Name: production of high-titer infectious influenza pseudotyped particles with envelope glycoproteins from highly pathogenic h5n1 and avian h7n9 viruses
Uploaded: 2020-01-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subvenções do Plano Provincial de Medicina e Ciência e Tecnologia da Saúde de Zhejiang (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science e Hangzhou Medical Science e Hangzhou Medical Science e Hangzhou Projeto chave de tecnologia (Grant Numbers, 2014Z11) e Hangzhou projeto municipal de aplicação autônoma de desenvolvimento social e pesquisa científica (Grant Numbers, 20191203B134).

1. Dia 1: Cultura celular e semeadura
<ol><li>Cultivar células embrionárias embrionárias humanas (HEK) 293T/17 em pratos de 60 mm com o meio essencial modificado (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 100 U/mL penicilina-estreptomicina (DMEM Complete Medium, DCM) em uma incubadora de 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO2)até cerca de 80% de confluentes. NOTA: Hek 293T/17 células de passagem baixa são recomendadas.</li>
	<li>Lave cuidadosamente as células com 5 mL de ...

<ol>
	<li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology (6th). , (2013).</li><li>White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+mechanisms+of+viral+membrane+fusion+proteins:+multiple+variations+on+a+common+theme.">Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).</li><li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-clade+protective+immune+responses+to+influenza+viruses+with+H5N1+HA+and+NA+elicited+by+an+influenza+virus-like+particle.">Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle.</a> PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+pseudotyped+influenza+viral+particles+in+neutralizing+antibody+detection.">Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection.</a> PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).</li><li>Wyatt, R., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+envelope+glycoproteins:+fusogens,+antigens,+and+immunogens.">The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens.</a> Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).</li><li>Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmembrane+domains+of+Sindbis+virus+envelope+glycoproteins+induce+cell+death.">The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death.</a> Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).</li><li>Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+Glycoproteins+Are+Delivered+to+Virus+Assembly+Sites+Through+Dynamin-Dependent+Endocytosis.">HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis.</a> Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).</li><li>Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotype+formation+between+enveloped+RNA+and+DNA+viruses.">Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses.</a> Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).</li><li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Control+of+Cellular+Susceptibility+to+Pseudotypes+of+Rous+Sarcoma+Virus.">Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus.</a> Virology. 26, 270-276 (1965).</li><li>Steffen, I., Simmons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotyping+Viral+Vectors+With+Emerging+Virus+Envelope+Proteins.">Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins.</a> Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).</li><li>Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+hepatitis+C+virus+pseudo-particles+containing+functional+E1-E2+envelope+protein+complexes.">Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.</a> Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).</li><li>Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCV+envelope+protein+function+is+dependent+on+the+peptides+preceding+the+glycoproteins.">HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).</li><li>Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+potentially+important+elements+of+the+hepatitis+B+virus+large+envelope+protein+are+dispensable+for+the+infectivity+of+hepatitis+delta+virus.">Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus.</a> Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).</li><li>Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSV-G-pseudotyped+retroviral+packaging+through+adenovirus-mediated+inducible+gene+expression.">VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).</li><li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors:+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells.">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pseudoparticles+paired+with+hemagglutinin+and+neuraminidase+from+highly+pathogenic+H5N1+influenza+and+avian+influenza+A+(H7N9)+viruses.">Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses.</a> Virus Research. 253, 20-27 (2018).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+Pseudotyped+Particles+Pairing+Hemagglutinin+of+Highly+Pathogenic+Avian+Influenza+a+H5N1+Virus+with+Neuraminidases+of+The+2009+Pandemic+H1N1+and+a+Seasonal+H3N2.">Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2.</a> Journal of Bioterrorism &amp; Biodefense. 2, 104 (2011).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neuraminidases+from+the+highly+pathogenic+avian+H5N1+and+2009+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses.">Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).</li><li>Nefkens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+pseudotyped+lentiviral+particles:+characterization+of+a+new+method+for+avian+H5N1+influenza+sero-diagnosis.">Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis.</a> Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+and+neuraminidase+matching+patterns+of+two+influenza+A+virus+strains+related+to+the+1918+and+2009+global+pandemics.">Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oseltamivir+boosts+2009+H1N1+virus+infectivity+in+vitro.">Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).</li><li>McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+M2+envelope+protein+augments+avian+influenza+hemagglutinin+pseudotyping+of+lentiviral+vectors.">Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).</li><li>Pan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+mediates+avian+influenza+H5N1+pseudotyped+particle-induced+lung+inflammation+through+NF-kappaB+and+p38+MAPK+signaling+pathways.">Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).</li><li>Szecsi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neutralising+antibodies+by+virus-like+particles+harbouring+surface+proteins+from+highly+pathogenic+H5N1+and+H7N1+influenza+viruses.">Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses.</a> Virology Journal. 3, 70 (2006).</li><li>Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+evaluation+of+an+influenza+A+(H5)+pseudotyped+lentiviral+particle-based+serological+assay.">Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay.</a> Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).</li><li>Garcia, J. M., Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+influenza+pseudotyped+lentiviral+particles+and+their+use+in+influenza+research+and+diagnosis:+an+update.">Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).</li><li>Haynes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza-pseudotyped+Gag+virus-like+particle+vaccines+provide+broad+protection+against+highly+pathogenic+avian+influenza+challenge.">Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge.</a> Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).</li><li>Schmeisser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+mammalian+virus-like+particles+from+modified+vaccinia+virus+Ankara+vectors+expressing+influenza+H5N1+hemagglutinin+and+neuraminidase.">Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase.</a> Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+(SARS-CoV)+S+glycoprotein+and+influenza+matrix+1+efficiently+form+virus-like+particles+(VLPs)+that+protect+mice+against+challenge+with+SARS-CoV.">Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV.</a> Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).</li><li>Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Lyssavirus-Neutralizing+Antibodies+Using+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotype+Particles.">Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles.</a> Viruses. 8 (9), 254 (2016).</li><li>Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV+Fusion+Peptide+Forms+an+Extended+Bipartite+Fusion+Platform+that+Perturbs+Membrane+Order+in+a+Calcium-Dependent+Manner.">The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).</li><li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus+infection+is+inhibited+by+griffithsin.">Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin.</a> Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).</li><li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Pseudotyped+Particles+to+Study+Highly+Pathogenic+Coronaviruses+in+a+Biosafety+Level+2+Setting.">Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+leukemia+virus+pseudotypes+of+La+Crosse+and+Hantaan+Bunyaviruses:+a+system+for+analysis+of+cell+tropism.">Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism.</a> Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).</li><li>Wool-Lewis, R. J., Bates, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebola+virus+entry+by+using+pseudotyped+viruses:+identification+of+receptor-deficient+cell+lines.">Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines.</a> Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).</li><li>Chen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+design+of+more+effective+avian+replication-incompetent+retroviral+vectors.">Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors.</a> Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).</li><li>Kaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+generation+of+pseudotype-based+serum+neutralization+assay+for+Nipah+virus+antibodies:+sensitive+and+high-throughput+analysis+utilizing+secreted+alkaline+phosphatase.">Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase.</a> Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).</li><li>Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+modeling+of+influenza+A+virus+replication+in+cell+cultures+predicts+infection+dynamics+for+highly+different+infection+conditions.">Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions.</a> PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).</li><li>Petiot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+viruses+production:+Evaluation+of+a+novel+avian+cell+line+DuckCelt(R)-T17.">Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17.</a> Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).</li></ol>

Neste protocolo, descrevemos um método para produzir partículas pseudodigitadas pelo vírus influenza (pp) em uma configuração BSL-2. O repórter plasmid pcDNA-GFP é incorporado aos pps e pode ser usado para quantificar pps pela FACS em um ensaio de infectividade. Escolhemos dois tipos de linhas celulares suscetíveis porque elas são amplamente utilizadas na pesquisa da gripe. As células MDCK forneceriam um bom controle para as células humanas imortalizadas variáveis usadas nesses estudos.
<p class="jove_con...

