Name: preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

نشكر ترينت نيومان وماسودا شريفي على تعليقاتهما على المخطوطة و"نغوين" للمساعدة في تحسين طرق نشر وتلطيخ الكروموسومات من مقلدات الحمار الوحشي. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة R01 GM079115 الممنوحة لS.M.B.

تم تنفيذ جميع الأساليب التي تنطوي على حمار وحشي باستخدام المعايير الأخلاقية المعتمدة من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في جامعة كاليفورنيا في ديفيس.
1. إجراء انتشار الكروموسوم
ملاحظة: تم تصميم البروتوكول التالي لإنشاء 4-6 شرائح، مع مئات من النوى ...

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li><li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks,+synapsis,+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).</li><li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish.">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li><li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+recombination+in+human+males.">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li><li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+studies+of+human+meiosis:+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at,+or+prior+to,+establishment+of+double-strand+breaks.">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075 (2013).</li><li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes.">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442 (2014).</li><li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male.">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Saito, K., Siegfried, K. R., N&#252;sslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants.">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li><li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+by+breaking+and+repairing:+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination.">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li><li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females.">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li><li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes.">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).</li><li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+chiasmata+and+interference.">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li><li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies.">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li><li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene.">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).</li></ol>

هنا نصف طرق للتحقيق في موقع التيلوميرات والبروتينات المرتبطة الكروموسوم في السطح النووي ينتشر من الحيوانات المنوية معزولة عن الخصيتين حمار وحشي. نتوقع أن تكون هذه الأساليب قابلة للتطبيق لتحليل الحيوانات المنوية في الأنواع الأخرى teleost مع التكيف مع حجم الخصية.
في حين تم رفع ...

