Name: production of high-titer infectious influenza pseudotyped particles with envelope glycoproteins from highly pathogenic h5n1 and avian h7n9 viruses
Uploaded: 2020-01-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Plan Provincial de Medicina y Ciencia y Tecnología de la Salud de Zhejiang (Números de subvención, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Números de subvención, OO20190070), Hangzhou Medical Science y Proyecto clave tecnológico (Números de subvención, 2014Z11) y proyecto de aplicación autónoma municipal de Hangzhou de desarrollo social e investigación científica (Números de subvención, 20191203B134).

1. Día 1: Cultivo celular y sembrado
<ol><li>Cultivar células de riñón embrionario humano (HEK) 293T/17 en platos de 60 mm con el medio esencial modificado (DMEM) de Dulbecco complementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina (DMEM Complete Medium, DCM) en una incubadora de 37 oC, 5% dióxido de carbono (CO2). NOTA: Se recomiendan las células de paso bajo HEK 293T/17.</li>
	<li>Lave cuidadosamente las células con 5 ml de solución salina tamponada de fosfato...

<ol>
	<li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology (6th). , (2013).</li><li>White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+mechanisms+of+viral+membrane+fusion+proteins:+multiple+variations+on+a+common+theme.">Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).</li><li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-clade+protective+immune+responses+to+influenza+viruses+with+H5N1+HA+and+NA+elicited+by+an+influenza+virus-like+particle.">Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle.</a> PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+pseudotyped+influenza+viral+particles+in+neutralizing+antibody+detection.">Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection.</a> PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).</li><li>Wyatt, R., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+envelope+glycoproteins:+fusogens,+antigens,+and+immunogens.">The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens.</a> Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).</li><li>Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmembrane+domains+of+Sindbis+virus+envelope+glycoproteins+induce+cell+death.">The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death.</a> Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).</li><li>Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+Glycoproteins+Are+Delivered+to+Virus+Assembly+Sites+Through+Dynamin-Dependent+Endocytosis.">HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis.</a> Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).</li><li>Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotype+formation+between+enveloped+RNA+and+DNA+viruses.">Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses.</a> Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).</li><li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Control+of+Cellular+Susceptibility+to+Pseudotypes+of+Rous+Sarcoma+Virus.">Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus.</a> Virology. 26, 270-276 (1965).</li><li>Steffen, I., Simmons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotyping+Viral+Vectors+With+Emerging+Virus+Envelope+Proteins.">Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins.</a> Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).</li><li>Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+hepatitis+C+virus+pseudo-particles+containing+functional+E1-E2+envelope+protein+complexes.">Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.</a> Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).</li><li>Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCV+envelope+protein+function+is+dependent+on+the+peptides+preceding+the+glycoproteins.">HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).</li><li>Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+potentially+important+elements+of+the+hepatitis+B+virus+large+envelope+protein+are+dispensable+for+the+infectivity+of+hepatitis+delta+virus.">Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus.</a> Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).</li><li>Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSV-G-pseudotyped+retroviral+packaging+through+adenovirus-mediated+inducible+gene+expression.">VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).</li><li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors:+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells.">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pseudoparticles+paired+with+hemagglutinin+and+neuraminidase+from+highly+pathogenic+H5N1+influenza+and+avian+influenza+A+(H7N9)+viruses.">Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses.</a> Virus Research. 253, 20-27 (2018).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+Pseudotyped+Particles+Pairing+Hemagglutinin+of+Highly+Pathogenic+Avian+Influenza+a+H5N1+Virus+with+Neuraminidases+of+The+2009+Pandemic+H1N1+and+a+Seasonal+H3N2.">Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2.</a> Journal of Bioterrorism &amp; Biodefense. 2, 104 (2011).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neuraminidases+from+the+highly+pathogenic+avian+H5N1+and+2009+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses.">Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).</li><li>Nefkens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+pseudotyped+lentiviral+particles:+characterization+of+a+new+method+for+avian+H5N1+influenza+sero-diagnosis.">Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis.