Name: production of high-titer infectious influenza pseudotyped particles with envelope glycoproteins from highly pathogenic h5n1 and avian h7n9 viruses
Uploaded: 2020-01-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från Zhejiang Provincial medicin och hälsovetenskap och teknikplan (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou kommunal medicin och hälsovetenskap och teknikplan (Grant nummer, OO20190070), Hangzhou Medical Science och Teknik nyckelprojekt (Grant Numbers, 2014Z11) och Hangzhou kommunala autonoma ansöknings projekt för social utveckling och vetenskaplig forskning (Grant Numbers, 20191203B134).

1. dag 1: cell kultur och seedning
<ol><li>Odla mänskliga embryonala njure (HEK) 293T/17 celler i 60 mm rätter med Dulbecco modifierade essentiella mediet (DMEM) kompletteras med 10% foster bovin serum (FBS) och 100 U/mL penicillin-streptomycin (DMEM komplett medium, DCM) i en 37 ° c, 5% koldioxid (CO2) inkubator fram till ca 80% confluent. Obs: HEK 293T/17 låg passage celler rekommenderas.</li>
	<li>Tvätta noggrant cellerna med 5 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 1x. Obs: manuell hantering av H...

<ol>
	<li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology (6th). , (2013).</li><li>White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+mechanisms+of+viral+membrane+fusion+proteins:+multiple+variations+on+a+common+theme.">Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).</li><li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-clade+protective+immune+responses+to+influenza+viruses+with+H5N1+HA+and+NA+elicited+by+an+influenza+virus-like+particle.">Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle.</a> PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+pseudotyped+influenza+viral+particles+in+neutralizing+antibody+detection.">Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection.</a> PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).</li><li>Wyatt, R., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+envelope+glycoproteins:+fusogens,+antigens,+and+immunogens.">The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens.</a> Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).</li><li>Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmembrane+domains+of+Sindbis+virus+envelope+glycoproteins+induce+cell+death.">The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death.</a> Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).</li><li>Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+Glycoproteins+Are+Delivered+to+Virus+Assembly+Sites+Through+Dynamin-Dependent+Endocytosis.">HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis.</a> Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).</li><li>Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotype+formation+between+enveloped+RNA+and+DNA+viruses.">Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses.</a> Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).</li><li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Control+of+Cellular+Susceptibility+to+Pseudotypes+of+Rous+Sarcoma+Virus.">Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus.</a> Virology. 26, 270-276 (1965).</li><li>Steffen, I., Simmons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotyping+Viral+Vectors+With+Emerging+Virus+Envelope+Proteins.">Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins.</a> Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).</li><li>Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+hepatitis+C+virus+pseudo-particles+containing+functional+E1-E2+envelope+protein+complexes.">Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.</a> Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).</li><li>Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCV+envelope+protein+function+is+dependent+on+the+peptides+preceding+the+glycoproteins.">HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).</li><li>Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+potentially+important+elements+of+the+hepatitis+B+virus+large+envelope+protein+are+dispensable+for+the+infectivity+of+hepatitis+delta+virus.">Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus.</a> Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).</li><li>Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSV-G-pseudotyped+retroviral+packaging+through+adenovirus-mediated+inducible+gene+expression.">VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).</li><li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors:+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells.">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pseudoparticles+paired+with+hemagglutinin+and+neuraminidase+from+highly+pathogenic+H5N1+influenza+and+avian+influenza+A+(H7N9)+viruses.">Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses.</a> Virus Research. 253, 20-27 (2018).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+Pseudotyped+Particles+Pairing+Hemagglutinin+of+Highly+Pathogenic+Avian+Influenza+a+H5N1+Virus+with+Neuraminidases+of+The+2009+Pandemic+H1N1+and+a+Seasonal+H3N2.">Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2.</a> Journal of Bioterrorism &amp; Biodefense. 2, 104 (2011).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neuraminidases+from+the+highly+pathogenic+avian+H5N1+and+2009+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses.">Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).</li><li>Nefkens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+pseudotyped+lentiviral+particles:+characterization+of+a+new+method+for+avian+H5N1+influenza+sero-diagnosis.">Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis.</a> Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+and+neuraminidase+matching+patterns+of+two+influenza+A+virus+strains+related+to+the+1918+and+2009+global+pandemics.">Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oseltamivir+boosts+2009+H1N1+virus+infectivity+in+vitro.">Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).</li><li>McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+M2+envelope+protein+augments+avian+influenza+hemagglutinin+pseudotyping+of+lentiviral+vectors.">Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).</li><li>Pan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+mediates+avian+influenza+H5N1+pseudotyped+particle-induced+lung+inflammation+through+NF-kappaB+and+p38+MAPK+signaling+pathways.">Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).</li><li>Szecsi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neutralising+antibodies+by+virus-like+particles+harbouring+surface+proteins+from+highly+pathogenic+H5N1+and+H7N1+influenza+viruses.">Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses.</a> Virology Journal. 3, 70 (2006).</li><li>Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+evaluation+of+an+influenza+A+(H5)+pseudotyped+lentiviral+particle-based+serological+assay.">Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay.</a> Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).</li><li>Garcia, J. M., Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+influenza+pseudotyped+lentiviral+particles+and+their+use+in+influenza+research+and+diagnosis:+an+update.">Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).</li><li>Haynes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza-pseudotyped+Gag+virus-like+particle+vaccines+provide+broad+protection+against+highly+pathogenic+avian+influenza+challenge.">Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge.</a> Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).</li><li>Schmeisser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+mammalian+virus-like+particles+from+modified+vaccinia+virus+Ankara+vectors+expressing+influenza+H5N1+hemagglutinin+and+neuraminidase.">Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase.</a> Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+(SARS-CoV)+S+glycoprotein+and+influenza+matrix+1+efficiently+form+virus-like+particles+(VLPs)+that+protect+mice+against+challenge+with+SARS-CoV.">Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV.</a> Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).</li><li>Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Lyssavirus-Neutralizing+Antibodies+Using+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotype+Particles.">Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles.</a> Viruses. 8 (9), 254 (2016).</li><li>Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV+Fusion+Peptide+Forms+an+Extended+Bipartite+Fusion+Platform+that+Perturbs+Membrane+Order+in+a+Calcium-Dependent+Manner.">The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).</li><li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus+infection+is+inhibited+by+griffithsin.">Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin.</a> Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).</li><li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Pseudotyped+Particles+to+Study+Highly+Pathogenic+Coronaviruses+in+a+Biosafety+Level+2+Setting.">Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+leukemia+virus+pseudotypes+of+La+Crosse+and+Hantaan+Bunyaviruses:+a+system+for+analysis+of+cell+tropism.">Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism.</a> Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).</li><li>Wool-Lewis, R. J., Bates, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebola+virus+entry+by+using+pseudotyped+viruses:+identification+of+receptor-deficient+cell+lines.">Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines.</a> Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).</li><li>Chen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+design+of+more+effective+avian+replication-incompetent+retroviral+vectors.">Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors.</a> Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).</li><li>Kaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+generation+of+pseudotype-based+serum+neutralization+assay+for+Nipah+virus+antibodies:+sensitive+and+high-throughput+analysis+utilizing+secreted+alkaline+phosphatase.">Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase.</a> Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).</li><li>Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+modeling+of+influenza+A+virus+replication+in+cell+cultures+predicts+infection+dynamics+for+highly+different+infection+conditions.">Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions.</a> PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).</li><li>Petiot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+viruses+production:+Evaluation+of+a+novel+avian+cell+line+DuckCelt(R)-T17.">Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17.</a> Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).</li></ol>

I detta protokoll beskriver vi en metod för framställning av pseudotypade influensavirus partiklar (PP) i en BSL-2-miljö. Reportern plasmid pcDNA-GFP införlivas i PPS och kan användas för att kvantifiera PPS med FACS i en smittsamhet assay. Vi valde två typer av mottagliga cellinjer eftersom de används ofta i influensaforskning. MDCK celler skulle ge en god kontroll till variabeln förevigade mänskliga celler som används i dessa studier.
Detta protokoll är baserat på retrovirus MLV...