A missão de uma partícula viral é transportar seu genoma de uma célula hospedeira infectada para uma célula hospedeira não infectada e entregá-la ao citoplasma ou ao núcleo em umaforma1 competente para replicação. Este processo é inicialmente desencadeado pela ligação aos receptores celulares hospedeiros, seguido pela fusão de virion e membranas celulares. Para vírus envolvidos, como os vírus da gripe, as glicoproteínas de pico são responsáveis pela ligação do receptor e fusão1,2. Glicoproteínas envelope viral (por exemplo, pirogênios, antígenos), estão envolvidos em muitas propriedades e eventos importantes, tais como iniciação do ciclo de vida do vírus (ligação e fusão), patogênese viral, imunogenicidade, apoptose celular hospedeira e tropismo celular, a via endocítica celular, bem como a transmissão e reassortmentinterespécies 1,3,4,5,6,7. Pesquisa sobre glicoproteínas envelope viral nos ajudará a entender muitos aspectos do processo de infecção viral. Partículas virais pseudodigitadas (pp), também denominadas pseudovirions ou pseudopartículas, podem ser geradas através de uma técnica de pseudotipagem8,9,10. Esta tecnologia tem sido utilizada para desenvolver partículas pseudodigitadas de muitos vírus, incluindo hepatite C11,12,hepatite B13,vírus da estomatite vesicular (VSV)14,15,e vírus da gripe16,17,18,19. Esta tecnologia é baseada na proteína Gag-Pol de lentivírus ou outros retrovírus.
Partículas virais pseudodigitadas podem ser obtidas usando um sistema de três plasmídeos cotransfecting um plasmid de expressão de glicoproteína envelope viral, uma embalagem retroviral plasmid faltando o gene env envelope, e um plasmid repórter separado em células produtores pp. O retrovírus é montado por sua proteína Gag, e buds de uma membrana celular infectada que expressa o vírus envelope proteína1. Portanto, é possível obter pps de gripe de alto titer usando a proteína gag retrovírus para produzir botões em uma membrana celular expressando influenza HA e NA. Em nossos estudos anteriores, has/nas em todas as combinações foram funcionais e capazes de executar suas funções correspondentes no ciclo de vida viral16,17,18,20,21. Estes pps são usados para investigar características biológicas da gripe, incluindo a hemaglutinação, a atividade da neuraminidase, o tropismo obrigatório do HA-receptor, e a infectividade. Como ha e NA são proteínas funcionais de superfície importantes no ciclo de vida viral, HAs e NAs incompatíveis derivados de diferentes cepas de gripe podem demonstrar parcialmente a ressortição entre eles. Aqui, geramos oito tipos de influenza pps, combinando dois HAs e dois NAs (derivados da cepa HPAI H5N1 e da mancha H7N9), usando um sistema de pseudotipagem de três plasmídeos. Estes oito tipos de pps incluem dois pps nativos, H5N1pp, H7N9pp; dois pps incompatíveis, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; e quatro pps que abrigam apenas uma única glicoproteína (HA ou NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Estudos sobre o vírus influenza, como H5N1 e H7N9, são limitados por requisitos de biossegurança. Todos os estudos das cepas do vírus da gripe selvagem devem ser realizados em um laboratório de nível 3 de biossegurança (BSL-3). A tecnologia de partículas virais pseudodigitadas pode ser usada para empacotar um virion artificial em um ambiente de nível 2 de biossegurança (BSL-2). Portanto, pps representam uma ferramenta mais segura e útil para estudar os processos do vírus da gripe, dependendo de suas duas principais glicoproteínas: hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA).
Este protocolo descreve a geração desses pps com uma estratégia de cotransfecção de três plasmid (vista geral na Figura 1),como quantificar pps e detecção de infectividade. A produção pp envolve três tipos de plasmídeos (Figura 1). O gene gag-pol, que codifica a proteína Gag-Pol retrovírus, foi clonado de um kit de embalagem retrovírus e inserido no plasmídeo pcDNA 3.1 e chamado pcDNA-Gag-Pol. O gene de proteína fluorescente verde melhorada (eGFP), que codifica a Proteína Fluorescente Verde, foi clonado do vetor pTRE-EGFP, inserido no plasmídeo pcDNA 3.1 e chamado pcDNA-GFP. Durante a clonagem, uma seqüência de sinal de embalagem () foi adicionada através de uma cartilha. Os genes HA e NA foram clonados em um plasmid pVRC, chamado pVRC-HA e pVRC-NA, respectivamente. O último plasmídeo codifica a proteína de fusão e pode ser substituído por qualquer outra proteína de fusão de interesse. Nossa plataforma de pseudotipagem inclui dois plasmídeos de expressão glicoproteína: pVRC-HA e pVRC-NA. Isso pode simplificar a pesquisa sobre a revariedadeção entre diferentes cepas de vírus em uma configuração BSL-2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70664</td>
			<td>Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic 
			Individual alphanumeric codes for well identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Individual alphanumerical codes for well identification 
			Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma irradiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Excell</td>
			<td>FND500</td>
			<td>fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>cytoflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alveolar adenocarcinoma A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent biological microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51-32P01-FLB3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31-12PHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3006L</td>
			<td>Will withstand up to 14,000 RCF 
			RNase-/DNase-free Nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td>an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td>The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Maximum RCF is 12,500 xg 
			Temperature range from -80 &#176;C to 120 &#176;C 
			RNase-/DNase-free 
			Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP Centrifuge Tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td>a stable and highly reactive serine protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST532</td>
			<td>Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated Culture Dish (60mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td>Trypsin from bovine pancreas 
			TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, &#8805;10,000 BAEE units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK-trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td>This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-titer infectious influenza pseudotyped particles with envelope glycoproteins from highly pathogenic h5n1 and avian h7n9 viruses

