Name: production of high-titer infectious influenza pseudotyped particles with envelope glycoproteins from highly pathogenic h5n1 and avian h7n9 viruses
Uploaded: 2020-01-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами от провинции Чжэцзян медицины и здравоохранения науки и техники плана (Грант Номера, 2017KY538), Ханчжоу муниципальной медицины и здравоохранения науки и техники плана (Грант Номера, OO20190070), Ханчжоу медицинской науки и Проект "Технологический ключевой проект" (Grant Numbers, 2014-11) и муниципальный проект автономного применения в Ханчжоу социального развития и научных исследований (Grant Numbers, 20191203B134).

1. День 1: Культура клеток и посев
<ol><li>Культивировать эмбриональные почки человека (HEK) 293T/17 клеток в 60 мм блюда с dulbecco модифицированных основных средств (DMEM) дополнен 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS) и 100 U/mL пенициллин-стрептомицин (DMEM Полный средний, DCM) в 37 градусах Цельсия, 5...

<ol>
	<li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology (6th). , (2013).</li><li>White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+mechanisms+of+viral+membrane+fusion+proteins:+multiple+variations+on+a+common+theme.">Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).</li><li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-clade+protective+immune+responses+to+influenza+viruses+with+H5N1+HA+and+NA+elicited+by+an+influenza+virus-like+particle.">Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle.</a> PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+pseudotyped+influenza+viral+particles+in+neutralizing+antibody+detection.">Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection.</a> PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).</li><li>Wyatt, R., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+envelope+glycoproteins:+fusogens,+antigens,+and+immunogens.">The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens.</a> Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).</li><li>Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmembrane+domains+of+Sindbis+virus+envelope+glycoproteins+induce+cell+death.">The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death.</a> Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).</li><li>Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+Glycoproteins+Are+Delivered+to+Virus+Assembly+Sites+Through+Dynamin-Dependent+Endocytosis.">HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis.</a> Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).</li><li>Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotype+formation+between+enveloped+RNA+and+DNA+viruses.">Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses.</a> Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).</li><li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Control+of+Cellular+Susceptibility+to+Pseudotypes+of+Rous+Sarcoma+Virus.">Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus.</a> Virology. 26, 270-276 (1965).</li><li>Steffen, I., Simmons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotyping+Viral+Vectors+With+Emerging+Virus+Envelope+Proteins.">Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins.</a> Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).</li><li>Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+hepatitis+C+virus+pseudo-particles+containing+functional+E1-E2+envelope+protein+complexes.">Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.</a> Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).</li><li>Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCV+envelope+protein+function+is+dependent+on+the+peptides+preceding+the+glycoproteins.">HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).</li><li>Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+potentially+important+elements+of+the+hepatitis+B+virus+large+envelope+protein+are+dispensable+for+the+infectivity+of+hepatitis+delta+virus.">Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus.</a> Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).</li><li>Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSV-G-pseudotyped+retroviral+packaging+through+adenovirus-mediated+inducible+gene+expression.">VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).</li><li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors:+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells.">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pseudoparticles+paired+with+hemagglutinin+and+neuraminidase+from+highly+pathogenic+H5N1+influenza+and+avian+influenza+A+(H7N9)+viruses.">Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses.</a> Virus Research. 253, 20-27 (2018).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+Pseudotyped+Particles+Pairing+Hemagglutinin+of+Highly+Pathogenic+Avian+Influenza+a+H5N1+Virus+with+Neuraminidases+of+The+2009+Pandemic+H1N1+and+a+Seasonal+H3N2.">Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2.</a> Journal of Bioterrorism &amp; Biodefense. 2, 104 (2011).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neuraminidases+from+the+highly+pathogenic+avian+H5N1+and+2009+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses.">Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).</li><li>Nefkens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+pseudotyped+lentiviral+particles:+characterization+of+a+new+method+for+avian+H5N1+influenza+sero-diagnosis.">Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis.</a> Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+and+neuraminidase+matching+patterns+of+two+influenza+A+virus+strains+related+to+the+1918+and+2009+global+pandemics.">Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oseltamivir+boosts+2009+H1N1+virus+infectivity+in+vitro.">Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).</li><li>McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+M2+envelope+protein+augments+avian+influenza+hemagglutinin+pseudotyping+of+lentiviral+vectors.">Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).</li><li>Pan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+mediates+avian+influenza+H5N1+pseudotyped+particle-induced+lung+inflammation+through+NF-kappaB+and+p38+MAPK+signaling+pathways.">Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).</li><li>Szecsi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neutralising+antibodies+by+virus-like+particles+harbouring+surface+proteins+from+highly+pathogenic+H5N1+and+H7N1+influenza+viruses.">Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses.</a> Virology Journal. 3, 70 (2006).</li><li>Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+evaluation+of+an+influenza+A+(H5)+pseudotyped+lentiviral+particle-based+serological+assay.">Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay.</a> Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).</li><li>Garcia, J. M., Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+influenza+pseudotyped+lentiviral+particles+and+their+use+in+influenza+research+and+diagnosis:+an+update.">Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).</li><li>Haynes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza-pseudotyped+Gag+virus-like+particle+vaccines+provide+broad+protection+against+highly+pathogenic+avian+influenza+challenge.">Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge.</a> Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).</li><li>Schmeisser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+mammalian+virus-like+particles+from+modified+vaccinia+virus+Ankara+vectors+expressing+influenza+H5N1+hemagglutinin+and+neuraminidase.">Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase.</a> Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+(SARS-CoV)+S+glycoprotein+and+influenza+matrix+1+efficiently+form+virus-like+particles+(VLPs)+that+protect+mice+against+challenge+with+SARS-CoV.">Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV.</a> Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).</li><li>Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Lyssavirus-Neutralizing+Antibodies+Using+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotype+Particles.">Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles.</a> Viruses. 8 (9), 254 (2016).</li><li>Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV+Fusion+Peptide+Forms+an+Extended+Bipartite+Fusion+Platform+that+Perturbs+Membrane+Order+in+a+Calcium-Dependent+Manner.">The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).</li><li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus+infection+is+inhibited+by+griffithsin.">Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin.</a> Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).</li><li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Pseudotyped+Particles+to+Study+Highly+Pathogenic+Coronaviruses+in+a+Biosafety+Level+2+Setting.">Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+leukemia+virus+pseudotypes+of+La+Crosse+and+Hantaan+Bunyaviruses:+a+system+for+analysis+of+cell+tropism.">Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism.</a> Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).</li><li>Wool-Lewis, R. J., Bates, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebola+virus+entry+by+using+pseudotyped+viruses:+identification+of+receptor-deficient+cell+lines.">Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines.</a> Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).</li><li>Chen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+design+of+more+effective+avian+replication-incompetent+retroviral+vectors.">Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors.</a> Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).</li><li>Kaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+generation+of+pseudotype-based+serum+neutralization+assay+for+Nipah+virus+antibodies:+sensitive+and+high-throughput+analysis+utilizing+secreted+alkaline+phosphatase.">Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase.</a> Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).</li><li>Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+modeling+of+influenza+A+virus+replication+in+cell+cultures+predicts+infection+dynamics+for+highly+different+infection+conditions.">Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions.</a> PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).</li><li>Petiot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+viruses+production:+Evaluation+of+a+novel+avian+cell+line+DuckCelt(R)-T17.">Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17.</a> Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).</li></ol>

В этом протоколе мы описываем метод производства псевдотипированных частиц вируса гриппа (pp) в условиях BSL-2. Репортер плазмид pcDNA-GFP включен в pps и может быть использован для количественной оценки pps FACS в анализе инфекции. Мы выбрали два типа восприимчивых клеточных линий, потому что они ш...

