Name: production of high-titer infectious influenza pseudotyped particles with envelope glycoproteins from highly pathogenic h5n1 and avian h7n9 viruses
Uploaded: 2020-01-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Stipendien von Zhejiang Provincial Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science and Technologieschlüsselprojekt (Grant Numbers, 2014Z11) und Kommunales autonomes Anwendungsprojekt hangzhou für soziale Entwicklung und wissenschaftliche Forschung (Grant Numbers, 20191203B134).

1. Tag 1: Zellkultur und Seeding
<ol><li>Kultivieren Sie menschliche embryonale Nieren (HEK) 293T/17 Zellen in 60 mm Schalen mit Dulbeccos modifiziertem essentiellen Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (DMEM Complete Medium, DCM) in einem 37 °C, 5% Kohlendioxid (CO2) Inkubator bis ca. 80% Confluent. HINWEIS: HEK 293T/17 Arme-Durchgangszellen werden empfohlen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen sorgfältig mit 5 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS) 1...

<ol>
	<li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology (6th). , (2013).</li><li>White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+mechanisms+of+viral+membrane+fusion+proteins:+multiple+variations+on+a+common+theme.">Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).</li><li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-clade+protective+immune+responses+to+influenza+viruses+with+H5N1+HA+and+NA+elicited+by+an+influenza+virus-like+particle.">Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle.</a> PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+pseudotyped+influenza+viral+particles+in+neutralizing+antibody+detection.">Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection.</a> PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).</li><li>Wyatt, R., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+envelope+glycoproteins:+fusogens,+antigens,+and+immunogens.">The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens.</a> Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).</li><li>Joe, A. 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L., Hewlett, N., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotype+formation+between+enveloped+RNA+and+DNA+viruses.">Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses.</a> Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).</li><li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Control+of+Cellular+Susceptibility+to+Pseudotypes+of+Rous+Sarcoma+Virus.">Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus.</a> Virology. 26, 270-276 (1965).</li><li>Steffen, I., Simmons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotyping+Viral+Vectors+With+Emerging+Virus+Envelope+Proteins.">Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins.</a> Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).</li><li>Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+hepatitis+C+virus+pseudo-particles+containing+functional+E1-E2+envelope+protein+complexes.">Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.</a> Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).</li><li>Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCV+envelope+protein+function+is+dependent+on+the+peptides+preceding+the+glycoproteins.">HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).</li><li>Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+potentially+important+elements+of+the+hepatitis+B+virus+large+envelope+protein+are+dispensable+for+the+infectivity+of+hepatitis+delta+virus.">Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus.</a> Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).</li><li>Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSV-G-pseudotyped+retroviral+packaging+through+adenovirus-mediated+inducible+gene+expression.">VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).</li><li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors:+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells.">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pseudoparticles+paired+with+hemagglutinin+and+neuraminidase+from+highly+pathogenic+H5N1+influenza+and+avian+influenza+A+(H7N9)+viruses.">Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses.</a> Virus Research. 253, 20-27 (2018).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+Pseudotyped+Particles+Pairing+Hemagglutinin+of+Highly+Pathogenic+Avian+Influenza+a+H5N1+Virus+with+Neuraminidases+of+The+2009+Pandemic+H1N1+and+a+Seasonal+H3N2.">Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2.</a> Journal of Bioterrorism &amp; Biodefense. 2, 104 (2011).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neuraminidases+from+the+highly+pathogenic+avian+H5N1+and+2009+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses.">Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).</li><li>Nefkens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+pseudotyped+lentiviral+particles:+characterization+of+a+new+method+for+avian+H5N1+influenza+sero-diagnosis.">Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis.</a> Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+and+neuraminidase+matching+patterns+of+two+influenza+A+virus+strains+related+to+the+1918+and+2009+global+pandemics.">Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oseltamivir+boosts+2009+H1N1+virus+infectivity+in+vitro.">Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).</li><li>McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+M2+envelope+protein+augments+avian+influenza+hemagglutinin+pseudotyping+of+lentiviral+vectors.">Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).</li><li>Pan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+mediates+avian+influenza+H5N1+pseudotyped+particle-induced+lung+inflammation+through+NF-kappaB+and+p38+MAPK+signaling+pathways.">Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).</li><li>Szecsi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neutralising+antibodies+by+virus-like+particles+harbouring+surface+proteins+from+highly+pathogenic+H5N1+and+H7N1+influenza+viruses.">Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses.</a> Virology Journal. 3, 70 (2006).</li><li>Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+evaluation+of+an+influenza+A+(H5)+pseudotyped+lentiviral+particle-based+serological+assay.">Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay.</a> Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).</li><li>Garcia, J. M., Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+influenza+pseudotyped+lentiviral+particles+and+their+use+in+influenza+research+and+diagnosis:+an+update.">Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).</li><li>Haynes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza-pseudotyped+Gag+virus-like+particle+vaccines+provide+broad+protection+against+highly+pathogenic+avian+influenza+challenge.">Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge.</a> Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).</li><li>Schmeisser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+mammalian+virus-like+particles+from+modified+vaccinia+virus+Ankara+vectors+expressing+influenza+H5N1+hemagglutinin+and+neuraminidase.">Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase.</a> Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+(SARS-CoV)+S+glycoprotein+and+influenza+matrix+1+efficiently+form+virus-like+particles+(VLPs)+that+protect+mice+against+challenge+with+SARS-CoV.">Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV.</a> Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).</li><li>Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Lyssavirus-Neutralizing+Antibodies+Using+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotype+Particles.">Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles.</a> Viruses. 8 (9), 254 (2016).</li><li>Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV+Fusion+Peptide+Forms+an+Extended+Bipartite+Fusion+Platform+that+Perturbs+Membrane+Order+in+a+Calcium-Dependent+Manner.">The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).</li><li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus+infection+is+inhibited+by+griffithsin.">Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin.</a> Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).</li><li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Pseudotyped+Particles+to+Study+Highly+Pathogenic+Coronaviruses+in+a+Biosafety+Level+2+Setting.">Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+leukemia+virus+pseudotypes+of+La+Crosse+and+Hantaan+Bunyaviruses:+a+system+for+analysis+of+cell+tropism.">Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism.</a> Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).</li><li>Wool-Lewis, R. J., Bates, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebola+virus+entry+by+using+pseudotyped+viruses:+identification+of+receptor-deficient+cell+lines.">Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines.</a> Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).</li><li>Chen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+design+of+more+effective+avian+replication-incompetent+retroviral+vectors.">Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors.</a> Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).</li><li>Kaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+generation+of+pseudotype-based+serum+neutralization+assay+for+Nipah+virus+antibodies:+sensitive+and+high-throughput+analysis+utilizing+secreted+alkaline+phosphatase.">Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase.</a> Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).</li><li>Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+modeling+of+influenza+A+virus+replication+in+cell+cultures+predicts+infection+dynamics+for+highly+different+infection+conditions.">Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions.</a> PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).</li><li>Petiot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+viruses+production:+Evaluation+of+a+novel+avian+cell+line+DuckCelt(R)-T17.">Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17.</a> Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).</li></ol>