Uppdraget för en viral partikel är att transportera dess arvsmassa från en infekterad värd cell till en icke-infekterad värd cell och att leverera den till cytoplasman eller kärnan i en replikation-kompetent form1. Denna process utlöses initialt genom bindning till värd cellreceptorer, följt av fusion av spjälkat virus och cellulära membran. För höljeförsedda virus, som influensavirus, Spike glykoproteiner är ansvariga för receptorbindning och fusion1,2. Virala kuvert glykoproteiner (t. ex. pyrogener, antigener), är involverade i många viktiga egenskaper och händelser, såsom virus livscykel initiering (bindning och fusion), viral patogenes, immunogenicitet, värd Cell apoptos och cellulära tropism, den cellulära rutt vägen, liksom mellan arter överföring och omsortiments1,3,4,5,6,7. Forskning om viral kuvert glykoproteiner kommer att hjälpa oss att förstå många aspekter av viral Infection process. Pseudotypifierade viruspartiklar (PP), även kallade pseudovirioner eller pseudopartiklar, kan genereras genom en pseudotypteknik8,9,10. Denna teknik har använts för att utveckla pseudotypifierade partiklar av många virus, inklusive hepatitC 11,12, hepatit B13, vesikulär stomatit virus (VSV) 14,15, och influensavirus16,17,18,19. Denna teknik är baserad på gag-pol protein av lentivirus eller andra retrovirus.
Pseudotypifierade virala partiklar kan erhållas med hjälp av ett tre-plasmid-system genom att cotransfecting en viral kuvert glykoprotein uttryck plasmid, en antiretrovirala förpackning plasmid saknas kuvert ENV genen, och en separat reporter plasmid i PP producent celler. Den retrovirus monteras av dess gag protein, och det knoppar från en infekterad cellmembran som uttrycker viruset kuvert protein1. Därför är det möjligt att få hög titer influensa PPS med retrovirus gag protein för att producera knoppar på ett cellulärt membran som uttrycker influensa HA och NA. I våra tidigare studier, har/NAS i alla kombinationer funktionella och kunna utföra sina motsvarande funktioner i viral livscykel16,17,18,20,21. Dessa PPS används för att undersöka influensaliknande biologiska egenskaper, inklusive hemagglutination, neuraminidastyp aktivitet, ha-receptorbindning tropism, och smittsamhet. Eftersom HA och NA är både viktiga ytfunktionella proteiner i den virala livscykeln, har avvikande och NAs som härrör från olika stammar av influensa delvis kan visa resortimenten mellan dem. Här genererar vi åtta typer av influensa PPS genom att kombinera två har och två NAs (härrör från HPAI H5N1 stam och H7N9 fläcken), med hjälp av ett tre-plasmid pseudotyping system. Dessa åtta typer av PPS inkluderar två infödda PPS, H5N1pp, H7N9pp; två inkompatibla PPS, (H5 + N9) PP, (H7 + N1) PP; och fyra PPS bara hyser en enda glykoprotein (ha eller na), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. studier av influensavirus, såsom H5N1 och H7N9, begränsas av biosäkerhets krav. Alla studier av stammar av vilda influensavirus bör utföras i ett laboratorium för biosäkerhetsnivå 3 (BSL-3). Pseudotypifierad viral partikel teknik kan användas för att paketera en konstgjord spjälkat virus i en inställning för biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2). PPS utgör därför ett säkrare och användbart verktyg för att studera influensavirus processer beroende på dess två stora glykoproteiner: hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA).
Detta protokoll beskriver generering av dessa PPS med en tre-plasmid cotransfection strategi (översedd i figur 1), hur man kvantifiera PPS, och smittsamhet upptäckt. PP-produktionen omfattar tre typer av plasmider (figur 1). Den gag-pol genen, som kodar retrovirus gag-pol protein, klonas från en retrovirus förpackning kit och införas i pcdna 3,1 plasmid och heter Pcdna-gag-pol. Den förbättrade gröna fluorescerande protein (eGFP) genen, som kodar grönt fluorescerande protein, klonas från pTRE-EGFP vektor, in i pcDNA 3,1 plasmid, och kallas pcDNA-GFP. Under kloningen tillkom en förpackning signal (ψ) sekvens via en primer. HA och NA gener var klonade i en pVRC plasmid, heter pVRC-HA och pVRC-NA, respektive. Den sista plasmiden kodar fusionsproteinet och kan ersättas med något annat fusionsprotein av intresse. Vår pseudotyping plattform innehåller två glykoproteinuttryck plasmider: pVRC-HA och pVRC-NA. Detta kan förenkla forskningen om omsortiment mellan olika virusstammar i en BSL-2-inställning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70664</td>
			<td>Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic 
			Individual alphanumeric codes for well identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Individual alphanumerical codes for well identification 
			Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma irradiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Excell</td>
			<td>FND500</td>
			<td>fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>cytoflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alveolar adenocarcinoma A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent biological microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51-32P01-FLB3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31-12PHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3006L</td>
			<td>Will withstand up to 14,000 RCF 
			RNase-/DNase-free Nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td>an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td>The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Maximum RCF is 12,500 xg 
			Temperature range from -80 &#176;C to 120 &#176;C 
			RNase-/DNase-free 
			Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP Centrifuge Tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td>a stable and highly reactive serine protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST532</td>
			<td>Treated for optimal cell attachment 
			Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated Culture Dish (60mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td>Trypsin from bovine pancreas 
			TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, &#8805;10,000 BAEE units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK-trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1426</td>
			<td>This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-titer infectious influenza pseudotyped particles with envelope glycoproteins from highly pathogenic h5n1 and avian h7n9 viruses