Миссия вирусной частицы состоит в том, чтобы транспортировать ее геном из инфицированной клетки-хозяина в неинфицированную клетку-хозяина и доставить ее в цитоплазму или ядро в рецифицируемой форме1. Этот процесс первоначально вызван связыванием с рецепторами клеток-хозяев, а затем слиянием вирионных и клеточных мембран. Для окутанных вирусов, таких как вирусы гриппа, шип гликопротеинов отвечают за связывание рецепторов и слияние1,2. Вирусные гликопротеины конверта (например, пирогенны, антигены), участвуют во многих важных свойствах и событиях, таких как инициирование жизненного цикла вируса (связывание и слияние), вирусный патогенез, иммуногенность, апоптоз клеток-хозяев и клеточный тропизм, клеточный эндоцитарный путь, а также межвидовая передача и реассортициция1,3,4,5,6. Исследования вирусных гликопротеинов конверт поможет нам понять многие аспекты процесса вирусной инфекции. Псевдотипированные вирусные частицы (pp), также называемые псевдовирии или псевдочастицы, могут быть получены с помощью псевдотипирования техники8,9,10. Эта технология была использована для разработки псевдотипированных частиц многих вирусов, в том числе гепатита С11,12, гепатита В13,везикулярный стоматит вирус (VSV)14,15, и вирус гриппа16,17,18,19. Эта технология основана на протеине Gag-Pol лентивирусов или других ретровирусов.
Псевдотипированные вирусные частицы могут быть получены с помощью трех плазмидной системы путем котрансфектации вирусного конверта гликопротеина экспрессии плазмида, ретровирусной упаковки плазмид отсутствует конверт env гена, и отдельный репортер плазмид в pp клеток производителя. Ретровирус собран его протеином Gag, и он бутоны от зараженной мембраны клетки который выражает протеин конверта вируса1. Таким образом, можно получить высокий титр гриппа pps с помощью ретровирусного белка Gag для производства почек на клеточной мембране, выражающей гриппHA и NA. В наших предыдущих исследованиях, HAs / NAs во всех комбинациях были функциональными и в состоянии выполнять свои соответствующие функции в вирусном жизненном цикле16,17,18,20,21. Эти pps использованы для того чтобы исследовать характеристики гриппа биологически, включая hemagglutination, деятельность neuraminidase, tropism связывания HA-рецептора, и infectivity. Поскольку HA и NA являются важными поверхностными функциональными белками в вирусном жизненном цикле, несоответствие HAs и NAs, полученных из различных штаммов гриппа, может частично продемонстрировать реассортивность между ними. Здесь мы создаем восемь типов гриппа pps, объединяя два HAs и два NAs (производные от штамма HPAI H5N1 и h7N9 пятно), используя три плазмидной псевдотипирования системы. Эти восемь типов pps включают в себя два родного pps, H5N1pp, H7N9pp; два несовпадающих pps, (H5'N9)pp, (H7'N1)pp; и четыре pps только укрывательство одного гликопротеина (HA или NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Исследования вируса гриппа, такие как H5N1 и H7N9, ограничены требованиями биобезопасности. Все исследования штаммов вируса дикого гриппа должны проводиться в лаборатории биобезопасности 3 (BSL-3). Псевдотипированная технология вирусных частиц может быть использована для упаковки искусственного вириона в условиях биобезопасности 2 (BSL-2). Таким образом, pps представляют собой более безопасный и полезный инструмент для изучения процессов вируса гриппа в зависимости от двух основных гликопротеинов: гемагглютинина (HA) и нейраминидаза (NA).
Этот протокол описывает генерацию этих pps с трехплазмидной стратегией котрансфекции (см. рисунок 1),как количественно pps, и обнаружение инфекции. PP производства включает в себя три вида плазмидов(Рисунок 1). Ген кляп-пол, который кодирует ретровирусный белок Gag-Pol, был клонирован из комплекта упаковки ретровирусов и вставлен в плазмид pcDNA 3.1 и назван pcDNA-Gag-Pol. Улучшенный зеленый флуоресцентный белок (eGFP) ген, который кодирует зеленый флуоресцентный белок, был клонирован из вектора pTRE-EGFP, вставлен в плазмид pcDNA 3.1 и называется pcDNA-GFP. Во время клонирования последовательность упаковочного сигнала (яп. ) была добавлена через грунтовку. Гены HA и NA были клонированы в плазмид pVRC, названный pVRC-HA и pVRC-NA, соответственно. Последний плазмид кодирует белок синтеза и может быть заменен любым другим интересуемым белком синтеза. Наша псевдотипивная платформа включает в себя два гликопротеина экспрессии плазмиды: pVRC-HA и pVRC-NA. Это может упростить исследования по реассортиции между различными штаммами вируса в условиях BSL-2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70664</td>
			<td>Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic 
			Individual alphanumeric codes for well identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Individual alphanumerical codes for well identification 
			Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma irradiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Excell</td>
			<td>FND500</td>
			<td>fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>cytoflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alveolar adenocarcinoma A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent biological microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51-32P01-FLB3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31-12PHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3006L</td>
			<td>Will withstand up to 14,000 RCF 
			RNase-/DNase-free Nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td>an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td>The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Maximum RCF is 12,500 xg 
			Temperature range from -80 &#176;C to 120 &#176;C 
			RNase-/DNase-free 
			Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP Centrifuge Tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td>a stable and highly reactive serine protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST532</td>
			<td>Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated Culture Dish (60mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td>Trypsin from bovine pancreas 
			TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, &#8805;10,000 BAEE units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK-trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td>This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-titer infectious influenza pseudotyped particles with envelope glycoproteins from highly pathogenic h5n1 and avian h7n9 viruses

