensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5019</td>
			<td>One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex S200 (300/10)</td>
			<td>Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td>175175-01</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>69271</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>900998-1</td>
			<td>Biotechnology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td>Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>365668</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

peptiquick, a one-step incorporation of membrane proteins into biotinylated peptidiscs for streamlined protein binding assays

Membranproteiner, inklusive transportörer, kanaler, och receptorer, utgör nästan en fjärdedel av den cellulära proteomen och över hälften av nuvarande drog mål. Men ett stort hinder för deras karakterisering och exploatering i akademiska eller industriella miljöer är att de flesta biokemiska, biofysiska och Drug screening strategier kräver dessa proteiner att vara i ett vattenlösligt tillstånd. Vårt laboratorium utvecklade nyligen peptidisc, ett membran mimetisk erbjuda en "One-size-fits-all" strategi för problemet med membranprotein löslighet. Vi presenterar här en strömlinjeformad protokoll som kombinerar Proteinrening och peptidisc beredning i ett enda kromatografiskt steg. Detta arbetsflöde, kallas PeptiQuick, möjliggör förbigående dialys och inkubering med polystyren pärlor, därmed kraftigt minska exponeringen för tvättmedel, protein denaturering, och prov förlust. När PeptiQuick utförs med biotinylerade ställningar kan preparatet fästas direkt på streptavidin-belagda ytor. Det finns ingen anledning att biotinylate eller ändra membranet protein mål. PeptiQuick är utställningsmonter här med membran receptor FhuA och antimikrobiella ligand colicin M, med hjälp av biolayer interferometri att bestämma exakt kinetik av deras interaktion. Det är slutsatsen att PeptiQuick är ett bekvämt sätt att förbereda och analysera membranprotein-ligand interaktioner inom en dag i en tvättmedels fri miljö.