Tillfällig direkt överföring av högpatogen aviär influensa A-virus H5N1 (HPAI H5N1) och H7N9 till människor och deras dödlighet är allvarliga folkhälsofrågor och tyder på en möjlighet till en epidemi. Men, vår molekylära förståelse av viruset är rudimentär, och det är nödvändigt att studera de biologiska egenskaperna hos dess kuvert proteiner som terapeutiska mål och att utveckla strategier för att kontrollera infektion. Vi utvecklade en solid viral pseudotypifierad partikel (PP) plattform för att studera aviär influensavirus, inklusive funktionell analys av dess hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA) kuvert glykoproteiner, omsortimenten egenskaperna hos har och NAs, receptorer, tropismer, neutraliserande antikroppar, diagnos, smittsamhet, för läkemedelsutveckling och vaccin design. Här beskriver vi ett experimentellt förfarande för att upprätta PPS med kuvertet glykoproteiner (HA, NA) från två influensa A-stammar (HAPI H5N1 och 2013 avian H7N9). Deras generation är baserad på kapaciteten hos vissa virus, såsom murina leukemi virus (MLV), att införliva kuvert glykoproteiner i en PP. Dessutom, vi detalj också hur dessa PPS kvantifieras med RT-qPCR, och smittsamhet upptäckt av infödda och inkompatibla virus PPS beroende på ursprunget av har och NAs. Detta system är mycket flexibelt och anpassningsbart och kan användas för att etablera viral PPS med kuvert glykoproteiner som kan införlivas i någon annan typ av höljeförsedda virus. Sålunda, denna viral partikel plattform kan användas för att studera vilda virus i många forsknings utredningar.

Beroende på den allmänna proceduren som beskrivs ovan, har vi genererat 10 typer av PPS som kombinerar två grupp har/NAs eller VSV-G glykoprotein eller No-kuvert glykoproteiner (visas i tabell 1). Sju av dem är smittsamma. PPS som Harbor No-kuvert glykoprotein eller bara Harbor NA visade inte någon smittsamhet här. Den influensa PP produktionsprocessen är översedd i figur 1. Transmissionselektronmikrografer av PPS (t. ex. H5N1pp) visas i figur 3<...

