Name: production of high-titer infectious influenza pseudotyped particles with envelope glycoproteins from highly pathogenic h5n1 and avian h7n9 viruses
Uploaded: 2020-01-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses at JoVE.com

この研究は浙江省医学・健康科学技術計画(グラント番号、2017KY538)、杭州市立医科医療技術計画(グラント番号、OO20190070)、杭州医科、及び杭州医科大学の助成金によって支えられた。技術キープロジェクト(グラント番号、2014Z11)と杭州自治体の自律的な社会開発と科学研究のアプリケーションプロジェクト(グラント番号、20191203B134)。

1. 1日目:細胞培養と播種
<ol><li>10%胎児ウシ血清(FBS)および100 U/mLペニシリンストレプトマイシン(DMEMコンプリートミディアム)を添加したダルベッコの変性必須培地(DMEM)を用いて、60mm皿でヒト胚性腎臓(HEK)293T/17細胞を培養し、 DCM)を37ωで、5%の二酸化炭素(CO2)インキュベーターを約80%のコンフルエントまでインキュベートする。 注:HEK 293T/17低通路セルをお勧めします。</li>
	<li>5 mL の?...

<ol>
	<li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology (6th). , (2013).</li><li>White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+mechanisms+of+viral+membrane+fusion+proteins:+multiple+variations+on+a+common+theme.">Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).</li><li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-clade+protective+immune+responses+to+influenza+viruses+with+H5N1+HA+and+NA+elicited+by+an+influenza+virus-like+particle.">Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle.</a> PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+pseudotyped+influenza+viral+particles+in+neutralizing+antibody+detection.">Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection.</a> PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).</li><li>Wyatt, R., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+envelope+glycoproteins:+fusogens,+antigens,+and+immunogens.">The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens.</a> Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).</li><li>Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmembrane+domains+of+Sindbis+virus+envelope+glycoproteins+induce+cell+death.">The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death.</a> Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).</li><li>Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+Glycoproteins+Are+Delivered+to+Virus+Assembly+Sites+Through+Dynamin-Dependent+Endocytosis.">HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis.</a> Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).</li><li>Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotype+formation+between+enveloped+RNA+and+DNA+viruses.">Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses.</a> Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).</li><li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Control+of+Cellular+Susceptibility+to+Pseudotypes+of+Rous+Sarcoma+Virus.">Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus.</a> Virology. 26, 270-276 (1965).</li><li>Steffen, I., Simmons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotyping+Viral+Vectors+With+Emerging+Virus+Envelope+Proteins.">Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins.</a> Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).</li><li>Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+hepatitis+C+virus+pseudo-particles+containing+functional+E1-E2+envelope+protein+complexes.">Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.</a> Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).</li><li>Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCV+envelope+protein+function+is+dependent+on+the+peptides+preceding+the+glycoproteins.">HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).</li><li>Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+potentially+important+elements+of+the+hepatitis+B+virus+large+envelope+protein+are+dispensable+for+the+infectivity+of+hepatitis+delta+virus.">Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus.</a> Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).</li><li>Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSV-G-pseudotyped+retroviral+packaging+through+adenovirus-mediated+inducible+gene+expression.">VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).</li><li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors:+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells.">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pseudoparticles+paired+with+hemagglutinin+and+neuraminidase+from+highly+pathogenic+H5N1+influenza+and+avian+influenza+A+(H7N9)+viruses.">Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses.</a> Virus Research. 253, 20-27 (2018).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+Pseudotyped+Particles+Pairing+Hemagglutinin+of+Highly+Pathogenic+Avian+Influenza+a+H5N1+Virus+with+Neuraminidases+of+The+2009+Pandemic+H1N1+and+a+Seasonal+H3N2.">Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2.</a> Journal of Bioterrorism &amp; Biodefense. 2, 104 (2011).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neuraminidases+from+the+highly+pathogenic+avian+H5N1+and+2009+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses.">Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).</li><li>Nefkens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+pseudotyped+lentiviral+particles:+characterization+of+a+new+method+for+avian+H5N1+influenza+sero-diagnosis.">Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis.