Name: production of high-titer infectious influenza pseudotyped particles with envelope glycoproteins from highly pathogenic h5n1 and avian h7n9 viruses
Uploaded: 2020-01-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da di medicina provinciale e piano di scienza e tecnologia della salute (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science e Technology key Project (Grant Numbers, 2014-11) e Hangzhou progetto di applicazione autonoma comunale di sviluppo sociale e ricerca scientifica (Grant Numbers, 20191203B134).

1. Giorno 1: Coltura cellulare e semina
<ol><li>Coltivare il rene embrionale umano (HEK) 293T/17 cellule in piatti da 60 mm con il mezzo essenziale modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 100 U/mL penicillina-streptomicina (DMEM Complete Medium, DCM) in un incubatore di biossido di carbonio (CO2)a 37 gradi, 5% fino a circa l'80% di confluente. NOTA: si consigliano le cellule di passaggio basso HEK 293T/17.</li>
	<li>Lavare con cura le cellule con 5 mL di fosfato tampona...

<ol>
	<li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology (6th). , (2013).</li><li>White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+mechanisms+of+viral+membrane+fusion+proteins:+multiple+variations+on+a+common+theme.">Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).</li><li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-clade+protective+immune+responses+to+influenza+viruses+with+H5N1+HA+and+NA+elicited+by+an+influenza+virus-like+particle.">Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle.</a> PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+pseudotyped+influenza+viral+particles+in+neutralizing+antibody+detection.">Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection.</a> PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).</li><li>Wyatt, R., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+envelope+glycoproteins:+fusogens,+antigens,+and+immunogens.">The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens.</a> Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).</li><li>Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmembrane+domains+of+Sindbis+virus+envelope+glycoproteins+induce+cell+death.">The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death.</a> Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).</li><li>Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+Glycoproteins+Are+Delivered+to+Virus+Assembly+Sites+Through+Dynamin-Dependent+Endocytosis.">HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis.</a> Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).</li><li>Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotype+formation+between+enveloped+RNA+and+DNA+viruses.">Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses.</a> Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).</li><li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Control+of+Cellular+Susceptibility+to+Pseudotypes+of+Rous+Sarcoma+Virus.">Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus.</a> Virology. 26, 270-276 (1965).</li><li>Steffen, I., Simmons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotyping+Viral+Vectors+With+Emerging+Virus+Envelope+Proteins.">Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins.</a> Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).</li><li>Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+hepatitis+C+virus+pseudo-particles+containing+functional+E1-E2+envelope+protein+complexes.">Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.</a> Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).</li><li>Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCV+envelope+protein+function+is+dependent+on+the+peptides+preceding+the+glycoproteins.">HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).</li><li>Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+potentially+important+elements+of+the+hepatitis+B+virus+large+envelope+protein+are+dispensable+for+the+infectivity+of+hepatitis+delta+virus.">Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus.</a> Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).</li><li>Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSV-G-pseudotyped+retroviral+packaging+through+adenovirus-mediated+inducible+gene+expression.">VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).</li><li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. 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J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+M2+envelope+protein+augments+avian+influenza+hemagglutinin+pseudotyping+of+lentiviral+vectors.">Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).</li><li>Pan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+mediates+avian+influenza+H5N1+pseudotyped+particle-induced+lung+inflammation+through+NF-kappaB+and+p38+MAPK+signaling+pathways.">Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).</li><li>Szecsi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neutralising+antibodies+by+virus-like+particles+harbouring+surface+proteins+from+highly+pathogenic+H5N1+and+H7N1+influenza+viruses.">Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses.</a> Virology Journal. 3, 70 (2006).</li><li>Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+evaluation+of+an+influenza+A+(H5)+pseudotyped+lentiviral+particle-based+serological+assay.">Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay.</a> Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).</li><li>Garcia, J. M., Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+influenza+pseudotyped+lentiviral+particles+and+their+use+in+influenza+research+and+diagnosis:+an+update.">Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).</li><li>Haynes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza-pseudotyped+Gag+virus-like+particle+vaccines+provide+broad+protection+against+highly+pathogenic+avian+influenza+challenge.">Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge.</a> Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).</li><li>Schmeisser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+mammalian+virus-like+particles+from+modified+vaccinia+virus+Ankara+vectors+expressing+influenza+H5N1+hemagglutinin+and+neuraminidase.">Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase.</a> Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+(SARS-CoV)+S+glycoprotein+and+influenza+matrix+1+efficiently+form+virus-like+particles+(VLPs)+that+protect+mice+against+challenge+with+SARS-CoV.">Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV.</a> Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).</li><li>Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Lyssavirus-Neutralizing+Antibodies+Using+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotype+Particles.">Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles.</a> Viruses. 8 (9), 254 (2016).</li><li>Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV+Fusion+Peptide+Forms+an+Extended+Bipartite+Fusion+Platform+that+Perturbs+Membrane+Order+in+a+Calcium-Dependent+Manner.">The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).</li><li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus+infection+is+inhibited+by+griffithsin.">Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin.</a> Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).</li><li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Pseudotyped+Particles+to+Study+Highly+Pathogenic+Coronaviruses+in+a+Biosafety+Level+2+Setting.">Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+leukemia+virus+pseudotypes+of+La+Crosse+and+Hantaan+Bunyaviruses:+a+system+for+analysis+of+cell+tropism.">Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism.</a> Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).</li><li>Wool-Lewis, R. J., Bates, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebola+virus+entry+by+using+pseudotyped+viruses:+identification+of+receptor-deficient+cell+lines.">Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines.</a> Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).</li><li>Chen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+design+of+more+effective+avian+replication-incompetent+retroviral+vectors.">Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors.</a> Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).</li><li>Kaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+generation+of+pseudotype-based+serum+neutralization+assay+for+Nipah+virus+antibodies:+sensitive+and+high-throughput+analysis+utilizing+secreted+alkaline+phosphatase.">Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase.</a> Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).</li><li>Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+modeling+of+influenza+A+virus+replication+in+cell+cultures+predicts+infection+dynamics+for+highly+different+infection+conditions.">Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions.</a> PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).</li><li>Petiot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+viruses+production:+Evaluation+of+a+novel+avian+cell+line+DuckCelt(R)-T17.">Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17.</a> Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).</li></ol>