A transmissão direta ocasional do vírus altamente patogênico da gripe aviária A H5N1 (HPAI H5N1) e H7N9 aos seres humanos e sua letalidade são graves problemas de saúde pública e sugerem a possibilidade de uma epidemia. No entanto, nossa compreensão molecular do vírus é rudimentar, e é necessário estudar as propriedades biológicas de suas proteínas envelope como alvos terapêuticos e desenvolver estratégias para controlar a infecção. Desenvolvemos uma plataforma de partículas pseudodigitadas virais sólidas (pp) para estudar o vírus da gripe aviária, incluindo a análise funcional de sua hemaglutinina (HA) e glicoproteínas envelope de neuraminidase (NA), as características de ressortamento dos HAs e NAs, receptores, troposmas, anticorpos neutralizantes, diagnóstico, infectividade, para fins de desenvolvimento de medicamentos e projeto de vacinas. Aqui, descrevemos um procedimento experimental para estabelecer pps com o envelope glicoproteínas (HA, NA) a partir de duas cepas de gripe A (HAPI H5N1 e 2013 aviário H7N9). Sua geração é baseada na capacidade de alguns vírus, como o vírus da leucemia murina (MLV), para incorporar glicoproteínas envelope em um pp. Além disso, também detalhamos como esses pps são quantificados com RT-qPCR, e a detecção de infectividade de pps vírus nativos e incompatíveis, dependendo da origem dos HAs e NAs. Este sistema é altamente flexível e adaptável e pode ser usado para estabelecer pps virais com glicoproteínas envelope que podem ser incorporados em qualquer outro tipo de vírus envolto. Assim, esta plataforma de partículas virais pode ser usada para estudar vírus selvagens em muitas investigações de pesquisa.