</a> Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+and+neuraminidase+matching+patterns+of+two+influenza+A+virus+strains+related+to+the+1918+and+2009+global+pandemics.">Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oseltamivir+boosts+2009+H1N1+virus+infectivity+in+vitro.">Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).</li><li>McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+M2+envelope+protein+augments+avian+influenza+hemagglutinin+pseudotyping+of+lentiviral+vectors.">Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).</li><li>Pan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+mediates+avian+influenza+H5N1+pseudotyped+particle-induced+lung+inflammation+through+NF-kappaB+and+p38+MAPK+signaling+pathways.">Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).</li><li>Szecsi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neutralising+antibodies+by+virus-like+particles+harbouring+surface+proteins+from+highly+pathogenic+H5N1+and+H7N1+influenza+viruses.">Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses.</a> Virology Journal. 3, 70 (2006).</li><li>Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+evaluation+of+an+influenza+A+(H5)+pseudotyped+lentiviral+particle-based+serological+assay.">Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay.</a> Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).</li><li>Garcia, J. M., Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+influenza+pseudotyped+lentiviral+particles+and+their+use+in+influenza+research+and+diagnosis:+an+update.">Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).</li><li>Haynes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza-pseudotyped+Gag+virus-like+particle+vaccines+provide+broad+protection+against+highly+pathogenic+avian+influenza+challenge.">Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge.</a> Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).</li><li>Schmeisser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+mammalian+virus-like+particles+from+modified+vaccinia+virus+Ankara+vectors+expressing+influenza+H5N1+hemagglutinin+and+neuraminidase.">Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase.</a> Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+(SARS-CoV)+S+glycoprotein+and+influenza+matrix+1+efficiently+form+virus-like+particles+(VLPs)+that+protect+mice+against+challenge+with+SARS-CoV.">Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV.</a> Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).</li><li>Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Lyssavirus-Neutralizing+Antibodies+Using+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotype+Particles.">Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles.</a> Viruses. 8 (9), 254 (2016).</li><li>Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV+Fusion+Peptide+Forms+an+Extended+Bipartite+Fusion+Platform+that+Perturbs+Membrane+Order+in+a+Calcium-Dependent+Manner.">The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).</li><li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus+infection+is+inhibited+by+griffithsin.">Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin.</a> Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).</li><li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Pseudotyped+Particles+to+Study+Highly+Pathogenic+Coronaviruses+in+a+Biosafety+Level+2+Setting.">Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+leukemia+virus+pseudotypes+of+La+Crosse+and+Hantaan+Bunyaviruses:+a+system+for+analysis+of+cell+tropism.">Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism.</a> Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).</li><li>Wool-Lewis, R. J., Bates, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebola+virus+entry+by+using+pseudotyped+viruses:+identification+of+receptor-deficient+cell+lines.">Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines.</a> Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).</li><li>Chen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+design+of+more+effective+avian+replication-incompetent+retroviral+vectors.">Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors.</a> Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).</li><li>Kaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+generation+of+pseudotype-based+serum+neutralization+assay+for+Nipah+virus+antibodies:+sensitive+and+high-throughput+analysis+utilizing+secreted+alkaline+phosphatase.">Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase.</a> Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).</li><li>Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+modeling+of+influenza+A+virus+replication+in+cell+cultures+predicts+infection+dynamics+for+highly+different+infection+conditions.">Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions.</a> PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).</li><li>Petiot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+viruses+production:+Evaluation+of+a+novel+avian+cell+line+DuckCelt(R)-T17.">Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17.</a> Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).</li></ol>

En este protocolo, describimos un método para producir partículas pseudotipo del virus de la gripe (pp) en un ajuste BSL-2. El reportero plásmido pcDNA-GFP se incorpora en el pps y se puede utilizar para cuantificar pps por FACS en un ensayo de infectividad. Elegimos dos tipos de líneas celulares susceptibles porque son ampliamente utilizadas en la investigación de la gripe. Las células MDCK proporcionarían un buen control a las células humanas inmortalizadas variables utilizadas en estos estudios.
<p class="...