Случайная прямая передача высокопатогенного вируса птичьего гриппа А H5N1 (HPAI H5N1) и H7N9 людям и их летальности являются серьезными проблемами общественного здравоохранения и указывают на возможность эпидемии. Тем не менее, наше молекулярное понимание вируса является рудиментарным, и необходимо изучить биологические свойства его оболочки белков в качестве терапевтических целей и разработать стратегии по борьбе с инфекцией. Мы разработали твердую вирусную псевдотипированную частицу (pp) платформу для изучения вируса птичьего гриппа, включая функциональный анализ его гемагглютинина (HA) и нейраминидаза (NA) конвертгликопротеинов, реассортировызные характеристики HAs и NAs, рецепторы, тропизмы, нейтрализация антител, диагностика, инфекционность, для целей разработки лекарств и разработки вакцин. Здесь мы описываем экспериментальную процедуру по установлению pps с оболочкой гликопротеинов (HA, NA) из двух штаммов гриппа А (HAPI H5N1 и 2013 птичьи H7N9). Их генерация основана на способности некоторых вирусов, таких как вирус мурин лейкемии (MLV), включать конверт гликопротеинов в pp. Кроме того, мы также подробно, как эти pps количественно с RT-qPCR, и инфекционность обнаружения родной и несовместимые вирусpps в зависимости от происхождения HAs и NAs. Эта система является очень гибкой и адаптируемой и может быть использована для создания вирусных pps с конвертом гликопротеинов, которые могут быть включены в любой другой тип окутанного вирусом. Таким образом, эта платформа вирусных частиц может быть использована для изучения диких вирусов во многих исследованиях.

В зависимости от общей процедуры, описанной выше, мы создали 10 типов pps, сочетающих две группы HAs/NAs или ГЛИкопротеин VSV-G или гликопротеины без конверта (показано в таблице 1). Семь из них заразны. PPS, которые гавани не-конверт гликопротеин или только гавань NA не показали какой-либо ?...