</a> Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+and+neuraminidase+matching+patterns+of+two+influenza+A+virus+strains+related+to+the+1918+and+2009+global+pandemics.">Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oseltamivir+boosts+2009+H1N1+virus+infectivity+in+vitro.">Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).</li><li>McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+M2+envelope+protein+augments+avian+influenza+hemagglutinin+pseudotyping+of+lentiviral+vectors.">Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).</li><li>Pan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+mediates+avian+influenza+H5N1+pseudotyped+particle-induced+lung+inflammation+through+NF-kappaB+and+p38+MAPK+signaling+pathways.">Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).</li><li>Szecsi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neutralising+antibodies+by+virus-like+particles+harbouring+surface+proteins+from+highly+pathogenic+H5N1+and+H7N1+influenza+viruses.">Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses.</a> Virology Journal. 3, 70 (2006).</li><li>Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+evaluation+of+an+influenza+A+(H5)+pseudotyped+lentiviral+particle-based+serological+assay.">Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay.</a> Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).</li><li>Garcia, J. M., Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+influenza+pseudotyped+lentiviral+particles+and+their+use+in+influenza+research+and+diagnosis:+an+update.">Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).</li><li>Haynes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza-pseudotyped+Gag+virus-like+particle+vaccines+provide+broad+protection+against+highly+pathogenic+avian+influenza+challenge.">Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge.</a> Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).</li><li>Schmeisser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+mammalian+virus-like+particles+from+modified+vaccinia+virus+Ankara+vectors+expressing+influenza+H5N1+hemagglutinin+and+neuraminidase.">Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase.</a> Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+(SARS-CoV)+S+glycoprotein+and+influenza+matrix+1+efficiently+form+virus-like+particles+(VLPs)+that+protect+mice+against+challenge+with+SARS-CoV.">Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV.</a> Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).</li><li>Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Lyssavirus-Neutralizing+Antibodies+Using+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotype+Particles.">Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles.</a> Viruses. 8 (9), 254 (2016).</li><li>Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV+Fusion+Peptide+Forms+an+Extended+Bipartite+Fusion+Platform+that+Perturbs+Membrane+Order+in+a+Calcium-Dependent+Manner.">The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).</li><li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus+infection+is+inhibited+by+griffithsin.">Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin.</a> Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).</li><li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Pseudotyped+Particles+to+Study+Highly+Pathogenic+Coronaviruses+in+a+Biosafety+Level+2+Setting.">Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+leukemia+virus+pseudotypes+of+La+Crosse+and+Hantaan+Bunyaviruses:+a+system+for+analysis+of+cell+tropism.">Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism.</a> Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).</li><li>Wool-Lewis, R. J., Bates, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebola+virus+entry+by+using+pseudotyped+viruses:+identification+of+receptor-deficient+cell+lines.">Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines.</a> Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).</li><li>Chen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+design+of+more+effective+avian+replication-incompetent+retroviral+vectors.">Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors.</a> Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).</li><li>Kaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+generation+of+pseudotype-based+serum+neutralization+assay+for+Nipah+virus+antibodies:+sensitive+and+high-throughput+analysis+utilizing+secreted+alkaline+phosphatase.">Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase.</a> Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).</li><li>Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+modeling+of+influenza+A+virus+replication+in+cell+cultures+predicts+infection+dynamics+for+highly+different+infection+conditions.">Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions.</a> PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).</li><li>Petiot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+viruses+production:+Evaluation+of+a+novel+avian+cell+line+DuckCelt(R)-T17.">Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17.</a> Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).</li></ol>