La misión de una partícula viral es transportar su genoma desde una célula huésped infectada a una célula huésped no infectada y entregarlo en el citoplasma o el núcleo en unformulario1 competente para la replicación. Este proceso se desencadena inicialmente por la unión a los receptores celulares del huésped, seguido por la fusión de virión y membranas celulares. Para los virus envueltos, como los virus de la gripe, las glicoproteínas de pico son responsables de la unión de receptores y la fusión1,2. Las glicoproteínas de sobrevirales (p. ej., pirógenos, antígenos), están implicadas en muchas propiedades y eventos importantes, como el inicio del ciclo de vida del virus (unión y fusión), la patogénesis viral, la inmunogenicidad, la apoptosis de células huésped y el tropismo celular, la vía endocytica celular, así como la transmisión y reordenación entre especies1,3,4,5,6,7. La investigación sobre las glicoproteínas de sobres virales nos ayudará a comprender muchos aspectos del proceso de infección viral. Las partículas virales pseudotipo (pp), también denominadas pseudoviriones o pseudopartículas, se pueden generar a través de una técnica de pseudotipado8,9,10. Esta tecnología se ha utilizado para desarrollar partículas pseudotipo de muchos virus, incluyendo hepatitis C11,12,hepatitis B13,virus de la estomatitis vesicular (VSV)14,15, y virus de la gripe16,17,18,19. Esta tecnología se basa en la proteína Gag-Pol de lentivirus u otros retrovirus.
Las partículas virales pseudotipo se pueden obtener utilizando un sistema de tres plásmidos mediante la cotransfección de un plásmido de expresión de glicoproteína enenvolvente viral, un plásmido de envase saqueviral que falta el gen envolvente env, y un plásmido reportero separado en células productoras de pp. El retrovirus se ensambla por su proteína Gag, y brota de una membrana celular infectada que expresa la proteína envolvente del virus1. Por lo tanto, es posible obtener pps de gripe de alto titer utilizando la proteína gag retrovirus para producir cogollos en una membrana celular que expresa la gripe HA y NA. En nuestros estudios anteriores, los HAs/NAs en todas las combinaciones eran funcionales y capaces de realizar sus correspondientes funciones en el ciclo de vida viral16,17,18,20,21. Estos pps se utilizan para investigar las características biológicas de la gripe, incluyendo la hemaglutinación, la actividad de la neuraminidasa, el tropismo de unión a los receptores HA e infectividad. Debido a que HA y NA son proteínas funcionales superficiales importantes en el ciclo de vida viral, los HA y NA no coincidentes derivados de diferentes cepas de gripe pueden demostrar en parte un reordenamiento entre ellos. Aquí, generamos ocho tipos de pps de gripe combinando dos ABA y dos NA (derivadas de la cepa HPAI H5N1 y la mancha H7N9), utilizando un sistema de pseudotipado de tres plásmidos. Estos ocho tipos de pps incluyen dos pps nativos, H5N1pp, H7N9pp; dos pps no coincidentes, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; y cuatro pps que sólo albergan una sola glicoproteína (HA o NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Los estudios sobre el virus de la gripe, como H5N1 y H7N9, están limitados por los requisitos de bioseguridad. Todos los estudios de las cepas del virus de la gripe silvestre deben realizarse en un laboratorio de nivel 3 de bioseguridad (BSL-3). La tecnología de partículas virales pseudotipo se puede utilizar para empaquetar un virión artificial en un ajuste de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Por lo tanto, pps representa una herramienta más segura y útil para estudiar los procesos del virus de la gripe dependiendo de sus dos principales glicoproteínas: la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA).
Este protocolo describe la generación de estos pps con una estrategia de cofección de tres plásmdos (generalmente en la Figura 1),cómo cuantificar pps y detección de infectividad. La producción de pp implica tres tipos de plásmidos(Figura 1). El gen gag-pol, que codifica la proteína retrovirus Gag-Pol, fue clonado a partir de un kit de empaquetado de retrovirus e insertado en el plásmido pcDNA 3.1 y nombrado pcDNA-Gag-Pol. El gen mejorado de la proteína fluorescente verde (eGFP), que codifica la proteína fluorescente verde, fue clonado a partir del vector pTRE-EGFP, insertado en el plásmido pcDNA 3.1, y llamado pcDNA-GFP. Durante la clonación, se añadió una secuencia de señal de embalaje (o) a través de una imprimación. Los genes HA y NA fueron clonados en un plásmido pVRC, llamado pVRC-HA y pVRC-NA, respectivamente. El último plásmido codifica la proteína de fusión y puede ser reemplazado por cualquier otra proteína de fusión de interés. Nuestra plataforma de pseudotipado incluye dos plásmidos de expresión de glicoproteína: pVRC-HA y pVRC-NA. Esto puede simplificar la investigación sobre el resurtido entre diferentes cepas de virus en un entorno BSL-2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70664</td>
			<td>Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic 
			Individual alphanumeric codes for well identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Individual alphanumerical codes for well identification 
			Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma irradiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Excell</td>
			<td>FND500</td>
			<td>fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>cytoflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alveolar adenocarcinoma A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent biological microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51-32P01-FLB3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31-12PHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3006L</td>
			<td>Will withstand up to 14,000 RCF 
			RNase-/DNase-free Nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td>an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td>The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Maximum RCF is 12,500 xg 
			Temperature range from -80 &#176;C to 120 &#176;C 
			RNase-/DNase-free 
			Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP Centrifuge Tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td>a stable and highly reactive serine protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST532</td>
			<td>Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated Culture Dish (60mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td>Trypsin from bovine pancreas 
			TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, &#8805;10,000 BAEE units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK-trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td>This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-titer infectious influenza pseudotyped particles with envelope glycoproteins from highly pathogenic h5n1 and avian h7n9 viruses