Watch this Scientific Journal Video about Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses at JoVE.com

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

Detta protokoll beskriver en experimentell process för att producera hög titer infektiösa virala pseudotypiserade partiklar (PP) med kuvert glykoproteiner från två influensa A stammar och hur man bestämmer deras smittsamhet. Detta protokoll är mycket anpassningsbar för att utveckla PPS av någon annan typ av höljeförsedda virus med olika kuvert glykoproteiner.

Framställning av Högtiter infektiösa influensa Pseudotypade partiklar med kuvert glykoproteiner från högpatogen H5N1 och aviär H7N9 virus

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Denna teknik för att producera influensa viral PP och bestämma dess smittsamhet kan förenkla forskningen av influensavirus i en BSL-2 stad. Vi normaliserade PPS för de infektioner som baseras på qRT-PCR data av PPS. Två glykoproteinuttryck plasmid kodas, vilket kan förenkla forskningen om virus reassortment.En dag efter cell sådd, kontrollera cellen morfologi och densitet under en inverterad ljus mikroskop. Helst cellen bör vara cirka 85%konfluent vid transfektion. Byt ut mediet mot en milliliter serumfritt DMEM per brunn, och sätt tillbaka plattan i inkubatorn.För varje brunn av celler som ska transfekteras, späd ut åtta mikroliter av transfektionsreagensen till en volym av 150 mikroliter med reducerat serummedium. Blanda lösningen försiktigt och låt den sitta i rumstemperatur i fem minuter. Under tiden späd 2,5 mikrogram plasmid DNA i 158 mikroliter av reducerat serum medium.Efter inkuberingen på fem minuter, kombinera det utspädda DNA med utspädd transfektionsreagens, blanda lösningen försiktigt och låt den vara i rumstemperatur i 15 minuter. Tillsätt DNA lipidkomplexet till motsvarande brunnar med cellerna i serumfritt medium. Blanda sedan plattan försiktigt genom att gunga fram och tillbaka.Inkubera plattan på 37 grader Celsius och 5%koldioxid i fyra till sex timmar. Efter inkubationen, ta bort mediet och ersätta det med två milliliter DMEM per brunn. Sedan ruva den i ytterligare 36 till 48 timmar.Utsäde varje typ av mottaglig cell vid 10, 000 celler per brunn och en 96 väl platta. Lämna sedan plattan över natten i en 37 grader Celsius och fem procent koldioxid inkubator. På den tredje dagen efter transfektion, kontrollera färgen på mediet som ska ljusrosa eller något orange och undersöka cellerna med en inverterad fluorescerande biologiska mikroskop under 440 till 460 nanometer våglängd.Vid 38 till 48 timmar efter efter transfection, skörda de pseuotyped partiklarna eller PPS genom passaging dem genom en 0,45 mikrometer polyvinylidene fluorid membranfilter för att eliminera cellskräp, sedan dela dem i små volymer alikvoter och lagra dem på minus 80 grader Celsius. För att kvantifiera PPS överför du 30 mikroliter av de renade viruspartiklarna till ett 1,5 mikroliter RNase-fritt rör och lägger till en mikroliter av Benzonase Nuclease. Inkubera röret i 37 grader Celsius i en timme för att eliminera dna och RNA-kontaminering.Efter inkubationen, frysa provet till minus 70 grader Celsius för att aktiv nukleas och tillsätt två mikroliter av Proteinase K.Inkubera blandningen i 30 minuter för att smälta kuvertproteinerna och frisätta CMV-GFP RNA. Sedan inaktiv proteinas K vid 100 grader Celsius i tre minuter. Kvantifiera PPS med kvantitativ omvänd transkription RTPCR med hjälp av Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit i primers och sonder som anges i texten manuskriptet.Normalisera PPS:en till fyra gånger 10 till femte RNA-kopior per milliliter. Lägg sedan till TPCK-trypsin till en slutlig koncentration på 10 mikrogram per milliliter i PPS som hyser H7N9 hemagglutinin. Inkubera PPS vid 37 grader Celsius i en timme för att bilda de funktionella underenheterna HA1 och HA2.Blanda den normaliserade PPS med DMEM medium