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von Pseudotyppartikeln (pp) des Influenzavirus in einer BSL-2-Einstellung. Das Reporter-Plasmid pcDNA-GFP ist in die pps integriert und kann verwendet werden, um pps von FACS in einem Infektiositätstest zu quantifizieren. Wir haben uns für zwei Arten von anfälligen Zelllinien entschieden, weil sie in der Grippeforschung weit verbreitet sind. MDCK-Zellen würden eine gute Kontrolle für die variablen verewigten menschlichen Zellen bieten, die in diesen St...

Die Mission eines viralen Teilchens besteht darin, sein Genom von einer infizierten Wirtszelle in eine nicht infizierte Wirtszelle zu transportieren und in einer replikationskompetenten Form1in das Zytoplasma oder den Zellkern zu liefern. Dieser Prozess wird zunächst durch Bindung an Wirtzellrezeptoren ausgelöst, gefolgt von der Fusion von Virion und Zellmembranen. Für umhüllte Viren, wie Influenzaviren, sind die Spike-Glykoproteine für die Rezeptorbindung und Fusion1,2verantwortlich. Virale Hüllkinkoproteine (z.B. Pyrogene, Antigene) sind an vielen wichtigen Eigenschaften und Ereignissen beteiligt, wie z. B. Viruslebenszyklusinitiierung (Bindung und Fusion), virale Pathogenese, Immunogenität, Wirtszellapoptose und zellulärer Tropismus, der zelluläre endozytische Weg, sowie die Übertragung und Neusortierung zwischen Denspezies1,3,4,5,6,7. Die Forschung an viralen Hüllproteinen wird uns helfen, viele Aspekte des Virusinfektionsprozesses zu verstehen. Pseudotypisierte Viruspartikel (pp), auch Pseudovirions oder Pseudopartikel bezeichnet, können durch eine Pseudotypisierungstechnik8,9,10erzeugt werden. Diese Technologie wurde verwendet, um pseudotypisierte Partikel vieler Viren zu entwickeln, einschließlich Hepatitis C11,12, Hepatitis B13, vesikuläre Stomatitis Virus (VSV)14,15, und Influenza-Virus16,17,18,19. Diese Technologie basiert auf dem Gag-Pol-Protein von Lentiviren oder anderen Retroviren.
Pseudotypisierte Viruspartikel können mit einem Drei-Plasmid-System gewonnen werden, indem ein virales Hüllprotein-Expressionsplasmid, ein retrovirales Verpackungsplasmid, das das Hüllen-Env-Gen fehlt, und ein separates Reporter-Plasmid in pp-Produzentenzellen kotransfiziert werden. Das Retrovirus wird durch sein Gag-Protein zusammengesetzt, und es knospen aus einer infizierten Zellmembran, die das Virus Hülle Protein1ausdrückt. Daher ist es möglich, mit dem Retrovirus Gag-Protein mit hilfe des Retrovirus Gag-Proteins grippereiche Pnospen auf einer Zellmembran zu erhalten, die Influenza HA und NA exekliniert. In unseren früheren Studien waren HAs/NAs in allen Kombinationen funktional und in der Lage, ihre entsprechenden Funktionen im viralen Lebenszyklus16,17,18,20,21auszuführen. Diese pps werden verwendet, um biologische Influenza-Eigenschaften zu untersuchen, einschließlich Hämagglutination, Neuraminidase-Aktivität, HA-Rezeptor-Bindung Tropismus, und Infektiosität. Da HA und NA wichtige oberflächenfunktionelle Proteine im viralen Lebenszyklus sind, können nicht übereinstimmende HAs und NAs, die aus verschiedenen Grippestämmen abgeleitet sind, teilweise eine Neusortierung zwischen ihnen nachweisen. Hier erzeugen wir acht Arten von Influenza-Pps, indem wir zwei HAs und zwei NAs (abgeleitet vom HPAI H5N1-Stamm und dem H7N9-Fleck) mit einem Drei-Plasmid-Pseudotypisierungssystem kombinieren. Diese acht Arten von pps umfassen zwei native pps, H5N1pp, H7N9pp; zwei nicht übereinstimmende pps, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; und vier Pps, die nur ein einzelnes Glykoprotein (HA oder NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp beherbergen. Studien zum Influenzavirus, wie H5N1 und H7N9, sind durch