الإنجاب الجنسي يستمر من خلال الجمع بين اثنين من الملة haploid، كل تحمل نصف الكروموسوم تكملة خلية جسدية. Meiosis هو قسم الخلايا المتخصصة التي تنتج الملة haploid من خلال جولة واحدة من تكرار الحمض النووي وجولتين متتاليتين من الفصل الكروموسوم. في المرحلة الأولى ، يجب أن تخضع الكروموسومات المتجانسة (homologs) للاقتران وإعادة التركيب والمشبك ، ويتميز هذا الأخير بتكوين مجمع synaptonemal الذي يتكون من محورين متجانسين يتم جسرهما بواسطة خيوط العرضية ، Sycp1(الشكل 1A ، B). الفشل في تنفيذ هذه العمليات بشكل صحيح يمكن أن يؤدي إلى إنتاج gametes aneuploid ، والتي هي السبب الرئيسي للإجهاض في البشر1. وقد تم تسهيل معرفتنا بالتنسيق بين الاقتران وإعادة التركيب والمشبك من خلال الدراسات في مجموعة واسعة من الكائنات الحية ، مثل الخميرة ، C. elegans، الماوس ، وDrosophila، من بين أمور أخرى2. في حين أن العملية العامة لاقتران الكروموسوم المتجانس تليها العزل يتم الحفاظ عليها بشكل جيد ، فإن اعتمادها على إعادة التركيب والمشبك ويختلف ترتيب هذه الأحداث.
Meiotic كسر حبلا مزدوجة (DSB) تشكيل، الذي يبدأ إعادة تركيب متجانسة، يحدث بالقرب من التيلوميرات تتجمع في باقة خلال اللبتوتين ومتشابك الاشتباك العصبي تستتبعه بعد وقت قصيرمن 3،4. هذا التكوين من تشكيل DSB وبدء المشبك هو أيضا سمة من سمات meiosis الذكور في البشر ولكن ليس في الماوس5،6،7،8، مما يشير إلى أن حمار وحشي يمكن أن تكون بمثابة نموذج لتكوين الحيوانات المنوية البشرية. وهناك أيضا العديد من المزايا العملية لدراسة الحمار الوحشي meiosis. يخضع كل من الذكور والإناث لتولد الخلايا في مرحلة البلوغ، ويمكن الوصول إلى الغدد التناسلية بسهولة، ويتم توليد المئات من النسل من صليب واحد. بالإضافة إلى ذلك ، تكون الأجنة شفافة وتتطور خارجيًا ، مما يسهل الكشف المبكر عن الانحرافات في النمو الجنيني بسبب الملة الأنيوبلويد3،9. مساوئ استخدام حمار وحشي هي أنها بطيئة للوصول إلى النضج الجنسي (~ 60 يوما) ويجب جمع كمية المواد اللازمة لينتشر السطح النووي من الحيوانات البالغة ~ 10-20 ، اعتمادا على حجمها.
تعد مستحضرات انتشار الكروموسوم اتّهات أداة حيوية لدراسة ديناميكيات الكروموسوم عبر جميع الكائنات الحية النموذجية، حيث يمكن استكشاف التواقيع الرئيسية لديناميكيات الكروموسومات المتوسطة. في حمار وحشي ، تم تشريح الجوانب الرئيسية لتطور البرنامج meiotic والمنظمة النووية من خلال استكشاف ينتشر السطح النووي ، ويشار إليه هنا باسم ينتشر الكروموسوم ، مع الأجسام المضادة للكشف عن الفلور المناعي للبروتينات و / أو الأحماض النووية من قبل FISH3،4،9،10،11،12. في الواقع ، يمكن الحفاظ على توطين الاستقطاب من التيلوميرات المجمعة في باقة في إعداد انتشار(الشكل 1C). في الآونة الأخيرة ، استخدمنا كروموسوم الحيوانات المنوية الحمار الوحشي ينتشر جنبا إلى جنب مع طرق الكشف عن الفلورسوووإكسينس والمجهر الفائق الدقة لتوضيح التقدم التفصيلي لديناميكيات تيلومير حمار وحشي ، اقتران كروموسوم متجانس ، توطين كسر حبلا مزدوج ، وتشابك الاشتباك العصبي في التحولات الرئيسية meiotic3. هنا نقدم طرق لإعداد ينتشر الكروموسوم من الحيوانات المنوية من الخصيتين حمار وحشي ووصمها في وقت لاحق مع الفلورسنت الببتيد النووي (السلطة الوطنية الفلسطينية) تحقيقات لتسلسل التيلومير المتكرروالكشف عن الفلوروسوم البروتينات المرتبطة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde, methanol-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 mm glasscoverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>363696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bag</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Used to make plastic coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>203775-500uL</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-zfSycp1</td>
			<td>Generated by Burgess lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10014CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Two are required for dissecting the testes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89429-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11042</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-hDMC1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8973</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-3683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>230401V (Model 5420)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Model Classic C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimerbly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Used for the humidity chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hamsterSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hMLH1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550838</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hRPA</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>MABE285</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Alexa647</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1013</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Cy3</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRPA</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-244A</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150292</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRad51</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX100469</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercut Scissors, 30&#176; angle, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-822-353</td>
			<td>Can also use any pair of small scissors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9897184</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9253-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes

Meiosis هو العملية الخلوية الرئيسية المطلوبة لإنشاء gametes haploid للتكاثر الجنسي. وقد كانت الكائنات الحية النموذجية مفيدة في فهم أحداث الكروموسوم التي تحدث خلال المرحلة المتوسطة، بما في ذلك الاقتران، وتشبج الاشتباك العصبي، والأحداث إعادة التركيب التي تضمن الفصل الكروموسومي السليم. في حين أن الماوس كان نموذجا هاما لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات ، وليس كل الأحداث meiotic في هذا النظام هي مماثلة لmeiosis الإنسان. لقد أظهرنا مؤخرًا الإمكانات المثيرة لسمك الحمار الوحشي كنموذج لتكوين الحيوانات المنوية البشرية. هنا نصف، بالتفصيل، أساليبنا لتصور الكروموسومات ميوتيك والبروتينات المرتبطة بها في الاستعدادات انتشار الكروموسوم. هذه الاستعدادات لديها ميزة السماح تحليل عالية الدقة من هياكل الكروموسوم. أولاً، نصف إجراء تشريح الخصيات من سمك الحمار الوحشي البالغ، يليه انفصام الخلايا، تحلل، وانتشار الكروموسومات. بعد ذلك ، نصف إجراء الكشف عن توطين بروتينات الكروموسومات المتوسطة ، عن طريق الكشف عن الفلور المناعي ، وتسلسل الحمض النووي ، عن طريق التهجين في الموقع (FISH). وتشمل هذه التقنيات مجموعة مفيدة من الأدوات للتحليل الخلوي لبنية الكروماتين ميوتيكية في نظام حمار وحشي. وينبغي أن يكون الباحثون في مجتمع سمك الحمار الوحشي قادرين على إتقان هذه التقنيات بسرعة ودمجها في تحليلاتهم القياسية للوظيفة الإنجابية.