Dependendo do procedimento geral descrito acima, geramos 10 tipos de pps combinando dois has/nas de grupo ou glicoproteína VSV-G ou glicoproteínas sem envelope (mostrados na Tabela 1). Sete deles são infecciosos. Os pps que abrigam glicoproteína sem envelope ou apenas porto NA não mostrou qualquer infectividade aqui. O procedimento de produção de influenza pp é visto de forma geral na Figura 1. Micrografias eletrônicas de transmissão de pps (por exemplo, H5N1pp) s?...

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Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

Este protocolo descreve um processo experimental para produzir partículas pseudodigitadas virais infecciosas de alto titer (pp) com glicoproteínas envelope de duas cepas de gripe A e como determinar sua infectividade. Este protocolo é altamente adaptável para desenvolver pps de qualquer outro tipo de vírus envolvidos com glicoproteínas envelope diferentes.

Produção de partículas pseudodigitadas de gripe infecciosa de alto titer com glicoproteínas envelope de vírus H5N1 e H7N9 altamente patogênicos

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Essa técnica de produção de influenza viral PP e determinação de sua infectividade pode simplificar a pesquisa do vírus da gripe em uma cidade BSL-2. Normalizamos o PPS para as infecções com base em dados qRT-PCR do PPS. Duas expressãos de glicoproteína plasmídeos são codificados, o que pode simplificar a pesquisa sobre a reassortação do vírus.Um dia após a semeadura celular, verifique a morfologia celular e a densidade sob um microscópio de luz invertida. O ideal é que a célula seja aproximadamente 85% confluente na transfecção. Substitua o meio por um mililitro de DMEM sem soro por poço, e coloque a placa de volta na incubadora.Para cada poço de células a serem transfeccionadas, diluir oito microliters do reagente de transfecção a um volume de 150 microliters com meio soro reduzido. Misture a solução suavemente e deixe-a sentada à temperatura ambiente por cinco minutos. Enquanto isso, diluem 2,5 microgramas de DNA plasmídeo em 158 microliters de meio soro reduzido.Após a incubação de cinco minutos, combine o DNA diluído com reagente de transfecção diluído, misture suavemente a solução e deixe-a em temperatura ambiente por 15 minutos. Adicione o complexo lipídedo de DNA aos poços correspondentes com as células em meio livre de soro. Em seguida, misture a placa suavemente balançando para frente e para trás.Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro a seis horas. Após a incubação, remova o meio e substitua-o por dois mililitros de DMEM por poço. Em seguida, incuba-lo por mais 36 a 48 horas.Semente cada tipo de célula suscetível a 10.000 células por poço e uma placa de 96 poços. Em seguida, deixe a placa durante a noite em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No terceiro dia após a transfecção, verifique a cor do meio que deve iluminar rosa ou ligeiramente laranja e examine as células com um microscópio biológico florescente invertido sob 440 a 460 nanômetros de comprimento de onda.Em 38 a 48 horas após a transfecção, colde as partículas de pseuotipadas ou PPS passando-as através de um filtro de membrana de fluoreto de polivinida de 0,45 micrômetro para eliminar detritos celulares, em seguida, divida-as em alíquotas de pequeno volume e armazene-as a menos 80 graus Celsius. Para quantificar o PPS, transfira 30 microlitadores das partículas virais purificadas para um tubo 1,5 microliter RNase sem dna e adicione um microliter de Benzonase Nuclease. Incubar o tubo a 37 graus Celsius por uma hora para eliminar qualquer contaminação de DNA e RNA.Após a incubação, congele a amostra a menos 70 graus Celsius para ativo a nuclease e adicione dois microliters de Proteinase K.Incubar a mistura por 30 minutos para digerir as proteínas do envelope e liberar o RNA CMV-GFP. Em seguida, inativo o Proteinase K a 100 graus Celsius por três minutos. Quantifique o PPS com transcrição reversa quantitativa RTPCR usando o Kit RT-qPCR Universal Probe One-Step nos primers e sondas