Biosicherheitsanforderungen begrenzt. Alle Untersuchungen der Wildinfluenza-Virusstämme sollten in einem Labor der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) durchgeführt werden. Die pseudotypisierte virale Partikeltechnologie kann verwendet werden, um ein künstliches Virion in einer Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) zu verpacken. Daher stellen pps ein sichereres und nützliches Werkzeug dar, um die Influenza-Virusprozesse in Abhängigkeit von seinen beiden wichtigsten Glykoproteinen zu untersuchen: Hemagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA).
Dieses Protokoll beschreibt die Generierung dieser pps mit einer Drei-Plasmid-Kotransfektionsstrategie (im Überblick in Abbildung 1), wie pps zu quantifizieren und Infektiositätsnachweis. Die pp-Produktion umfasst drei Arten von Plasmiden (Abbildung 1). Das Gag-Pol-Gen, das das Retrovirus Gag-Pol-Protein kodiert, wurde aus einem Retrovirus-Verpackungskit geklont und in das pcDNA 3.1-Plasmid eingeführt und mit dem Namen pcDNA-Gag-Pol aufgenommen. Das verbesserte Grüne fluoreszierende Protein (eGFP) Gen, das grünes Fluoreszenzprotein kodiert, wurde aus dem pTRE-EGFP-Vektor geklont, in das pcDNA 3.1-Plasmid eingeführt und als pcDNA-GFP bezeichnet. Beim Klonen wurde über eine Grundierung eine Verpackungssignalsequenz hinzugefügt. Die HA- und NA-Gene wurden in ein pVRC-Plasmid namens pVRC-HA bzw. pVRC-NA geklont. Das letzte Plasmid kodiert das Fusionsprotein und kann durch jedes andere Fusionsprotein von Interesse ersetzt werden. Unsere Pseudotypisierungsplattform umfasst zwei Glykoproteinexpressionsplasmide: pVRC-HA und pVRC-NA. Dies kann die Forschung zur Neusortierung zwischen verschiedenen Virusstämmen in einer BSL-2-Einstellung vereinfachen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70664</td>
			<td>Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic 
			Individual alphanumeric codes for well identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Individual alphanumerical codes for well identification 
			Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma irradiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Excell</td>
			<td>FND500</td>
			<td>fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>cytoflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alveolar adenocarcinoma A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent biological microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51-32P01-FLB3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31-12PHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3006L</td>
			<td>Will withstand up to 14,000 RCF 
			RNase-/DNase-free Nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td>an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td>The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Maximum RCF is 12,500 xg 
			Temperature range from -80 &#176;C to 120 &#176;C 
			RNase-/DNase-free 
			Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP Centrifuge Tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td>a stable and highly reactive serine protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST532</td>
			<td>Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated Culture Dish (60mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td>Trypsin from bovine pancreas 
			TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, &#8805;10,000 BAEE units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK-trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td>This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-titer infectious influenza pseudotyped particles with envelope glycoproteins from highly pathogenic h5n1 and avian h7n9 viruses