このプロトコルでは、BSL-2設定でインフルエンザウイルス擬似型粒子(pp)を生成する方法について説明する。レポータープラスミドpcDNA-GFPはppsに組み込まれ、感染性アッセイでFACSによってppsを定量するために使用することができる。インフルエンザの研究に広く用いられているため、2種類の影響を受けやすい細胞株を選びました。MDCK細胞は、これらの研究で使用される可変不死化ヒト細胞に?...

ウイルス粒子の使命は、感染した宿主細胞から非感染宿主細胞にそのゲノムを輸送し、それを複製能力のある形態1の細胞質または核に送達することである。このプロセスは、最初は宿主細胞受容体への結合によって引き起こされ、続いてビリオンと細胞膜の融合が続く。インフルエンザウイルスのようなエンベロープウイルスの場合、スパイク糖タンパク質は受容体結合および融合1、2を担う。ウイルスエンベロープ糖タンパク質(例えば、パイロゲン、抗原)は、ウイルスライフサイクル開始(結合および融合)、ウイルス病因、免疫原性、宿主細胞アポトーシスおよび細胞トロピズム、細胞内分泌経路、ならびに種間の伝染および再分類など、多くの重要な特性および事象に関与している。ウイルスエンベロープ糖タンパク質に関する研究は、ウイルス感染プロセスの多くの側面を理解するのに役立ちます。擬似型ウイルス粒子(pp)は、擬似ウイルスまたは擬似粒子とも呼ばれ、擬似タイピング技術8、9、10を介して生成することができる。この技術は、C型肝炎11、12、B型肝炎13、小胞性口内炎ウイルス(VSV)14、15、およびインフルエンザウイルス16、17、18、19を含む多くのウイルスの擬似型粒子を開発するために使用されている。この技術は、レンチウイルスまたは他のレトロウイルスのGag-Polタンパク質に基づいています。
擬似型ウイルス粒子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質発現プラスミドをコトランスフェクションすることにより3プラスミド系を用いて得ることができ、エンベロープenv遺伝子を欠損させるレトロウイルス包装プラスミド、およびppプロデューサー細胞に別のレポータープラスミドを得ることができる。レトロウイルスは、そのGagタンパク質によって組み立てられ、ウイルスエンベロープタンパク質1を発現する感染細胞膜から芽を出す。従って、レトロウイルスギャグタンパク質を用いて高力インフルエンザppsを得て、インフルエンザHAおよびNAを発現する細胞膜上に芽を生成することができる。これまでの研究では、すべての組み合わせにおけるHA/NAは機能的であり、ウイルスライフサイクル16、17、18、20、21で対応する機能を実行することができました。これらのppsは、ヘマグルチン酸、ノイラミニダーゼ活性、HA受容体結合トロピズム、および感染性を含むインフルエンザの生物学的特性を調べるために使用されます。HAとNAはいずれもウイルスのライフサイクルにおいて重要な表面機能タンパク質であるため、異なるインフルエンザに由来するHAとNAの不一致は、それらの間の再分け合いを部分的に示すことができる。ここでは、3プラスミド擬似タイピングシステムを用いて、2つのHAと2つのNA(HPAI H5N1株とH7N9染色に由来する)を組み合わせて8種類のインフルエンザppsを生成します。ppsのこれらの8つのタイプは、2つのネイティブpps、H5N1pp、H7N9ppが含まれています。2 つの不一致の pps, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp;1つの糖タンパク質(HAまたはNA)のみを収容する4つのpps、H5pp、N1pp、H7pp、N9pp.インフルエンザウイルスに関する研究、H5N1およびH7N9などの、バイオセーフティ要件によって制限される。野生インフルエンザウイルス株のすべての研究は、バイオセーフティレベル3(BSL-3)実験室で行われるべきである。擬似型ウイルス粒子技術は、バイオセーフティレベル2(BSL-2)設定で人工ビリオンをパッケージ化するために使用することができます。したがって、ppsは、ヘマグルチニン(HA)とノイラミニダーゼ(NA)の2つの主要な糖タンパク質に応じてインフルエンザウイルスプロセスを研究するためのより安全で有用なツールを表します。
このプロトコルは、3プラスミドコトランスフェクション戦略(図1で概観)を用いたこれらのppsの生成、ppsの定量方法、および感染性検出について説明する。ppの生産には3種類のプラスミドが含まれます(図1)。レトロウイルスGag-Polタンパク質をコードするgag-pol遺伝子をレトロウイルス包装キットからクローニングし、pcDNA 3.1プラスミドに挿入し、pcDNA-Gag-Polと名付けました。緑色蛍光タンパク質をコードする強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)遺伝子をpTRE-EGFPベクターからクローニングし、pcDNA 3.1プラスミドに挿入し、pcDNA-GFPと呼んだ。クローニング中に、プライマーを介して包装シグナル(ƒ)配列を追加した。HA遺伝子およびNA遺伝子を、それぞれpVRC-HAおよびpVRC-NAと名付けられたpVRCプラスミドにクローニングした。最後のプラスミドは融合タンパク質をコードし、目的の他の融合タンパク質と置き換えることができます。当社の擬似タイピングプラットフォームには、pVRC-HAとpVRC-NAの2つの糖タンパク質発現プラスミドが含まれています。これにより、BSL-2設定における異なるウイルス株間の再種合けに関する研究を簡素化することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70664</td>
			<td>Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic 
			Individual alphanumeric codes for well identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Individual alphanumerical codes for well identification 
			Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma irradiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Excell</td>
			<td>FND500</td>
			<td>fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>cytoflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alveolar adenocarcinoma A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent biological microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51-32P01-FLB3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31-12PHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3006L</td>
			<td>Will withstand up to 14,000 RCF 
			RNase-/DNase-free Nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td>an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td>The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Maximum RCF is 12,500 xg 
			Temperature range from -80 &#176;C to 120 &#176;C 
			RNase-/DNase-free 
			Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP Centrifuge Tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td>a stable and highly reactive serine protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST532</td>
			<td>Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated Culture Dish (60mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td>Trypsin from bovine pancreas 
			TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, &#8805;10,000 BAEE units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK-trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td>This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-titer infectious influenza pseudotyped particles with envelope glycoproteins from highly pathogenic h5n1 and avian h7n9 viruses