In questo protocollo, descriviamo un metodo per produrre particelle pseudotimi del virus dell'influenza (pp) in un ambiente BSL-2. Il reporter plasmid pcDNA-GFP è incorporato nei pps e può essere utilizzato per quantificare pps da FACS in un assaggio di infettività. Abbiamo scelto due tipi di linee cellulari sensibili perché sono ampiamente utilizzate nella ricerca sull'influenza. Le cellule MDCK fornirebbero un buon controllo alle cellule umane immortalate variabili utilizzate in questi studi.
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La missione di una particella virale è quella di trasportare il suo genoma da una cellula ospite infetta a una cellula ospite non infetta e di consegnarlo nel citoplasma o nel nucleo in una forma di replica-competente1. Questo processo è inizialmente innescato dal legame ai recettori cellulari ospiti, seguito dalla fusione di membrane virion e cellulari. Per i virus avvolti, come i virus dell'influenza, le glicoproteine a spillo sono responsabili del legame del recettore e della fusione1,2. Le letalici virali (ad esempio, pirogeni, antigeni), sono coinvolte in molte importanti proprietà ed eventi, come l'inizio del ciclo di vita dei virus (legatura e fusione), la patogenesi virale, l'immunogenicità, l'apoptosi delle cellule ospiti e il tropismo cellulare, la via endocitica cellulare, così come la trasmissione e il riassortimento delle interspecie1,3,4,5,6,7. La ricerca sulle glicoproteine della busta virale ci aiuterà a capire molti aspetti del processo di infezione virale. Le particelle virali pseudotipate (pp), anche definite pseudovirioni o pseudoparticelle, possono essere generate attraverso una tecnica di pseudotipizzazione8,9,10. Questa tecnologia è stata utilizzata per sviluppare particelle pseudotimi di molti virus, tra cui l'epatite C11,12, l'epatite B13, il virus della stomatite vescicolare (VSV)14,15e il virus dell'influenza16,17,18,19. Questa tecnologia si basa sulla proteina Gag-Pol dei lentivirus o di altri retrovirus.
Le particelle virali pseudotipate possono essere ottenute utilizzando un sistema a tre plasmidi cotraducendo un plasmide di espressione glicoproteina virale, un plasmide di imballaggio retrovirale che manca il gene dell'involucro e un plasmide reporter separato nelle cellule produttrici di pp. Il retrovirus è assemblato dalla sua proteina Gag, e germoglia da una membrana cellulare infetta che esprime la proteina busta virus1. Pertanto, è possibile ottenere pps di influenza ad alto titer utilizzando la proteina Gag retrovirus per produrre gemme su una membrana cellulare che esprime influenza HA e NA. Nei nostri studi precedenti, gli HA/NA in tutte le combinazioni erano funzionali e in grado di svolgere le funzioni corrispondenti nel ciclo di vita virale16,17,18,20,21. Questi pp sono usati per studiare le caratteristiche biologiche dell'influenza, tra cui l'eagoglutinazione, l'attività neuraminidese, il tropismo legante del recettore HA e l'infettività. Poiché HA e NA sono entrambe importanti proteine funzionali della superficie nel ciclo di vita virale, gli HA e le AN non corrispondenti derivati da diversi ceppi di influenza possono in parte dimostrare il riassortimento tra di loro. Qui, generiamo otto tipi di pp sottinfluenzali combinando due HA e due NA (derivati dal ceppo HPAI H5N1 e la macchia H7N9), utilizzando un sistema di pseudotipida a tre plasmi. Questi otto tipi di pp includono due pp nativi, H5N1pp, H7N9pp; due pps non corrispondenti, (H5-N9)pp, (H7-N1)pp; e quattro pp che ospitano una sola glicoproteina (HA o NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Gli studi sul virus dell'influenza, come H5N1 e H7N9, sono limitati dai requisiti di biosicurezza. Tutti gli studi sui ceppi del virus dell'influenza selvatica devono essere eseguiti in un laboratorio di livello di biosicurezza 3 (BSL-3). La tecnologia delle particelle virali pseudotipata può essere utilizzata per confezionare un virione artificiale in un ambiente di livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Pertanto, i pp rappresentano uno strumento più sicuro e utile per studiare i processi del virus dell'influenza a seconda dei suoi due principali glicoproteine: l'emagglutinina (HA) e la neuraminidasi (NA).
Questo protocollo descrive la generazione di questi pps con una strategia di cotransfezione a tre plasmide (panoramica nella Figura 1), come quantificare pps e il rilevamento dell'infettività. La produzione pp coinvolge tre tipi di plasmidi (Figura 1). Il gene gag-pol, che codifica la proteina Gag-Pol retrovirus, è stato clonato da un kit di confezionamento retrovirus e inserito nel plasmide di pcDNA 3.1 e chiamato pcDNA-Gag-Pol. Il gene delle proteine fluorescenti verdi potenziate (eGFP), che codifica la Proteina Fluorescente Verde, è stato clonato dal vettore pTRE-EGFP, inserito nel plasmide di pcDNA 3.1 e chiamato pcDNA-GFP. Durante la clonazione, è stata aggiunta una sequenza di segnale di imballaggio (sezione ) tramite un primer. I geni HA e NA sono stati clonati in un plasmide pVRC, chiamato pVRC-HA e pVRC-NA, rispettivamente. L'ultimo plasmide codifica la proteina di fusione e può essere sostituito con qualsiasi altra proteina di fusione di interesse. La nostra piattaforma di pseudotipigrafia include due plasmidi di espressione glicoproteina: pVRC-HA e pVRC-NA. Questo può semplificare la ricerca sul riassortimento tra diversi ceppi di virus in un ambiente BSL-2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70664</td>
			<td>Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic 
			Individual alphanumeric codes for well identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Individual alphanumerical codes for well identification 
			Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma irradiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Excell</td>
			<td>FND500</td>
			<td>fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>cytoflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alveolar adenocarcinoma A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent biological microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51-32P01-FLB3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31-12PHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3006L</td>
			<td>Will withstand up to 14,000 RCF 
			RNase-/DNase-free Nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td>an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td>The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Maximum RCF is 12,500 xg 
			Temperature range from -80 &#176;C to 120 &#176;C 
			RNase-/DNase-free 
			Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP Centrifuge Tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td>a stable and highly reactive serine protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST532</td>
			<td>Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated Culture Dish (60mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td>Trypsin from bovine pancreas 
			TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, &#8805;10,000 BAEE units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK-trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td>This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-titer infectious influenza pseudotyped particles with envelope glycoproteins from highly pathogenic h5n1 and avian h7n9 viruses