Membran receptor FhuA uttrycks i ett laboratorium E. coli stam. Den yttre membran fraktionen skördas genom centrifugering, och proteiner solubiliseras med hjälp av en två-stegs rengöringsmedel extraktion. De solubilized membranproteiner lastas på ni-NTA aguppade pärlor förpackade i en plast kolonn, följt av PeptiQuick arbetsflöde som presenteras i protokollet. Efter en kvalitetskontroll med kromatografi med storleks uteslutning immobiliseras bio-Peptidisc-partiklarna på streptavidin-belagda stift. BLI-analysen utförs för att mäta kinetik av samspelet mellan FhuA och ColM. Den schematiska översikten av detta experiment presenteras i figur 1.
En SDS gel körs för att bestämma kvaliteten på beredning efter eluering av FhuA bio-Peptidisc partiklar från IMAC-kolumnen (figur 2). Alikvoter av fraktioner som motsvarar Start, flowthrough, tvättar, och eluering fraktioner lastas på SDS-gel för att utvärdera framgången för PeptiQuick metoden. Utarmningen av FhuA i flödet genom fraktionen är korrelerad med en berikning i elutionsfraktionerna, vilket indikerar att rening av proteinet har varit effektivt. Mindre främmande protein band observeras i eluerade fraktioner. SDS gel-analysen används för att bestämma vilka fraktioner som ska poolas före SEC-analysen. En infödd gel av den eluerade FhuA bio-Peptidisc partiklar körs också för att bekräfta FhuA löslighet (kompletterande figur 1). Migration av det rekonstituerade proteinet till den infödda gelen indikerar proteinlöslighet i en tvättmedels fri miljö.
SEC-analysen utförs för att bedöma lösligheten hos peptidisc-partiklarna. Kromatogrammet som presenteras i figur 3a visar en enda symmetrisk topp som eluerar vid ca 14 ml (6 ml förbi tomrummet på 8,0 ml på gel filtreringen S200 10/300). Positionen för denna topp, förbi void volym, bekräftar lösligheten av FhuA bio-Peptidisc partiklar. Som referens illustrerar figur 3b en teoretisk suboptimala peptidisc-beredning. I detta fall, kromatogrammet visar en större protein topp eluera vid tomrummet, vilket indikerar närvaron av protein aggregat. Den mindre topp elminerande bara förbi de viktigaste peptidisc topp motsvarar överskott peptidisc peptider.
Samspelet mellan fhua med analyten ColM bestäms efter fastsättning av peptidiscs till konjugerat belagda sensorer. Sensorn tips är först skakad i kinetik buffert, sedan överföras till buffert som innehåller fhua bio-peptidiscs. Koncentrationen av FhuA bio-Peptidiscs och den tid som de inkuberas med spetsen optimeras före detta experiment (kompletterande figur 1). Efter lastning och tvättning steg, föreningen steg mäter samspelet mellan laddade tips och fyra olika koncentrationer av colicin M. Den efterföljande förflyttningen av spetsarna tillbaka till bufferten resulterar i dissociation, vilket mäts genom våg längds förskjutningen av vitt ljus som reflekteras från spetsen.
Figur 4a visar utdata från det här experimentet av rådata sensorgram. Alla spår visas enhetliga i lastnings-och baslinje stegen, bortsett från referens spårningen i gult. Referens spetsen har ingen ligand laddad men utsätts för analyt till analys för icke-specifik bindning, vilket är en viktig negativ kontroll. För mer detaljerad analys av resultaten, signalen från referens spetsen subtrageras från spåren för experimentella tips för att redogöra för icke-specifik bindning. Data justeras till början av Associations steget för att möjliggöra en direkt visuell jämförelse, som visas i figur 4b. Denna jämförelse visar en ökning av våglängd förskjutning för att öka koncentrationerna av colicin M. Kurvan är lämplig för data och uppvisar en klassisk 1:1 bindande modell.
Den kvarvarande vyn tomt (figur 4b, botten), som beskriver skillnaderna mellan montering och experimentella data, visar att monteringen för den högsta koncentrationen av ColM (28 nm) är dålig jämfört med de tre lägre koncentrationerna. Profilen för kurvan i sig saknar bindnings kurvan platå, som är karakteristisk för bindning platsmättnad i ett typiskt bindande experiment. Avsaknaden av platå antyder heterogena bindning, vilket sannolikt är en artefakt av den höga ColM koncentrationen. Denna högsta ColM-koncentration diskonteras därför från analysen och de övriga tre koncentrationerna används för att bestämma dissociationskonstanten (figur 4C, D). En tvåsidiga Students t-test, på en 95% konfidensnivå, fann att den observerade dissociationskonstanten från detta experiment inte signifikant skiljer sig från de värden som erhålls med hjälp av olika tekniker (figur 4e)16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60661/60661fig01.jpg"> Figur 1: översikt för PeptiQuick arbetsflöde med hjälp av bio-Peptidiscs och bli-analys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661fig01large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60661/60661fig2a.jpg"> Figur 2: analys av SDS