Die gelegentliche direkte Übertragung des hoch pathogenen Aviären Influenza-A-Virus H5N1 (HPAI H5N1) und H7N9 auf den Menschen und ihre Letalität sind ernste Probleme der öffentlichen Gesundheit und deuten auf die Möglichkeit einer Epidemie hin. Unser molekulares Verständnis des Virus ist jedoch rudimentär, und es ist notwendig, die biologischen Eigenschaften seiner Hüllproteine als therapeutische Ziele zu untersuchen und Strategien zur Bekämpfung von Infektionen zu entwickeln. Wir entwickelten eine solide virale pseudotypisierte Partikel-(pp)-Plattform zur Untersuchung des Aviären Influenzavirus, einschließlich der funktionellen Analyse seiner Hemagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) Hüllproteine, die Neusortierungseigenschaften der HAs und NAs, Rezeptoren, Tropismen, neutralisierende Antikörper, Diagnose, Infektiosität, für die Zwecke der Arzneimittelentwicklung und Impfstoffentwicklung. Hier beschreiben wir ein experimentelles Verfahren zur Ermittlung von pps mit den Hüllproteinen (HA, NA) aus zwei Influenza-A-Stämmen (HAPI H5N1 und 2013 avian H7N9). Ihre Erzeugung basiert auf der Fähigkeit einiger Viren, wie dem murinen Leukämievirus (MLV), Hüllglykoproteine in ein pp zu integrieren. Darüber hinaus beschreiben wir auch, wie diese pps mit RT-qPCR quantifiziert werden, und die Infektiositätserkennung von nativen und nicht übereinstimmenden Virus-Pps, abhängig vom Ursprung der HAs und NAs. Dieses System ist hochflexibel und anpassungsfähig und kann verwendet werden, um virale pps mit Hüll-Glykoproteinen herzustellen, die in jede andere Art von umhüllten Viren eingearbeitet werden können. So kann diese virale Partikelplattform verwendet werden, um Wildviren in vielen Forschungsuntersuchungen zu untersuchen.

Abhängig von dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren haben wir 10 Arten von pps erzeugt, die zwei Gruppen-HAs/NAs oder VSV-G-Glykoprotein oder No-Envelope-Glykoproteine kombinieren (siehe Tabelle 1). Sieben von ihnen sind ansteckend. Die pps, die no-envelope Glycoprotein oder nur Hafen NA beherbergen, zeigten hier keine Infektiosität. Das Herstellungsverfahren für Influenza pp ist in Abbildung 1dargestellt. Transmissionselektronenmikroskopie von pps (z.B. H5N1pp) ist...