Watch this Scientific Journal Video about Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses at JoVE.com

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

Этот протокол описывает экспериментальный процесс по производству высокотитра инфекционных вирусных псевдотипированных частиц (pp) с оболочкой гликопротеинов из двух штаммов гриппа А и как определить их инфекционность. Этот протокол очень адаптируется к разработке pps любого другого типа окутанных вирусов с различными гликопротеины оболочки.

Производство высокотитерных инфекционных частиц гриппа Псевдотипированные с конвертами гликопротеинов из высокопатогенных вирусов H5N1 и Avian H7N9

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Этот метод производства вирусной ПП гриппа и определения его инфекционности может упростить исследование вируса гриппа в городе BSL-2. Мы нормализовали PPS для инфекций на основе данных qRT-PCR PPS. Кодируются два плазмида экспрессии гликопротеина, что может упростить исследование по повторному распространению вируса.На следующий день после посева клеток проверьте морфологию клеток и плотность под перевернутым световым микроскопом. В идеале клетка должна быть примерно на 85% стечена при трансфекции. Замените носитель на один миллилитр без сыворотки DMEM на колодец и положите тарелку обратно в инкубатор.Для каждой колодец клеток, которые будут трансфицированы, разбавить восемь микролитров трансфекции реагента в объеме 150 микролитров с пониженной среде сыворотки. Смешайте раствор осторожно и дайте ему сидеть при комнатной температуре в течение пяти минут. Между тем, разбавить 2,5 микрограмма плазмидной ДНК в 158 микролитров уменьшенной среды сыворотки.После пятиминутной инкубации смешайте разбавленную ДНК с разбавленным трансфектным реагентом, аккуратно перемешайте раствор и оставьте его при комнатной температуре на 15 минут. Добавьте липидный комплекс ДНК в соответствующие скважины с клетками в среде, свободной от сыворотки. Затем аккуратно перемешайте тарелку, качаясь взад и вперед.Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе в течение четырех-шести часов. После инкубации удалите среду и замените ее двумя миллилитров DMEM на колодец. Затем инкубировать его в течение еще 36 до 48 часов.Семя каждого типа восприимчивых клеток на 10000 клеток на колодец и 96 хорошо пластины. Затем оставьте пластину на ночь в 37 градусов по Цельсию и пять процентов углекислого газа инкубатора. На третий день после трансфекции проверьте цвет среды, которая должна быть светло-розовой или слегка оранжевой, и изучите клетки с перевернутым флуоресцентным биологическим микроскопом под длиной волны от 440 до 460 нанометров.На 38 до 48 часов после пост-трансфекции, урожай pseuotyped частиц или PPS, проехав их через 0,45 микрометра поливинидин фторид мембраны фильтр для устранения клеточного мусора, а затем разделить их на небольшой объем aliquots и хранить их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для количественной оценки PPS перенесите 30 микролитров очищенных вирусных частиц в 1,5 микролитера RNase-бесплатную трубку и добавьте один микролитер бензоразы Nuclease. Инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, чтобы устранить любое загрязнение ДНК и РНК.После инкубации заморозить образец до минус 70 градусов по Цельсию, чтобы активировать нуклеазу и добавить два микролитров протеиназы K.Incubate смесь в течение 30 минут, чтобы переварить белки конверта и освободить CMV-GFP РНК. Затем неактивный Proteinase K при 100 градусах по Цельсию в течение трех минут. Количественная оценка PPS с количественной обратной транскрипцией RTPCR с использованием универсального зонда One-Step RT-qPCR Kit в праймерах и зондах, указанных в рукописи текста.Нормализация PPS в четыре раза от 10 до пятой РНК копий на миллилитр. Затем добавьте TPCK-трипсин к окончательной концентрации 10 микрограмм на миллилитр в PPS, который гавани H7N9 гемагглютинин. Инкубировать PPS при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, чтобы сформировать функциональные подразделения HA1 и HA2.