高病原性鳥インフルエンザA型ウイルスH5N1(HPAI H5N1)及びH7N9のヒト及びその致死性の時折の直接感染は、深刻な公衆衛生上の問題であり、流行の可能性を示唆している。しかし、ウイルスの分子理解は初歩的であり、そのエンベロープタンパク質の生物学的性質を治療標的として研究し、感染を制御する戦略を開発する必要があります。ヘマグルチニン(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)エンベロープ糖タンパク質の機能解析、HAおよびNAの再種化特性を含む鳥インフルエンザウイルスを研究するための固体ウイルス擬似型粒子(pp)プラットフォームを開発し、受容体は、栄養、中和抗体、診断、感染性、薬剤開発およびワクチン設計の目的で。ここでは、2つのインフルエンザA型(HAPI H5N1および2013鳥類H7N9)からエンベロープ糖タンパク質(HA,NA)を用いてppsを確立するための実験手順について説明する。彼らの世代は、マウス白血病ウイルス(MLV)のようないくつかのウイルスの容量に基づいて、エンベロープ糖タンパク質をppに組み込む。さらに、これらのppsをRT-qPCRで定量化する方法、およびHとNの起源に応じてネイティブおよび不一致のウイルスppsの感染性検出についても詳しく説明します。このシステムは非常に柔軟で適応性があり、エンベロープドコードタンパク質を持つウイルスppsを確立するために使用することができます。したがって、このウイルス粒子プラットフォームは、多くの研究研究で野生ウイルスを研究するために使用することができます。

上記の一般的な手順に応じて、2つのグループHA/NまたはVSV-G糖タンパク質または非エンベロープ糖タンパク質を組み合わせた10種類のppsを生成しました(表1を参照)。そのうち7人は感染性です。エンベロープなし糖タンパク質または唯一の港NAを収容するppsは、ここでの感染性を示さなかった。インフルエンザpp産生手順は図1に概観されている。ppsの透過電子?...

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Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

このプロトコルは、2つのインフルエンザA株からエンベロープ糖タンパク質を有する高力性ウイルス性偽型粒子(pp)を生成する実験プロセスと、その感染性を決定する方法を記述する。このプロトコルは、異なるエンベロープ糖タンパク質を持つエンベロープウイルスの他のタイプのppsを開発するために非常に適応性があります。