gel (12%) av Start, flowthrough, tvätta och eluering fraktioner samlas in genom PeptiQuick arbetsflöde. Cirka 10 μl prov lastades i varje körfält och kördes i 30 minuter vid en konstant ström på 60 mA. Gelen färgas med Coomassie blå, Avfärgade, och visualiseras på en gel scanner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661fig2alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60661/60661fig3a.jpg"> Figur 3: experimentella och teoretiska SEC-profiler som representerar optimala respektive suboptimala rekonstitutioner. A) experimentell SEC-profil för PeptiQuick rekonstituerad fhua (~ 82 kDa) i bio-Peptidiscs. IMAC elueringfraktioner F3 − F7 poolades och koncentrerades med en 30 kDa-cut-off centrifugalkoncentrator till ~ 1 mL. Detta koncentrerade prov injicerades vid 0,25 mL/min på en gelfiltrering S200 (10/300) kolumn i TSG buffert. B) teoretisk SEC-profil för en suboptimala peptiquick-beredning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661fig3alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60661/60661fig4b.jpg"> Figur 4: undersöka ColM interaktioner med FhuA upplöst i bio-Peptidiscs. A) rådata sensorgram med referens sensorspår i gult. (B, C) Överst: Association och dissociation steg med partiell 1:1 bindning kurva montering. Bottom: restvyer som skildrar skillnaden mellan experimentella data och beräknings anpassning. Creplotting avBmed undantag av den högsta koncentrationen av ColM. D) observerade Associations-och dissociationshastigheter (kpå respektive kav) och dissociationskonstanter (kd). (E) jämförelse mellan fhua-ColM dissociationskonstanter erhållna genom peptidisc och bli (i detta experiment), peptidisc och mikroanalys thermophoresis (Saville, opublicerade data), och nanodisc och isotermisk titrering calorimetri16. Felstaplar representerar ett SD av osäkerhet, medan ns betecknar ingen signifikant skillnad på konfidensnivå på 95%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661fig4alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>M9 media (per liter)</td>
		</tr>
<tr>
<td>200 mL M9 salt</td>
		</tr>
<tr>
<td>800 mL dH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mL 40% glukos</td>
		</tr>
<tr>
<td>80 μL 1 M CaCl2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,5 mL 1 M MgSO4
</td>
		</tr>
<tr>
<td>300 μL 15 mg/mL tiamin</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>TSG buffert</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% glycerol</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IMAC tvättbuffert</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% glycerol</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,04% LDAO</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM Imidazol</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Bio-Peptidisc lösning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lös upp den färdiga Biopeptiskivan (> 95% renhet) i steril dH2O. Koncentrationen och volymen av peptidlösningen beror på steget i beredningsprocessen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Anmärkning: denna bio-Peptidisc peptid lager är stabil vid 4 ° c i över en månad.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IMAC-Elueringbuffert</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% glycerol</td>
		</tr>
<tr>
<td>600 mM Imidazol</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Kinetics buffert</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,002% Tween-20</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1% BSA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: recept för beredning av media och lösningar.
Kompletterande figur 1:4% – 16% tydlig inhemsk gel analys av elutionsfraktionerna som samlats in från PeptiQuick-arbetsflödet. Cirka 10 μL prov lastades i varje körfält och kördes för 40 min vid en konstant ström på 30 mA. Gelen färgas med Coomassie blå, Avfärgade, och visualiseras på en skanner. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661suppfig1alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.</a>
Kompletterande figur 2: ligand koncentration optimering med en enda stift. A) de sex olika koncentrationerna av fhua i bio-peptidisc som testats för bindning till en enda konjugerat-belagd nål. Detta inrättades i en 96 brunn tallrik med buffert i brunnar mellan ligand koncentrationer (se kompletterande fil 1 för setup Protocol). (B) rådata sensorgram för ligand optimerings experiment. Stiftet ger störst respons och uppnår dessutom mättnad vid koncentrations nummer 4 (eller 2,5 μg/mL). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661suppfig2alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.</a>
Kompletterande fil 1. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60661/supplementalfile1.docx" target="_blank">Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).</a>