La transmisión directa ocasional del virus de la gripe aviar A altamente patógeno H5N1 (HPAI H5N1) y H7N9 a los seres humanos y su letalidad son graves problemas de salud pública y sugieren la posibilidad de una epidemia. Sin embargo, nuestra comprensión molecular del virus es rudimentaria, y es necesario estudiar las propiedades biológicas de sus proteínas envolventes como dianas terapéuticas y desarrollar estrategias para controlar la infección. Desarrollamos una plataforma sólida de partículas pseudotipo virales (pp) para estudiar el virus de la gripe aviar, incluyendo el análisis funcional de su hemagglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) envuelve glicoproteínas, las características de reordenación de los HA y NA, receptores, tropismos, anticuerpos neutralizantes, diagnóstico, infectividad, con fines de desarrollo de fármacos y diseño de vacunas. Aquí, describimos un procedimiento experimental para establecer pps con las glicoproteínas envolventes (HA, NA) de dos cepas de gripe A (HAPI H5N1 y 2013 aviar H7N9). Su generación se basa en la capacidad de algunos virus, como el virus de la leucemia murina (MLV), para incorporar glicoproteínas de envoltura en un pp. Además, también detallamos cómo estos pps se cuantifican con RT-qPCR, y la detección de infectividad de pps de virus nativos y no coincidentes dependiendo del origen de los HA y NA. Este sistema es altamente flexible y adaptable y se puede utilizar para establecer pps virales con glicoproteínas envolventes que se pueden incorporar en cualquier otro tipo de virus envuelto. Por lo tanto, esta plataforma de partículas virales se puede utilizar para estudiar virus salvajes en muchas investigaciones de investigación.