لقد حددنا طريقة لإعداد وتصور حمار وحشي الحيوانات المنوية الاستعدادات انتشار. عندما يؤديها بشكل صحيح، لدينا إجراءات تسفر عن انتشار جيد، والنوى غير متداخلة. لاستعادة هذه النوى ، من المهم أن يكون المبلغ المناسب من المواد بدءا (أي الخصيتين) ، وعلاج الخصيتين لفترة كافية من ال...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

ينتشر السطح النووي هي أداة لا غنى عنها لدراسة الأحداث الكروموسومية أثناء الداء الميوي. هنا نُظهر طريقة لإعداد وتصور الكروموسومات الميوتيكية خلال المرحلة الأولى من الحيوانات المنوية من سمك حمار وحشي.

إعداد ينتشر كروموسوم Meiotic من الحيوانات المنوية زيبرافيش

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

تظهر أسماك الحمار الوحشي كنموذج فقري ممتاز لدراسة أحداث الكروموسومات من النخاع بما في ذلك الاقتران الكروموسومات المتماثلة ، المشبك والمتلفز. وقد مكننا هذا البروتوكول انتشار السطح النووي لنا من تصور السمات الرئيسية للهندسة الكروموسومية meiotic باستخدام المجهر فائقة القرار. يمكن للباحثين أن يتوقعوا مئات النوى المنتشرة بشكل جيد لكل شريحة مع حطام أقل من بروتوكولات انتشار أسماك الحمار الوحشي الأخرى.الجزء الأكثر تحديا من الناحية الفنية من هذا الإجراء هو تشريح الخصيات حمار وحشي كما هو على مقربة من الجلد، وأيضا تعلق على الأجهزة الأخرى. سيسمح تصور إجراء التشريح للباحثين بمعرفة ما يمكن توقعه عندما يرون الجان جزءا لا يتجزأ من نسيج الحيوان. بعد القتل الرحيم الحمار الوحشي الذكور، قطع رأس سمكة واحدة في وقت واحد مع مقص صغير ومن ثم استخدام مقص صغير لقطع على طول خط الوسط البطني لفضح تجويف الجسم.وضع الأسماك في طبق بيتري المغلفة السيليكون وتغطية من قبل بركة ضحلة من 1X PBS. تحت المجهر في التكبير 1.65X، تشريح الخصيات باستخدام ملقط. إزالة قدر الدهون والأنسجة المحيطة بها من الخصيات ممكن.سوف تظهر الخنة شفافة تحت ضوء نطاق تشريح بينما قد يكون الدهون المحيطة بمظهر أغمق قليلا. قد يتم ترك بعض الدهون على الزناد دون إعاقة الإجراء. إضافة كل الخصيتين تشريح مباشرة في أنبوب خمسة ملليلتر مع ملليلتر اثنين من DMEM والحفاظ على الجليد.لتفكك خلايا الخصية، إضافة 200 ميكرولترات من محلول الكولاجيناز إلى أنبوب المليلتر خمسة مع الخصيات. اخلطي الحل عن طريق عكسه عدة مرات. هز الخصيتيها برفق في حاضنة شاكر أفقياً عند 100 دورة في الدقيقة عند 32 درجة مئوية.عكس بسرعة أنبوب كل 10 دقائق لتسهيل تفكك. بعد ساعة، DMEM غائم والخصيتان في قطع صغيرة. في حين يتم احتضان الخصيتان في الكولاجيناز، قبل 100 ميكرولترات من 0.1 محلول السكروز الضرس إلى 37 درجة مئوية.لغسل الكولاجيناز، إضافة DMEM إلى حجم النهائي من خمسة ملليلتر وعكس الأنبوب عدة مرات. بيليه الخصيتين في 200 غرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة ثلاثة ملليلترات من عظمى بحيث تبقى فقط ملليلتر اثنين.كرر غسل DMEM مرتين إضافيتين. بعد غسل DMEM الماضي، وإزالة أربعة ملليلتر من عظمى وإضافة ملليلتر واحد من DMEM، 200 ميكرولترات من حل التربسين، و 20 ميكرولترات من الحل DNase I. عكس أنبوب عدة مرات لخلط الحل.