Watch this Scientific Journal Video about PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays at JoVE.com

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

Vi presenterar en metod som kombinerar membran Proteinrening och beredning till peptidiscs i ett enda kromatografiskt steg. Biotinylerade ställningar används för direkt ytmontering och mätning av proteinligand interaktioner via biolayer interferometri.

PeptiQuick, en enstegs inkorporering av membranproteiner i biotinylerade Peptidiscs för strömlinjeformade Proteinbindnings analyser

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Den klassiska metoden där membranproteiner extraheras för sin studie är genom enkel solubilisering i tvättmedel. Även om detta ger en enkel och universell metod, har rengöringsmedel visat sig förändra den inhemska strukturen, funktionen och aktiviteten hos dessa känsliga proteiner. Här presenterar vi Peptidisc som en lösning för att stabilisera membranproteiner i tvättmedelsfri lösning.Peptidisc-systemet anpassar sig spontant till storlek, form och typologi hos myriader av membranproteiner. Detta står i kontrast till andra membran mimetik som ofta kräver tråkiga optimering. FhuA, ett E.coli yttre membran protein, kommer att användas som en modell målprotein som skall rekonstituerade i detta protokoll.Yttre membran vesiklar kommer att isoleras följt av tillsats av tvättmedel för att solubilisera membranproteinerna. Peptidisc-peptiden tillsätts till solubiliseringen och tvättmedlet späds bort, spontant bildar Peptidisc partiklar. Dessa stabiliserade lösliga partiklar är nu mottagliga för många nedströms applikationer.Detta protokoll kommer att undersöka bio-lager interferometri som en tillämpning av Peptidisc-tekniken. Detta protokoll kommer att fokusera på PeptiQuick reconstitution metod, en användbar teknik som underlättar samtidig rening och rekonstitution av membranproteiner. PeptiQuick metoden för on-beads reconstitution utförs i en standard Nickel-NTA IMAC gravitation kolumn förjämnas i tvättmedel.Det solubiliserade membranet lastas på hartset och icke-målproteiner tvättas bort. Efter denna peptid tillsätts i kolonnen och tvättmedlet späds snabbt. Den hydrofoba sidan av peptidisc peptiden associerar med de exponerade hydrofoba regionerna.Den hydrofila sidan av peptiden håller proteinet lösligt i lösning. Överskott peptid tvättas bort. Imidazol läggs till för att framkalla den rekonstituerade raseri.Peptidisc-ställningen kan vara funktionaliserad till indirekt etikettsminnesproteiner och därmed öppna dörren till en bredare uppsättning nedströmsanalyser. Här utnyttjar vi den biotinylerade peptiden för fastsättning till streptavidinbelagda sensorer för BLI-analys. Interferometri i bioskikt är en kraftfull etikettfri teknik för att undersöka biomolekylära interaktioner i lösning.Förutom att helt enkelt demonstrera interaktioner, ger denna teknik en realtids kinetisk avläsning och möjliggör beräkning av en bindande dissociation konstant. Genom detta protokoll eliminerar vi behovet av tvättmedel under BLI-analysen, eftersom detta kan förändra aktiviteten. Biolayerinterferometri analyserar störningar som passerar vitt ljus som reflekteras från sensorn, eller spetsen, och bundna makromolekyler under en interaktion.För att mäta interaktionerna skickas känslatipset mellan lösningar och signalen som registreras vid varje steg. Varje spets ger sedan sina egna spår på ett sensogram. Först upprättas en baslinje av endast buffert.För det andra är liganden bunden. I detta fall, FhuA och biotinylerade Peptidiscs binder en streptavidin encoated spets. Därefter tvättas spetsen i buffert för att ta bort eventuell obunden FhuA.Nu är spetsen flyttas till en lösning med en känd koncentration av analyte, här ColM. Om en interaktion inträffar kommer detta att ge en bindningskurva. Slutligen flyttas spetsen till buffert och dissociationen mäts.De observerade satserna för association och dissociation vid varje kolumnkoncentration kan användas för att beräkna dissociationskonstanten. Hexahistidine taggade FhuA uttrycks i E-coli stam AW740 i 18 timmar i amin media. Bakterierna skördas genom centrifugering vid 5, 000 G:s 10 minuter vid fyra grader Celsius.Den resulterande cell pelleten är åter upphängd i TSG buffert och sedan dounced att bryta upp cellulära klumpar och säkerställa grundlig lys. TMSF läggs till de åter uppskjutna cellerna till en slutlig koncentration av en millimolar strax före lys. Cell lys uppnås genom tre passager genom antingen en mikrofluidizer på 15, 000 PSI eller en fransk press på 8, 000 PSI.De lysade cellerna samlas och en låghastighetscentrifugering vid 5, 000 G:s i 10 minuter vid fyra grader utförs. En supernatant från den långsamma snurran laddas i en TI70 ultracentrifug rotor och centrifugeras vid 200, 000 G:s i 40 minuter vid fyra grader för att pelleta den råa E.coli-membranet. Efter