高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

インフルエンザウイルスPPを産生し、その感染性を決定するこの技術は、BSL-2都市におけるインフルエンザウイルスの研究を簡素化することができる。PPSのqRT-PCRデータに基づいて、感染のPPSを正規化した。2つの糖タンパク質発現プラスミドがコード化され、ウイルス再分類に関する研究を簡素化することができます。細胞の播種の翌日、逆光顕微鏡で細胞の形態と密度を確認します。理想的には、細胞はトランスフェクションで約85%コンフルエントでなければなりません。培地をウェルあたり1ミリリットルの無血清DMEMに置き換え、プレートをインキュベーターに戻します。トランスフェクションされる細胞のウェルごとに、トランスフェクション試薬の8マイクロリットルを、血清培地を減らして150マイクロリットルの体積に希釈する。溶液をやさしく混ぜ、室温で5分間座らせます。一方、プラスミドDNAの2.5マイクログラムを158マイクロリットルの減らされた血清培地に希釈する。5分間のインキュベーションの後、希釈したDNAと希釈トランスフェクション試薬を組み合わせ、溶液を軽く混合し、室温で15分間放置します。DNA脂質複合体を、無血清培地中の細胞と対応するウェルに添加する。その後、前後に揺らすことでプレートを穏やかに混ぜます。プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%を4~6時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を取り出し、1ウェルあたり2ミリリットルのDMEMに交換します。その後、さらに36〜48時間インキュベートします。各タイプの感受性細胞をウェルあたり10,000個の細胞と96ウェルプレートでシードします。その後、37°Cと5%の二酸化炭素インキュベーターで一晩プレートを残します。トランスフェクション後3日目に、ピンクやオレンジを薄くする必要がある培地の色を確認し、440〜460ナノメートルの波長の下で反転したフローレス生物顕微鏡で細胞を調べます。トランスフェクション後38~48時間で、0.45マイクロメートルのポリビニリデンフッ化膜フィルターを通過して細胞の破片を除去し、少量のアリコートに分けてマイナス80°Cで保存することで、pseuotyped型粒子またはPPSを収穫します。PPSを定量化するには、精製されたウイルス粒子の30マイクロリットルを1.5マイクロリットルのRNase-フリーチューブに移し、ベンゾナーゼヌクレアーゼを1マイクロリットル加えます。DNAおよびRNA汚染を除去するために、チューブを摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルをマイナス70°Cに凍結してヌクレアーゼを活性させ、2マイクロリットルのプロテイナーゼK.Incubateを30分間添加してエンベロープタンパク質を消化し、CMV-GFP RNAを放出します。その後、3分間摂氏100度でプロテアーゼKを非活性にします。テキスト原稿で指定されたプライマーおよびプローブでユニバーサルプローブワンステップRT-qPCRキットを使用して、定量的な逆転写RTPCRでPPSを定量化します。PPSを1ミリリットル当たり10~5回目のRNAコピーの4倍に正規化します。その後、H7N9ヘマグルチニンを収容するPPSに1ミリリットル当たり10マイクログラムの最終濃度にTPCK-トリプシンを加えます。PPSを摂氏37度で1時間インキュベートし、機能サブユニットHA1とHA2を形成します。正規化したPPSとDMEM培地を1対1の比率で混合し、感受性のある細胞を含むプレートをバイオセーフティキャビネットに持ち込みます。上清を吸引し、100マイクロリットルの予め温めたPBSで細胞を1回洗浄します。各ウェルに100マイクロリットルのPPS-DMEM混合物を加え、各タイプのPPSの感染性試験を1つの感受性細胞株に3トリクロミケートする。37°Cと5%の二酸化炭素で4〜6時間プレートをインキュベートします。その後、上清を吸引し、感染検出前にさらに24〜36時間プレートをインキュベートするDCMの100マイクロリットルに置き換えます。私たちの結果は、PPSは現在、人々に感染していると考えられています。従って必要な安全なガードのプロシージャは、マスクを着用し、バイオセーフティキャビネットで感染アッセイを行うなどの取ることを推奨します。このプロトコルは、2つのグループ化されたヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ属の胞口炎ウイルスG糖タンパク質またはエンベロープ糖タンパク質を有する10種類の擬似型粒子またはPPSを生成するために生成した。PPSを透過型電子顕微鏡で画像化し、その感染率をA549とMDCKの2つの細胞株で評価した。H5を収容するPPS群では、H5N1、H5プラスN9およびH5の感染率は、それぞれ約90%18%、細胞株A549と40%5%および5%であった。H7を収容するPPS群では、H7N9、H7プラスN1およびH7の感染率は、それぞれ約10%7%、細胞株A549、8%4%および1%であった。血液胞性口内炎ウイルスG糖タンパク質PPの感染率は、A549で約21%、MDCK細胞で16%であった。デルタエンベロープ糖タンパク質PPは感染性を示さなかった。PPプロデューサーHEK-293T/17細胞は、この手順の基礎を構成することを覚えておくことが重要です。したがって、最適な成長は私たちにHEK-293T / 17細胞を教えてくれるのが最も重要です。この手順に従うか、またはL2受容のような他の試験に従って、境界アッセイを行うことができる。このアッセイは、受容体好みの生物学的特異性をほとんど取り除き、パターンはPPSのトロピズムを明らかにすることができる。彼らはインフルエンザウイルスから糖タンパク質を取ったので、2プラスマックスにクローン化されます。HAとNAタンパク質は別々に研究することができるので、それらの間で再分類を行います。変異体および成熟した効果を探索することができる。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

低温電子断層撮影と自動化されたサブ断層アベレージングを使用して、HIVエンベロープ糖タンパク質の分子構造の決定

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

フィールドメソッド、バイオセーフティ、および交通の問題解決：FTAカードによる鳥インフルエンザのサーベイランス

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

包装HIV-またはFIVベースLentivector発現コンストラクト＆VSV-Gシュードウイルス粒子の伝達

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

バキュロウイルス発現系を用いた新規H7N9インフルエンザウイルス由来の機能組換えヘマグルチニンとノイラミニダーゼタンパク質の発現

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Tetracistronicミニゲノムを含むウイルス様粒子とバイオセーフティレベル2の条件の下ではエボラウイルスのライフサイクルのモデル化

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

リボフラビンとUVライトと血小板製品の治療：高力価の細菌汚染に対する有効

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

インフルエンザウイルスAおよびBの急速な分子の検出と分化

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

蛍光ベースのノイラミニダーゼ阻害アッセイ抗ウイルスのノイラミニダーゼ阻害剤クラスにインフルエンザウイルスの感受性を評価します

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...