هز أفقيا الأنبوب في 32 درجة مئوية في 100 دورة في الدقيقة. عكس أنبوب بسرعة كل خمس دقائق لتسهيل تفكك. بعد خمس إلى 15 دقيقة، يحتوي الحل DMEM على كتل قليلة فقط.إضافة 500 ميكرولترات من محلول مثبطات التربسين و 50 ميكرولترات من الحل DNase I. عكس أنبوب عدة مرات لخلط ثم تدور لفترة وجيزة أسفل في 200 غرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة السائل أو كتل التي قد تلتصق بغطاء أنبوب أو جانب الأنبوب. وضع أنبوب على الجليد وإعادة تعليق الخلية عن طريق الأنابيب مرارا وتكرارا صعودا وهبوطا مع ماصة نقل البلاستيك لمدة دقيقتين لتسهيل تفكك أي كتل المتبقية.تأكد من أن تعليق الخلية لا يذهب إلى لمبة من ماصة نقل. ثم قبل الرطب مصفاة خلية 100 ميكرون مع DMEM ووضعها على رأس أنبوب 50 ملليلتر على الجليد. نقل تعليق الخلية من خلال مصفاة قطرة واحدة في وقت واحد باستخدام ماصة نقل البلاستيك.نقل الترشيح باستخدام ماصة نقل البلاستيك إلى أنبوب جديد خمسة ملليلتر. تأكد من جمع الخلايا المجمعة المرفقة في الجانب السفلي من المرشح. إضافة DMEM في أنبوب إلى حجم النهائي من خمسة ملليلتر.بيليه الخلايا في 200 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة أكبر قدر من supernatant ممكن دون إزعاج بيليه وإضافة خمسة microliters من DNase أنا الحل مباشرة في بيليه. ثم اخلط البيليه مع محلول DNase I عن طريق كشط الجزء السفلي من الأنبوب من أربع إلى خمس مرات على طول رف أنبوب microcentrifuge فارغ.إضافة DMEM إلى حجم النهائي من خمسة ملليلتر وخلط الحل عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. بيليه تعليق الخلية في 200 غرام لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. تكرار العلاج DNase إضافية واحدة إلى ثلاث مرات حتى بيليه resuspended لا تكتل عند إضافة DMEM.بعد آخر تدور، وإزالة أكبر قدر من عظمى ممكن دون إزعاج بيليه. بعد ذلك، إضافة ملليلتر واحد من 1X PBS و resuspend بيليه عن طريق كشط بلطف الجزء السفلي الخارجي من الأنبوب على طول رف أنبوب فارغ. بيليه تعليق الخلية في 200 غرام لمدة خمس دقائق ثم إزالة أكبر قدر ممكن من اللقلق دون إزعاج بيليه.قطع ثلاثة ملليمترات من نهاية 200 ميكرولتر ماصة تلميح لتوسيع الفتحة. مع تلميح المقزة قطع، resuspend بيليه في 80 ميكرولترات من 0.1 محلول السكروز الضروس من قبل pipetting صعودا وهبوطا. دع تعليق الزنزانة يجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق.المقبل، مع طرف ماصة، معطف شريحة واحدة مع 100 ميكروليتر من 1٪ الفورمالديهايد مع 0.15٪ تريتون X-100. ثم إضافة 18 ميكرولترات من تعليق الخلية السكروز على وسط الشريحة في خط مستقيم عمودي على الحافة الطويلة. إمالة الشريحة ذهابا وإيابا لتسهيل انتشار تعليق الخلية إلى جميع الزوايا.ضع الشرائح مسطحة في غرفة رطوبة مفتوحة متصدعة قليلاً لمنع محلول الفورمالديهايد من التجفيف. ضع غرفة الرطوبة في درج مظلم بين عشية وضحاها. في الصباح، قم بإزالة الغطاء من غرفة الرطوبة والسماح للشرائح بالجفاف الكامل.