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Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

Dieses Protokoll beschreibt einen experimentellen Prozess zur Herstellung hochtiter infektiöser viraler pseudotypisierter Partikel (pp) mit Hüllglykoproteinen aus zwei Influenza-A-Stämmen und wie ihre Infektiosität bestimmt werden kann. Dieses Protokoll ist sehr anpassungsfähig, um pps von jeder anderen Art von umhüllten Viren mit verschiedenen Hüll-Glykoproteinen zu entwickeln.

Herstellung von hochtiterinfektiösen Influenza-Pseudotyppartikeln mit Hülllykoproteinen aus hoch pathogenen H5N1- und Avian H7N9-Viren

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Diese Technik der Herstellung von Influenza-Virus PP und der Bestimmung seiner Infektiosität kann die Erforschung des Influenzavirus in einer BSL-2-Stadt vereinfachen. Wir normalisierten die PPS für die Infektionen basierend auf qRT-PCR-Daten von PPS. Zwei Glykoprotein-Expressionsplasmide sind kodiert, was die Forschung über die Neusortierung von Viren vereinfachen kann.Überprüfen Sie einen Tag nach der Zellaussaat die Zellmorphologie und -dichte unter einem invertierten Lichtmikroskop. Idealerweise sollte die Zelle bei der Transfektion ca. 85% konfluent sein. Ersetzen Sie das Medium durch einen Milliliter serumfreies DMEM pro Brunnen und legen Sie die Platte wieder in den Inkubator.Für jeden zu transfizierten Zellbrunnen acht Mikroliter des Transfektionsreagenzes auf ein Volumen von 150 Mikrolitern mit reduziertem Serummedium verdünnen. Mischen Sie die Lösung vorsichtig und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten sitzen. In der Zwischenzeit verdünnen Sie 2,5 Mikrogramm Plasmid-DNA in 158 Mikroliter reduzierten Serummediums.Nach der fünfminütigen Inkubation die verdünnte DNA mit verdünntem Transfektionsreagenz kombinieren, die Lösung vorsichtig mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur lassen. Fügen Sie den DNA-Lipid-Komplex zu den entsprechenden Brunnen mit den Zellen in serumfreiem Medium hinzu. Dann mischen Sie die Platte sanft, indem Sie hin und her schaukeln.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für vier bis sechs Stunden. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter DMEM pro Brunnen. Dann inkubieren Sie es für weitere 36 bis 48 Stunden.Samen jeder Art von anfälligen Zelle bei 10 000 Zellen pro Brunnen und eine 96 Well Platte. Dann lassen Sie die Platte über Nacht in einem 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid-Inkubator. Überprüfen Sie am dritten Tag nach der Transfektion die Farbe des Mediums, das rosa oder leicht orange leuchten soll, und untersuchen Sie die Zellen mit einem invertierten biologischen Mikroskop unter 440 bis 460 Nanometer Wellenlänge.Nach 38 bis 48 Stunden nach der Transfektion die pseuotypisierten Partikel oder PPS ernten, indem Sie sie durch einen 0,45 Mikrometer Polyvinyliden-Fluorid-Membranfilter passieren, um Zellablagerungen zu beseitigen, sie dann in kleine Mengen aliquots aufzuteilen und sie bei minus 80 Grad Celsius zu speichern. Zur Quantifizierung des PPS 30 Mikroliter der gereinigten Viruspartikel in ein 1,5 Mikroliter RNase-freies Rohr übertragen und einen Mikroliter Benzonase-Nuklease hinzufügen. Inkubieren Sie die Röhre bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um jegliche DNA- und RNA-Kontamination zu beseitigen.Nach der Inkubation die Probe auf minus 70 Grad Celsius einfrieren, um die Nuklease zu aktivieren und zwei Mikroliter Proteinase K.Inkubieren Sie die Mischung für 30 Minuten, um die Hüllproteine zu verdauen und die CMV-GFP-RNA freizusetzen. Dann inaktiv die Proteinase K bei 100 Grad Celsius für drei Minuten. Quantifizieren Sie die PPS mit quantitativer Reverse-Transkription RTPCR mit dem Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit in den primern und sonden im Textmanuskript angegeben.Normalisieren Sie die PPS auf viermal 10 bis 5 RNA-Kopien pro Milliliter. Fügen Sie dann TPCK-Trypsin zu einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter in das PPS, das H7N9-Hemagglutinin beherbergt. Inkubieren Sie das PPS bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um die funktionalen Untereinheiten HA1 und HA2 zu bilden.Mischen Sie die normalisierten PPS mit DMEM-Medium im Verhältnis eins zu eins, und bringen Sie dann die Platte mit anfälligen Zellen in den Biosicherheitsschrank. Den Überstand ansaugen und die Zellen einmal mit 100 Mikrolitern vorgewärmtem PBS waschen. Fügen Sie 100 Mikroliter PPS-DMEM-Mischung in jeden Brunnen, dreifache Infektiositätstests jeder Art von PPS zu einer anfälligen Zelllinie.Inkubieren Sie die Platte für vier bis sechs Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Dann den Überstand ansaugen und durch 100 Mikroliter DCM-Inkubation ersetzen, die Platte noch 24 bis 36 Stunden vor der Infektiositätserkennung. Unsere Ergebnisse sind PPS gelten jetzt als ansteckend für die Menschen.Daher werden notwendige Sicherheitsvorkehrungen empfohlen, wie das Tragen einer Maske und die Durchführung der Infektiositätstests in einem Biosicherheitsschrank. Dieses Protokoll wurde erzeugt, um 10 Arten von pseudotypisierten Partikeln oder PPS mit zwei gruppierten Hemaglutinin und Neuraminidase vesikuläre stomatitis Virus G G Glycoprotein oder keine Hüllhaut Glycoproteine zu generieren. Die PPS wurden mit Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet und ihre Infektiosität wurden in zwei Zelllinien, A549 und MDCK, bewertet.In der PPS-Gruppe, die H5 beherbergt, betrug die Infektiosität von H5N1, H5 plus N9 und H5 etwa 90%18% bzw. 10% für die Zelllinie A549 bzw. 40%5% bzw. 5% für MDCK. In der PPS-Gruppe, die H7 beherbergt, betrug die Infektiosität von H7N9, H7 plus N1 und H7 etwa 10%7% bzw. 1% für die Zelllinie A549 bzw. 8%4% bzw. 1% für MDCK. Die Infektiosität des vesikulären Stomatitisvirus G G Glycoprotein PP betrug etwa 21% für A549 und 16% für MDCK-Zellen.Während die Delta-Hüllkurve Glykoproteine PP zeigte keine Infektiosität. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass der PP-Produzent HEK-293T/17 Zellen bilden die Grundlage dieses Verfahrens. Das optimale Wachstum lehrt uns also HEK-293T/17 Zellen.Nach diesem Verfahren oder einem anderen Test, wie z. B. L2-Empfängnis, kann der Begrenzungstest durchgeführt werden. Dieser Assay kann fast die biologischen Besonderheiten der Rezeptorpräferenz loswerden und das Muster wird den Tropismus der PPS offenbaren. Da sie die Glykoproteine aus dem Influenzavirus genommen haben, werden sie in zwei plus max geklont.HA und die NA-Proteine können getrennt untersucht werden, so dass wir zwischen ihnen neu zu sanieren. Die Mutanten und die reifen Effekte können erforscht werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Bestimmung von Molekülstrukturen von HIV Hüllglycoproteine ​​mit Cryo-Elektronen-Tomographie und automatisierte Sub-Tomogramm Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Surveillance mit FTA-Karten: Field Methods, Biosafety-und Transportprobleme gelöst

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Verpackung HIV-oder FIV-basierten Lentivector Expressionskonstrukte und Transduktion von VSV-G-pseudotypisierte Viruspartikel

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine ​​aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Modellierung des Lebenszyklus von Ebola Virus unter Biosafety Level 2 Bedingungen mit Virus-ähnlichen Partikeln, die Tetracistronic Minigenome

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Die intranasale Verabreichung von rekombinantem Influenza Vaccines in chimären Maus-Modelle zu Mucosale Immunität Studieren

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Behandlung von Thrombozyten Produkte mit Riboflavin und UV-Licht: Wirksamkeit gegen bakterielle Kontamination mit hohem Titer

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Schnelle molekulare Erkennung und Differenzierung von Influenza-Viren A und B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...