Dependiendo del procedimiento general descrito anteriormente, hemos generado 10 tipos de pps combinando dos HAs/NAs de grupo o glicoproteína VSV-G o glicoproteínas sin sobre (mostradas en la Tabla 1). Siete de ellos son infecciosos. Los pps que albergan glicoproteína sin sobre o sólo puerto NA no mostraron ninguna infectividad aquí. El procedimiento de producción de influenza pp se ofrece en la Figura 1. Las micrografías electrónicas de transmisión de pps (por ejemp...

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Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

Este protocolo describe un proceso experimental para producir partículas seudotipos virales infecciosas de alto valor (pp) con glicoproteínas envolventes de dos cepas de gripe A y cómo determinar su infectividad. Este protocolo es altamente adaptable para desarrollar pps de cualquier otro tipo de virus envueltos con diferentes glicoproteínas envolventes.

Producción de partículas pseudotipadas de influenza infecciosa de alto valor con glicoproteínas envolventes de virus H5N1 altamente patógenos y aviares H7N9

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Esta técnica de producción de PP viral de gripe y determinar su infectividad puede simplificar la investigación del virus de la gripe en una ciudad BSL-2. Normalizamos el PPS para las infecciones basado en datos qRT-PCR de PPS. Se codifican dos plásmidos de expresión de glicoproteína, lo que puede simplificar la investigación sobre la reordenación de virus.Un día después de la siembra celular, compruebe la morfología celular y la densidad bajo un microscopio de luz invertido. Idealmente la célula debe ser aproximadamente 85%confluente en la transfección. Sustituya el medio por un mililitro de DMEM sin suero por pozo y vuelva a colocar la placa en la incubadora.Para cada pocero de células a trans infectar, diluir ocho microlitros del reactivo de transfección a un volumen de 150 microlitros con medio sérico reducido. Mezclar la solución suavemente y dejar reposar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Mientras tanto, diluir 2,5 microgramos de ADN plásmido en 158 microlitros de medio sérico reducido.Después de la incubación de cinco minutos, combinar el ADN diluido con el reactivo de transfección diluido, mezclar suavemente la solución y dejarla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Añadir el complejo de lípidos de ADN a los pozos correspondientes con las células en medio libre de suero. A continuación, mezcle suavemente la placa balanceándose hacia adelante y hacia atrás.Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cuatro a seis horas. Después de la incubación, retirar el medio y reemplazarlo con dos mililitros de DMEM por pozo. Luego incubarlo durante otras 36 a 48 horas.Semilla cada tipo de célula susceptible a 10.000 células por pozo y una placa de 96 pozos. A continuación, deje la placa durante la noche en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius y cinco por ciento por ciento. Al tercer día después de la transfección, compruebe el color del medio que debe ser de color rosa claro o ligeramente naranja y examine las células con un microscopio biológico florescente invertido bajo una longitud de onda de 440 a 460 nanómetros.A las 38 a 48 horas después de la transfección, cosecha las partículas pseuotipadas o PPS pasándolas a través de un filtro de membrana de fluoruro de polivinilideno de 0,45 micrómetros para eliminar los desechos celulares, luego divídalas en alícuotas de pequeño volumen y guárdelas a menos 80 grados Celsius. Para cuantificar el PPS, transfiera 30 microlitros de las partículas virales purificadas a un tubo libre de gluquelador de 1,5 microlitros y añada un microlitro de Benzonase Nuclease. Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante una hora para eliminar cualquier contaminación por ADN y ARN.Después de la incubación, congelar la muestra a menos 70 grados Celsius para activar la nucleasa y añadir dos microlitros de Proteinase K.Incubar la mezcla durante 30 minutos para digerir las proteínas de envolvente y liberar el ARN CMV-GFP. Luego inteítese la Proteinase K a 100 grados Celsius durante tres minutos. Cuantifique el PPS con la transcripción inversa cuantitativa RTPCR utilizando el kit RT-qPCR de una sonda universal de un paso en los primeros y sondas especificados en el manuscrito de texto.Normalice el PPS a cuatro veces 10 a la quinta copia de ARN por mililitro. A continuación, agregue TPCK-trippsin a una concentración final de 10 microgramos por mililitro en el PPS que alberga H7N9 hemagglutinina. Incubar el PPS a 37 grados celsius durante una hora para formar las subunidades funcionales HA1 y HA2.Mezclar el PPS normalizado con el medio DMEM en una proporción de uno a uno, luego llevar la placa que contiene células susceptibles al gabinete de bioseguridad. Aspirar el sobrenadante y lavar las células una vez con 100 microlitros de PBS precalentado. Añadir 100 microlitros de mezcla PPS-DMEM en cada pozo, triplicando las pruebas de infectividad de cada tipo de PPS a una línea celular susceptible.Incubar la placa durante cuatro a seis horas a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. A continuación, aspirar el sobrenadante y reemplazarlo con 100 microlitros de DCM Incubar la placa durante otras 24 a 36 horas antes de la detección de la infectividad. Nuestros resultados son PPS se consideran ahora infecciosos para las personas.Por lo tanto, se recomiendan los procedimientos de protección segura necesarios para tomar, como usar una máscara y realizar los ensayos de infectividad en un gabinete de bioseguridad. Este protocolo se generó para generar 10 tipos de partículas pseudotipo o PPS con dos hemaglutinina agrupadas y neuraminidasa del virus de la estomatitis vesicular G glicoproteína o sin glicoproteínas de envolvente. El PPS se grafió con microscopía electrónica de transmisión y su infectividad se evaluó en dos líneas celulares, A549 y MDCK.En el grupo PPS que alberga H5, la infectividad de H5N1, H5 más N9 y H5 fue aproximadamente 90%18% y 10% para la línea celular A549 y 40%5% y 5% para MDCK, respectivamente. En el grupo PPS que alberga H7, la infectividad de H7N9, H7 más N1 y H7 fue aproximadamente 10%7% y 1%para la línea celular A549 y 8%4%y 1% para MDCK, respectivamente. La infectividad del virus de estomatitis vesicular G glicoproteína PP fue de aproximadamente 21%para A549 y 16%para las células MDCK.Mientras que el PP de sobre delta no mostró infectividad. Es fundamental recordar que las células HEK-293T/17 del productor de PP constituyen la base de este procedimiento. Así que el crecimiento óptimo nos enseña células HEK-293T/17 es lo más importante.Siguiendo este procedimiento o alguna otra prueba como L2 receptar el ensayo de límite se puede realizar. Este ensayo casi puede deshacerse de las peculiaridades biológicas de la preferencia del receptor y el patrón revelará el tropismo del PPS. Desde que tomaron las glicoproteínas del virus de la gripe se clonan en dos más máx.HA y las proteínas NA se pueden estudiar por separado por lo que reasociamos entre ellas. Los mutantes y los efectos maduros se pueden explorar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Determinación de estructuras moleculares de glicoproteínas de la envoltura del VIH con Cryo-tomografía electrónica y automatizada promedio Sub-tomografía

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Investigación

Inmunología e Infección

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Vigilancia de la Gripe Aviar, con tarjetas FTA: Métodos de Campo, la bioseguridad y los problemas de transporte resueltos

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Embalaje VIH o FIV basados ​​en lentivirus Construcciones de expresiones y de transducción de la VSV-G partículas virales pseudotyped

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Expresión de funcionales recombinante hemaglutinina y neuraminidasa Proteínas del Virus Novel H7N9 Influenza usando el sistema de expresión de baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Modelado El ciclo de vida de Ebola Virus Bajo Nivel de Bioseguridad 2 Condiciones Con-Virus como partículas que contienen Tetracistronic minigenomas

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

El tratamiento de los productos de plaquetas con riboflavina y luz UV: Eficacia contra el alto título contaminación bacteriana

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Detección Molecular rápida y diferenciación de virus gripales A y B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...