La trasmissione diretta occasionale dell'influenza aviaria altamente patogena Un virus H5N1 (HPAI H5N1) e H7N9 agli esseri umani e la loro letalità sono gravi problemi di salute pubblica e suggeriscono la possibilità di un'epidemia. Tuttavia, la nostra comprensione molecolare del virus è rudimentale ed è necessario studiare le proprietà biologiche delle sue proteine dell'involucro come bersagli terapeutici e sviluppare strategie per controllare l'infezione. Abbiamo sviluppato una solida piattaforma di particelle pseudotimi virali (pp) per studiare il virus dell'influenza aviaria, compresa l'analisi funzionale delle sue emagglutininina (HA) e delle leglicoproteine della neuraminidasi (NA), le caratteristiche di riassortimento degli HA e delle AN, recettori, tropismi, anticorpi neutralizzanti, diagnosi, infettività, ai fini dello sviluppo di farmaci e della progettazione di vaccini. Qui, descriviamo una procedura sperimentale per stabilire pps con le legiole di busta (HA, NA) da due ceppi influenzali A (HAPI H5N1 e 2013 avian H7N9). La loro generazione si basa sulla capacità di alcuni virus, come il virus della leucemia murina (MLV), di incorporare le glicoproteine della busta in un pp. Inoltre, abbiamo anche dettagliato come questi pp sono quantificati con RT-qPCR, e il rilevamento di infettività di virus nativi e non corrispondenti pps a seconda dell'origine delle hA e delle AN. Questo sistema è altamente flessibile e adattabile e può essere utilizzato per stabilire pp virali con legioproteine di busta che possono essere incorporati in qualsiasi altro tipo di virus avvolto. Pertanto, questa piattaforma di particelle virali può essere utilizzata per studiare i virus selvatici in molte indagini di ricerca.