Смешайте нормализованную PPS со средой DMEM при соотношении один к одному, а затем принесите пластину, содержащую восприимчивые клетки, в шкаф биобезопасности. Аспирировать супернатант и мыть клетки один раз с 100 микролитров предварительно разогретых PBS. Добавьте 100 микролитров смеси PPS-DMEM в каждую колодец, в трижды урезав тесты инфекционности каждого типа PPS на одну восприимчивую линию клеток.Инкубировать пластину в течение четырех-шести часов при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе. Затем аспирировать супернатант и заменить его 100 микролитров DCM инкубировать пластину еще за 24 до 36 часов до обнаружения инфекционности. Наши результаты PPS считаются в настоящее время инфекционными для людей.Поэтому необходимые безопасные процедуры охраны рекомендуется принимать, такие как ношение маски и выполнение анализа инфекционности в кабинете биобезопасности. Этот протокол был создан для создания 10 типов псевдотипизированных частиц или PPS с двумя сгруппированными гемаглютинин и neuraminidase везикулярный стоматит вирус G гликопротеин или нет конверт гликопротеинов. PPS были изображены с помощью электронной микроскопии передачи, и их инфекционность была оценена в двух клеточных линиях, A549 и MDCK.В группе PPS, укрывя H5, инфекционность H5N1, H5 плюс N9 и H5 составила примерно 90%18% и 10% для клеточной линии A549 и 40%5% и 5% для MDCK, соответственно. В группе PPS, укрывя H7, инфекционность H7N9, H7 плюс N1 и H7 составила примерно 10%7% и 1% для клеточной линии A549 и 8%4% и 1% для MDCK, соответственно. Инфекционность вируса везикулярного стоматита G гликопротеина PP составила около 21% для A549 и 16% для клеток MDCK.В то время как дельта конверт гликопротеинов PP показал никакой инфекционности. Важно помнить, что ПП производитель HEK-293T/17 клетки составляют основу этой процедуры. Таким образом, оптимальный рост научит нас HEK-293T/17 клеток является наиболее важным.После этой процедуры или какого-либо другого теста, такого как L2, может быть выполнена ограниченная проверка. Этот анализ может почти избавиться от биологических особенностей рецепторов предпочтения и картина покажет тропизм PPS. Так как они взяли гликопротеины от вируса гриппа клонируются в два плюс максимум.HA и NA белки могут быть изучены отдельно, поэтому мы reassortment между ними. Мутанты и зрелые эффекты могут быть изучены.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Определение молекулярной структуры гликопротеинов ВИЧ Конверт использованием крио-электронной томографии и автоматизированных Sub-томограмма усреднения

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Эпидемиологического надзора за птичьим гриппом с FTA карты: Полевые методы, биобезопасности и транспорта Вопросы Решенные

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Упаковка с ВИЧ или FIV основе Lentivector Конструкции выражения и трансдукции VSV-G Pseudotyped вирусных частиц

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Выражение функциональных рекомбинантного гемагглютинина и нейраминидазы белков от вируса H7N9 Роман гриппа Используя выражение бакуловирусной системе

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Конформационный Оценка ВИЧ-1 тримерных гликопротеинов с помощью мобильного основе ELISA Пробирной

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Моделирование жизненного цикла Эбола Вирус Меньше уровень биологической безопасности 2 Условия вирусом типа частиц, содержащих Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Интраназального введения рекомбинантного гриппа вакцин в химерных мышей Модели для изучения слизистых оболочек

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Лечение тромбоцитов Продукты с рибофлавин и УФ света: эффективность против высокий титр бактериального загрязнения

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Быстрое Молекулярная Обнаружение и дифференциация вирусов гриппа А и В

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Флуоресцентный на основе нейраминидазы Анализ ингибирования для оценки восприимчивости вирусов гриппа к нейраминидазы Ингибитор классу противовирусных препаратов

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...