especificados no manuscrito do texto.Normalize o PPS para quatro vezes 10 a quinto RNA cópias por mililitro. Em seguida, adicione tpck-trypsin a uma concentração final de 10 microgramas por mililitro no PPS que abriga hemaglutina H7N9. Incubar o PPS a 37 graus Celsius durante uma hora para formar as subunidades funcionais HA1 e HA2.Misture o PPS normalizado com o meio DMEM em uma proporção de um para um, em seguida, leve a placa contendo células suscetíveis ao armário de biossegurança. Aspire o supernascer e lave as células uma vez com 100 microliters de PBS pré-aquecido. Adicione 100 microliters de mistura PPS-DMEM em cada poço, triplicando os testes de infectividade de cada tipo de PPS a uma linha celular suscetível.Incubar a placa por quatro a seis horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, aspire o supernascer e substitua-o por 100 microliters de DCM Incubar a placa por mais 24 a 36 horas antes da detecção de infectividade. Nossos resultados são pps são considerados agora infecciosos para as pessoas.Assim, os procedimentos necessários de guarda segura são recomendados para tomar, como usar uma máscara e realizar os ensaios de infectividade em um armário de biossegurança. Este protocolo foi gerado para gerar 10 tipos de partículas pseudotipadas ou PPS com duas hemaglutinina agrupadas e estomatite vesicular de neuraminidase vírus G glicoproteína ou sem glicoproteínas envelope. O PPS foi imageado com microscopia eletrônica de transmissão e sua infectividade foi avaliada em duas linhas celulares, A549 e MDCK.No grupo PPS que abriga h5, a infectividade de H5N1, H5 mais N9 e H5 foi de aproximadamente 90%18% e 10% para a linha celular A549 e 40%5% e 5% para MDCK, respectivamente. No grupo PPS que abriga h7, a infectividade de H7N9, H7 mais N1 e H7 foi de aproximadamente 10%7% e 1% para a linha celular A549 e 8%4% e 1% para MDCK, respectivamente. A infectividade do vírus da estomatite vesicular G glicoproteína PP foi de cerca de 21% para células A549 e 16% para MDCK.Enquanto o envelope delta glicoproteins PP não mostrou infectividade. É fundamental lembrar que as células HEK-293T/17 do produtor de PP constituem a base deste procedimento. Assim, o crescimento ideal nos ensina células HEK-293T/17 é o mais importante.Após este procedimento ou algum outro teste, como o recept L2, o ensaio delimitante pode ser realizado. Este ensaio pode quase livrar-se das peculiaridades biológicas da preferência do receptor e o padrão revelará o tropismo do PPS. Desde que tomaram as glicoproteínas do vírus da gripe são clonadas em duas mais máximas.As proteínas HA e NA podem ser estudadas separadamente, por isso nos reassortamos entre elas. Os mutantes e os efeitos maduros podem ser explorados.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Determinação de estruturas moleculares de glicoproteínas do envelope HIV usando Cryo-Electron Tomografia e Média Sub-tomogram Automated

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imunologia e Infecção

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Vigilância da gripe aviária com FTA Cards: Métodos de campo, de Biossegurança, e questões de transporte Resolvido

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Embalagem HIV-FIV ou à base de construções de expressão e Lentivector Transdução de Partículas Pseudotyped VSV-G virais

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Expressão da Funcionais recombinante hemaglutinina ea neuraminidase Proteínas do vírus Influenza H7N9 Novel usando a expressão Sistema de Baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Modelando o ciclo de vida do vírus Ebola Sob Nível de Biossegurança 2 condições com partículas semelhantes a vírus contendo Tetracistronic minigenomas

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Tratamento de produtos de plaquetas com riboflavina e luz UV: Eficácia Contra alta Titer contaminação bacteriana

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Rápida Detecção Molecular e diferenciação de Influenza vírus A e B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...