vid ett ett till ett förhållande, sedan föra plattan som innehåller mottagliga celler till biosäkerhet skåpet. Aspirera supernatanten och tvätta cellerna en gång med 100 mikroliter av förvarvad PBS. Tillsätt 100 mikroliter PPS-DMEM-blandning i varje brunn, triplicating smittsamhetstesterna av varje typ av PPS till en mottaglig cellinje.Inkubera plattan i fyra till sex timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Aspirera sedan supernatanten och byt ut den mot 100 mikroliter av DCM Inkubera plattan i ytterligare 24 till 36 timmar före smittsamhetsdetektion. Våra resultat är PPS anses nu smittsam för människor.Så nödvändiga safe guard förfaranden rekommenderas att ta såsom att bära en mask och utföra smittsamhetsanalyser i en biosäkerhet skåp. Detta protokoll var generera för att generera 10 typer av pseudotyped partiklar eller PPS med två grupperade hemaglutinin och neuraminidas vesikulär stomatit virus G glykoprotein eller inget kuvert glykoproteiner. PPS var avbildad med transmissionselektronmikroskopi och deras smittsamhet utvärderades i två cellinjer, A549 och MDCK.I PPS-gruppen som hyser H5 var smittsamheterna hos H5N1, H5 plus N9 och H5 cirka 90 %18 %respektive 10 % för cellinje A549 respektive 40 %5 %respektive 5 %för MDCK. I PPS-gruppen som hyser H7 var smittsamheterna för H7N9, H7 plus N1 och H7 cirka 10 %7 %respektive 1 %för cellinje A549 respektive 8 %4 %respektive 1 %för MDCK. Smittsamhet vesikulär stomatit virus G glykoprotein PP var ca 21%för A549 och 16%för MDCK celler.Medan delta kuvertet glykoproteiner PP visade ingen smittsamhet. Det är viktigt att komma ihåg att PP producenten HEK-293T/17 celler utgör till grunden för detta förfarande. Så den optimala tillväxten lär oss HEK-293T/17 celler är viktigast.Efter denna procedur eller något annat test såsom L2 recept den begränsningsanalys kan utföras. Denna analys kan nästan ge befria av de biologiska egenheter receptorpreferensen och mönstret kommer att avslöja tropism av PPS. Eftersom de tog glykoproteiner från influensavirus är klonade i två plus max.HA och NA-proteinerna kan studeras separat så att vi reassortment mellan dem. Mutanterna och de mogna effekterna kan utforskas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Fastställande av molekylära strukturer av HIV Envelope Glycoproteins med Cryo-elektrontomografi och automatisk Sub-tomogram Snittar

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Övervakning av aviär influensa med FTA-kort: Metoder Field, biosäkerhet och frågor Transport Löste

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Förpackning HIV-eller FIV-baserade Lentivector Konstrukt Expression och Transduction av VSV-G pseudotypade virala partiklar

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Uttryck av Functional rekombinant hemagglutinin och neuraminidas Proteiner från Novel H7N9 influensavirus Använda baculovirusexpressionssystem

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Conformational Utvärdering av HIV-1 trimera Envelope Glycoproteins användning av en cellbaserad ELISA-analys

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Modellering livscykel Ebola Virus Under skyddsnivå 2 Villkor Med virusliknande partiklar innehållande Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration av rekombinant influensavacciner i chimär musmodeller för att studera slemhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Behandling av trombocyter Produkter med Riboflavin och UV-ljus: Effektivitet mot hög titer Bakteriell förorening

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Snabb molekylär detektion och differentiering av influensavirus A och B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescens-baserade neuraminidas Inhibition analys för att bedöma känsligheten hos influensavirus till The neuraminidashämmaren Class of Virushämmande

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...