ultracentrifugeringen kasseras supernatanten och råmembranpelleten suspenderas på nytt i en minimal mängd TSG-buffert.En rå membran är dounced att säkerställa dess homogenitet. En Bradford Assay utförs för att kontrollera proteinkoncentrationen av det åter uppskjutna råmembranet. TSG buffert används för att späda råmembranet till cirka tre milligram per milliliter före solubilisering.Triton X-100 läggs till det åter uppskjutna råmembranet vid en slutkoncentration på 1%för att selektivt solubilisera det bakteriella innermembranet. Solubilisering utförs i en timme vid fyra grader, med mild gungning. Det olubiliserade yttre membranet isoleras genom ultracentrifugering vid 200, 000 G i 40 minuter, vid fyra grader.Den resulterande supernatanten som innehåller det solubiliserade innermembranet kasseras. Medan pelleten, som innehåller det yttre membranet, åter upphängd som tidigare i TSG. LDAO läggs till en slutlig koncentration på 1%till den åter upphängda yttre membranet, och solubilized för en timme vid fyra grader.Slutligen utförs en ultracentrifugering, som tidigare, till pellet olösligt material. Den resulterande supernatanten innehåller solubiliserat yttre membran, inklusive vårt mål, hans-taggade FhuA, nu redo för samtidig IMAC-rening och Peptidisc reconstitution. En Nickel-NTA IMAC gravitationskolumn är förjämförd med två kolonnvolymer av IMAC-tvättbuffert.Imidazol tillsätts vid en slutkoncentration på fem millimolar till det solubiliserade yttre membranet, utspätt till 0,04%LDAO. Det solubiliserade yttre membranet lastas på Nickel-NTA-kådan, och flödet genom samlas. Detta flöde genom laddas om på hartset för att öka hartsbindningen av FhuA.Efter lastningen tvättas hartset med 250 milliliter IMAC-tvättbuffert och de första 50 milliliter som samlats. Efter tvättning dräneras tvättbufferten till strax över hartsbäddens höjd och kolonnstoppet stängd. En milliliter koncentrerad, 10 milligram per milliliter, Peptidisc peptid läggs till kolumnen.Efter tillsats av koncentrerad peptid, 50 milliliter av utspädning, ett milligram per milliliter, Peptidisc peptid i TSG tillsätts. Hartsen rörs om för att åter upphäva pärlorna i TSG, under CMC av LDAO, vilket bildar Peptidisc partiklar. Efter Peptidisc fångst, hartset får bosätta sig och en milligram per milliliter peptid lösning dräneras genom harts.Hartset tvättas med 50 milliliter TSG för att avlägsna överflödig Peptidisc peptid. Slutligen späds peptidiscpartiklarna ut med 50 milliliter på 600 millimolar imidazol i TSG. En milliliter fraktioner samlas och 10 mikroliter av 0,5 molar EDTA tillsätts, en nyckel ljus urlakas nickel joner.Början, flöde genom, tvätta, och eluded fraktioner lastas på en 12% SDS gel och elektroforezed i 30 minuter vid 60 millias, . Gelen färgas och visualiseras på en gelscanner. Den resulterande gel visar utarmning av FhuA i flödet genom, och anrikning i elueringen.Mindre föroreningar band observeras också i den elerade fraktioner. Fraktioner tre till sju är utvalda för storlek uteslutning kromatografi för att bekräfta FhuA Peptidisc löslighet och bryter föroreningar. En 30 Kilodome avskuren centrifugalkoncentrator används för att koncentrera fraktioner tre till sju.En milliliter av de sammanspända IMAC elusionfraktionerna injiceras på S200-kolumnen med en flödeshastighet på 0,25 milliliter per minut i TSG-buffert. En milliliter fraktioner samlas och en 12% SDS gel av fraktionerna körs. De relevanta fraktionerna är sammanförda och får nu användas i applikationer i senare led.BLI genomfördes i en ForteBio Octet RED96. Detta instrument flyttar BLI stift över en 96 väl platta som först inrättas för hand. Alla brunnar är fyllda till en slutlig volym av 200 mikroliter.Kolumn ett är laddad med kinetikbuffert för att spetsarna ska kunna ekvilka och bilda en baslinjesignal. Kolumn två är laddad med en förutbestämd koncentration av ligand- och kinetikbufferten. I detta fall är FhuA liganden, och läggs till koncentrationen av 2,5 mikrogram per milliliter.Spetsen i rad E kommer att användas som referens, och laddas med endast buffert. Kolumn tre är laddad med kinetik buffert för att tvätta överskott FhuA från spetsen. Tvåfaldig följetong utspädningar av analyten, i detta fall ColM, laddas uppifrån och ned i kolumn fyra.Den högsta av dessa koncentrationer används för referensraden, för att mäta för icke-specifik bindning av analyten till spetsen. Kolumn fem är laddad med buffert. Här kommer ColM separera, och dissociationen mäts.När plattan är förberedd, laddas sensor-tip facket och förberedda plattan i BLI instrumentet. DEN BLI datainsamling programvara öppnas och ett nytt kinetiskt experiment startas. Fliken Plattdefinition används för att mata in layouten på 96-brunnsplattan i programvaran.Här är liganden FhuA matas in som ladda stunder som analyteen ColM matas in som ta prov. Fliken Assay Definition används för att definiera