ضع الشرائح في جرة كوبلين ثم املأ جرة الكوبلين بالماء المقطر. احتضان لمدة خمس دقائق مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة. صب الماء وملء جرة مع واحد إلى 250 وكيل التبول.اغسل مرتين لمدة خمس دقائق مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة. السماح للشرائح لتجف تماما وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية حتى أنها ملطخة. حدد هذا البروتوكول طريقة لإعداد وتصور انتشار الحيوانات المنوية ذات المحار الوحشي الذي ينتج نوات غير متداخلة بشكل جيد.تظهر اللوحات على اليسار ثلاث مراحل من الطور الظهاري، اللبوتين، الزيغوتين في وقت مبكر، وpachytene. كانت التيلوميرات ملطخة أرجواني لكل مرحلة. مثال على الفوارق ذات النوعية الرديئة بسبب عدم كفاية علاجات DNase I تظهر هنا.الكروموسومات Meiotic الملطخة لSYCP3 تشير إلى تداخل النوى بسبب تعليق خلية السكروز اللزجة التي تمنع الخلايا من الانتشار بشكل صحيح على الشريحة. من المهم جدا أن تبدأ مع المبلغ الصحيح من المواد بدءا، علاج الخصيصات حمار وحشي للحصول على كمية مناسبة من الوقت في التربسين، وتنفيذ العدد اللازم من العلاجات DNase I كما فشل في القيام بذلك يمكن أن يؤدي إلى عدد قليل جدا من النوى أو نواة تكتل. وينبغي دائماً ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند العمل مع الفورمالديهايد.بعد عملية الانتشار، يمكن أن تكون ملونة الكروموسومات لتصور مختلف هياكل الكروموسومات، فضلا عن فواصل حبلا مزدوج لتحليل اعتماد توقيت وتوطين الأحداث meiotic. وقد مهدت أسلوبنا الطريق لإظهار أن حمار وحشي قد يكون نموذجا أفضل من الحيوانات المنوية البشرية من الماوس على أساس ملامح الكروموسوم وباقة التيلومير.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

نموذج إعداد وتحليل البيانات التعبير الجيني على أساس رناسيق من الزرد

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

بيودوسيميتري الإشعاع المعجل الآلي تحديد الكروموسوم ديسينتريك (أدسي) وتقدير الجرعة

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

شرنا المجمعة الشاشة لإعادة تنشيط MeCP2 على كروموسوم X غير نشط

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

معالجات الجينوم الإدخال تسلسل إعداد مكتبة من عينة تارديجرادي واحد

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

استخراج الحمض النووي الفائق والتنميط 3dpf الزرد يرقات بالقطع Fin

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

نموذج ماوس غير عشوائي لأعاده تنشيط الدوائية من Mecp2 علي كروموسوم X غير نشط

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

تحديد جهات اتصال محسن-المروج في الأجسام الجنينية من خلال التقاط تثبيت الكروموسومات الكمية (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

فحص الكروموسومات للأجنة البشرية قبل الزرع باستخدام وسط الثقافة المستهلكة: جمع العينات وتحليل الصيغة الصبغية الكروموسومية

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

التقاط تشكل الكروموسوم عبر مقاييس الطول

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...