A seconda della procedura generale descritta in precedenza, abbiamo generato 10 tipi di pp che combinano due HA di gruppo o glicoproteine VSV-G o lecoproteine senza busta (mostrate nella tabella 1). Sette di loro sono contagiosi. Gli pp s che non contengono glicoproteine senza involucro o solo il porto NA non hanno mostrato alcuna infettività qui. La procedura di produzione dell'influenza pp è descritta nella Figura 1. Le micrografie elettroniche di trasmissione di pppp (a...

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Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

Questo protocollo descrive un processo sperimentale per produrre particelle pseudotimi virali infettive ad alto tipo (pp) con glicoproteine da due ceppi influenzali A e come determinarne l'infettività. Questo protocollo è altamente adattabile per sviluppare pps di qualsiasi altro tipo di virus avvolto con diversi glicoproteine busta.

Produzione di particelle pseudotioniche di influenza ad alto livello con le legiole di busta dei virus altamente patogeni H5N1 e Avian H7N9

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Questa tecnica di produzione di PP virale influenzale e determinarne l'infettività può semplificare la ricerca del virus influenzale in una città BSL-2. Abbiamo normalizzato lo SPA per le infezioni sulla base dei dati qRT-PCR di PPS. Vengono codificati due plasmidi di espressione della glicoproteina, che possono semplificare la ricerca sul riassegnazione dei virus.Un giorno dopo la semina cellulare, controllare la morfologia e la densità delle cellule al microscopio a luce invertita. Idealmente la cella dovrebbe essere circa l'85% confluente alla trasfezione. Sostituire il mezzo con un millilitro di DMEM senza siero per pozzo e rimettere la piastra nell'incubatore.Per ogni pozzo di cellule da trasfetto, diluire otto microlitri del reagente di trasfezione a un volume di 150 microlitri con mezzo siebro ridotto. Mescolare delicatamente la soluzione e lasciarla riposare a temperatura ambiente per cinque minuti. Nel frattempo, diluire 2,5 microgrammi di DNA plasmide in 158 microlitri di mezzo siebro ridotto.Dopo i cinque minuti di incubazione, unire il DNA diluito con il reagente di trasfezione diluito, mescolare delicatamente la soluzione e lasciarla a temperatura ambiente per 15 minuti. Aggiungere il complesso lipidico del DNA ai pozzi corrispondenti con le cellule in mezzo privo di siero. Quindi mescolare delicatamente il piatto dondolando avanti e indietro.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per quattro o sei ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo e sostituirlo con due millilitri di DMEM per pozzo. Quindi incubarlo per altre 36-48 ore.Seme ogni tipo di cellula sensibile a 10.000 cellule per pozzo e una piastra di 96 po '. Quindi lasciare il piatto durante la notte in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e del 5%. Il terzo giorno dopo la trasfezione, controllare il colore del mezzo che dovrebbe illuminare il rosa o leggermente arancione ed esaminare le cellule con un microscopio biologico florescente invertito sotto la lunghezza d'onda da 440 a 460 nanometri.A 38-48 ore dopo la post-trasfezione, raccogliere le particelle pseuotipate o PPS passandole attraverso un filtro a membrana in fluoruro di polivinilidene da 0,45 micrometri per eliminare i detriti cellulari, quindi dividerli in piccole aliquote di volume e conservarli a meno 80 gradi Celsius. Per quantificare il PPS, trasferire 30 microlitri delle particelle virali purificate in un tubo privo di RNasi da 1,5 microlitri e aggiungere un microliter di Benzonasi Nucleasi. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius per un'ora per eliminare qualsiasi contaminazione da DNA e RNA.Dopo l'incubazione, congelare il campione a meno 70 gradi Celsius per attivere la nucleasi e aggiungere due microlitri di Proteinasi K.Incubare la miscela per 30 minuti per digerire le proteine dell'involucro e rilasciare l'RNA CMV-GFP. Quindi inattivo la Proteinasi K a 100 gradi Celsius per tre minuti. Quantificare il PPS con rtpcr di trascrizione quantitativa inversa utilizzando l'Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit nei primer e nelle sonde specificate nel manoscritto testuale.Normalizzare lo SPA a quattro per 10-quinta copia di RNA per millilitro. Quindi aggiungere TPCK-tripina a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro nel PPS che ospita l'emagglutinina H7N9. Incubare il PPS a 37 gradi Celsius per un'ora per formare le subunità funzionali HA1 e HA2.Mescolare il PPS normalizzato con il mezzo DMEM con un rapporto uno a uno, quindi portare la piastra contenente cellule sensibili nell'armadio di biosicurezza. Aspirare il supernatante e lavare le cellule una volta con 100 microlitri di PBS pre-riscaldato. Aggiungere 100 microlitri di miscela PPS-DMEM in ogni pozzo, triplicando le prove di infettività di ogni tipo di SPA a una linea cellulare sensibile.Incubare la piastra per quattro o sei ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi aspirare il supernatante e sostituirlo con 100 microlitri di DCM Incubare la piastra per altre 24-36 ore prima del rilevamento dell'infettività. I nostri risultati sono che gli SPA sono considerati ora infettivi per le persone.Quindi si raccomandano procedure di protezione necessarie da adottare come indossare una maschera ed eseguire i test di infettività in un armadietto di biosicurezza. Questo protocollo è stato generato per generare 10 tipi di particelle pseudotipate o SPA con due emaglutinina raggruppata e neuraminidasi virus della stomatite vescicolare G glicoproteina o nessuna glicoproteine avvolta. I PPS sono stati imageati con microscopia elettronica a trasmissione e la loro infettività è stata valutata in due linee cellulari, A549 e MDCK.Nel gruppo PPS che ospita H5, l'infettività di H5N1, H5 più N9 e H5 era di circa il 90%18% e il 10% per le linee cellulari A549 e 40%5% e 5% per MDCK, rispettivamente. Nel gruppo PPS che ospita H7, l'infettività di H7N9, H7 più N1 e H7 era di circa il 10%7% e l'1% per la linea cellulare A549 e 8%4% e 1% per MDCK, rispettivamente. L'infettività del virus della stomatite vescicolare G glicoproteina PP era di circa il 21% per L'A549 e del 16% per le cellule MDCK.Mentre la busta delta glicoproteine PP non mostrava infettività. È fondamentale ricordare che le cellule HEK-293T/17 del produttore di PP costituiscono alla base di questa procedura. Quindi la crescita ottimale ci insegna che le cellule HEK-293T/17 sono le più importanti.Seguendo questa procedura o qualche altro test come L2 si può ricettare il saggio di delimitazione. Questo saggio può quasi eliminare le peculiarità biologiche della preferenza del recettore e il modello rivelerà il tropismo del PPS. Dal momento che hanno preso le glicoproteine dal virus influenzale sono clonati in due più max.Ha e le proteine NA possono essere studiate separatamente in modo da riasordinare tra di loro. I mutanti e gli effetti maturi possono essere esplorati.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Determinazione di strutture molecolari di glicoproteine ​​dell&#39;HIV Busta con Cryo-Electron Positron e automatizzato Sub-tomogramma Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Sorveglianza dell&#39;influenza aviaria con FTA Carte: metodi per i campi, Biosicurezza, e problemi di trasporto Risolto

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Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Espressione dei funzionali ricombinante emoagglutinina e neuraminidasi proteine ​​del virus Novel H7N9 Influenza utilizzando l&#39;espressione sistema Baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

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Modellazione il ciclo di vita Ebola Virus Sotto livello di biosicurezza 2 condizioni con particelle virus-simili contenenti Tetracistronic Minigenomes

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Intranasale somministrazione di ricombinante Influenza vaccini nei modelli chimerico topo per studiare immunità delle mucose

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Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Trattamento dei prodotti piastrinici con riboflavina e luce UV: Efficacia Contro alto titolo contaminazione batterica

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Rilevazione rapida molecolare e la differenziazione dei virus influenzali A e B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...