tidslängden och plattans rotationshastighet för varje steg i experimentet. Här inkluderar vi ett baslinjesteg på 60 sekunder, följt av ett laddningssteg på 250 sekunder, ett andra baslinjesteg på 300 sekunder, ett analytassocieringssteg på 450 sekunder och slutligen ett dissociationssteg på 900 sekunder.Dessa steg tilldelas individuellt varje kolumn i 96-brunnsplattan genom att välja önskat steg och högerklicka på Lägg till analys på varje kolumn. Fliken för sensortilldelning används för att säkerställa att Octet-instrumentet tar BLI-stift från deras rätta plats i sensorfacket. Fliken Granska experiment ger en slutlig översikt över experimentet, innan du utför.BLI kommer nu att utföras av Octet RED. Detta kommer att producera en rådata sensogram för analys. Analysen utförs genom att först öppna programvaran för Octet-biodataanalys.Fliken Dataval används för att leta upp experimentet och kontrollera den experimentella sammanfattningen. Koncentrationerna av den analyte ColM är indata här. Därefter används fliken Bearbetning för att subtrahera referenssignalen från experimentella data.Baslinjen definieras för att justera Y-axeln som om dess avlegeringshastighet tillämpades. Slutligen är ProcessData markerat. Data är isolerade för det här experimentet och Anpassa kurvor är markerad.En partiell association och dissociation kurvan montering väljs. Kd beräknas från denna montering. Storleken uteslutningskromatogram används för att validera ambuteens rekonstitution.Kromatogrammet visar en enda symmetrisk topp, vilket tyder på en monodispers protein beredning. Toppen elar flera milliliter efter tomrumsvolymen, vilket indikerar icke-aggregerade lösliga Peptidisc-partiklar. Protein aggregat kommer att elute vid tomrummet volym, medan överskott tvättmedel och peptid kommer att elute efter huvudtoppen.Ökad tvättning av den bildade Peptidiscs medan fortfarande fäst vid Nickel-NTA pärlor bör tömma denna senare topp. Protein aggregat är ofta ett resultat av att exponera minnesproteiner för tvättmedel fri lösning före rekonstitution. Denna sista uteslutning kromatogram är en användbar diagnostisk för felsökning ens reconstitution.Efter bearbetning av de experimentella data, är en kurva passar till sensogrammet. Noggrannheten i denna montering är väsentlig för beräkningen av dissociationskonstanten. Restvyns plot beskriver skillnaden mellan de experimentella data och den beräkningsmässiga tillpassningen.Detta visar att för de fyra olika kolumnkoncentrationerna tre av kurvorna passar bra. Men för den högsta koncentrationen kurvan inte ger en bra passform. Detta tyder på att vid denna högre koncentration, det finns heterogen bindning av kolumn till stiftet.Denna högsta koncentrationssignal ingår därför inte från den kinetiska analysen enligt ForteBio-applikationsanteckningarna. De återstående tre kurvorna används för den kinetiska analysen. En dissociationskonstant mellan FhuA och ColM, bestämd med HJÄLP AV BLI- och Peptidisc-metoden, överensstämmer med konstanter som bestäms av andra metoder.Isotermisk kalorimetri och nanodiscer, och mikroskala thermoforesis och Peptidisc gav dissociation konstanter inte signifikant skiljer sig från vårt bestämda värde. Denna konsistens validerar Peptidisc BLI-metoden för mätning av interaktionskinetik. Okej, så, efter att ha sett den här videon, hoppas vi att du har fått en praktisk förståelse för styrkan och förbehållet av PeptiQuick-metoderna.Vi har funnit denna metod särskilt användbar för att kvantifiera FhuA ColM interaktion i fullständig avsaknad av tvättmedel. Och vi misstänker att samma arbetsflöde kan tillämpas för att karakterisera alla andra receptor-ligand interaktion. Lycka till med dina experiment.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rening av biotinylerade cellytaproteiner från<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epitelceller

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylerade Cell-penetrerande peptider att studera intracellulära Protein-protein interaktioner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Tvättmedel-fri ultrasnabb beredning av membranproteiner i Lipid lipidmonolager använder Fusogenic kompletterande laddade Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: enstegs affinitet rening för parallell analys av Protein-Protein och Protein-metaboliten komplex

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering av Lipoproteinpartiklar från kyckling äggula för studiet av bakteriell patogen fettsyra inkorporering i Membranfosfolipider

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Rengörings medel-assisterad beredning av rekombinant Drosophila Atlastin i liposomer för lipid-blandning assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Mätning av nukleotidbindning till intakta, funktionella membranproteiner i realtid

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...