Name: preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Vi takker Trent Newman og Masuda Sharifi for kommentarer til manuskriptet og An Nguyen for at hjælpe med at optimere metoder til spredning og farvning kromosomer fra zebrafisk meiocytter. Dette arbejde blev støttet af NIH R01 GM079115 tildelt S.M.B.

Alle metoder, der involverede zebrafisk, blev udført ved hjælp af etiske standarder, der blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee hos UC Davis.
1. Kromosom spredning procedure
BEMÆRK: Følgende protokol er designet til at skabe 4-6 dias, med hundredvis af spredt meiotiske kerner pr dias. Antallet af anvendte testikler afhænger af fiskenes størrelse. Forvent at bruge 20 dyr på ~ 60 dage efter befrugtning (dpf) og 15 dyr på ~ 6 måneder efter ...

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li><li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks,+synapsis,+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).</li><li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish.">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li><li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+recombination+in+human+males.">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li><li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+studies+of+human+meiosis:+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at,+or+prior+to,+establishment+of+double-strand+breaks.">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075 (2013).</li><li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes.">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442 (2014).</li><li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male.">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Saito, K., Siegfried, K. R., N&#252;sslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants.">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li><li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+by+breaking+and+repairing:+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination.">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li><li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females.">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li><li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes.">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).</li><li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+chiasmata+and+interference.">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li><li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies.">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li><li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene.">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).</li></ol>

Her beskriver vi metoder til at sonde placeringen af telomerer og kromosom-associerede proteiner i nuklear overflade breder sig fra spermatocytter isoleret fra zebrafisk testikler. Vi forventer, at disse metoder vil være gældende for analyse af spermatocytter i andre teleostarter med tilpasning til testisstørrelse.
Mens kun et par antistoffer er blevet rejst til zebrafisk meiotiske proteiner, har vi haft succes med at bruge følgende antistoffer rejst til menneskelige (h) eller mus (m) prot...

Seksuel reproduktion fortsætter gennem kombinationen af to haploid gameter, der hver bærer halvdelen af kromosomkomplementet af en somatiske celle. Meiosis er en specialiseret celledivision, der producerer haploid gameter gennem en runde af DNA replikation og to på hinanden følgende runder af kromosom adskillelse. I profase I skal homologiske kromosomer (homologer) gennemgå parring, rekombination og synapsis, hvoraf sidstnævnte er karakteriseret ved dannelsen af synaptonemal komplekset, der består af to homologakser, der er brooveret af den tværgående glødetråd, Sycp1 (Figur 1A, B). Manglende korrekt udføre disse processer kan føre til produktion af aneuploid gameter, som er en førende årsag til aborter hos mennesker1. Vores viden om koordineringen mellem parring, rekombination og synapsis er blevet lettet af undersøgelser i en bred vifte af organismer, såsom gær, C. elegans, mus, og Drosophila, blandt andre2. Mens den generelle proces med homolog kromosom parring efterfulgt af adskillelse er godt bevaret, dens afhængighed af rekombination og synapsis og rækkefølgen af disse begivenheder varierer.
Meiotisk dobbelt-streng pause (DSB) dannelse, som indleder homologre rekombination, forekommer nær telomeres grupperet i buketten under leptotenog synapsis opstår kort efter3,4. Denne konfiguration af DSB dannelse og synapsis indledning er også et karakteristisk træk ved mandlig meiose hos mennesker, men ikke i mus5,6,7,8, tyder på, at zebrafisk kan tjene som model for menneskelige spermatogenese. Der er også flere praktiske fordele ved at studere zebrafisk meiose. Både mænd og kvinder gennemgår gametogenese gennem hele voksenalderen, deres gonader er let tilgængelige, og hundredvis af afkom genereres fra et enkelt kors. Desuden er embryonerne gennemsigtige og udvikler sig eksternt, hvilket letter tidlig påvisning af afvigelser i embryonal udvikling på grund af aneuploid kønsceller3,9. Ulemper ved at bruge zebrafisk er, at de er langsomme til at nå seksuel modenhed (~ 60 dage), og mængden af materiale, der er nødvendige for nukleare overflade spreads skal indsamles fra ~ 10-20 voksne dyr, afhængigt af deres størrelse.
Meiotiske kromosompræparater er et vigtigt redskab til at studere kromosomdynamik på tværs af alle modelorganismer, da centrale signaturer af meiotisk kromosomdynamik kan undersøges. I zebrafisk, centrale aspekter af udviklingen af det meiotiske program og nukleare organisation er blevet dissekeret gennem sondering nukleare overflade breder sig, benævnt her som kromosom spreads, med antistoffer til immunfluorescens påvisning af proteiner og / eller nukleinsyrer af FISH3,4,9,10,11,12. Faktisk kan den polariserede lokalisering af klyngede telomerer i buketten bevares i spredningen forberedelse (Figur 1C). For nylig har vi brugt zebrafisk spermatocyt kromosom breder sig sammen med fluorescens detektionsmetoder og superopløsning mikroskopi til at belyse den detaljerede progression af zebrafisk telomere dynamik, homolog kromosom parring, dobbelt-streng pause lokalisering, og synapsis på centrale meiotiske overgange3. Her præsenterer vi metoder til at forberede kromosomspreads fra spermatocytter af zebrafisk testiklerne og efterfølgende plette dem med fluorescerende peptid nukleinsyre (PNA) sonder til gentagne telomere sekvenser og immunfluorescens påvisning af kromosom tilknyttede proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde, methanol-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 mm glasscoverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>363696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bag</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Used to make plastic coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>203775-500uL</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-zfSycp1</td>
			<td>Generated by Burgess lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10014CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Two are required for dissecting the testes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89429-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11042</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-hDMC1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8973</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-3683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>230401V (Model 5420)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Model Classic C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimerbly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Used for the humidity chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hamsterSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hMLH1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550838</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hRPA</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>MABE285</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Alexa647</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1013</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Cy3</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRPA</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-244A</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150292</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRad51</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX100469</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercut Scissors, 30&#176; angle, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-822-353</td>
			<td>Can also use any pair of small scissors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9897184</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9253-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes

Meiosis er den vigtigste cellulære proces, der kræves for at skabe haploid gameter til seksuel reproduktion. Modelorganismer har været medvirkende til at forstå de kromosomhændelser, der finder sted under meiotiske profase, herunder parrings-, synapsis- og rekombinationshændelser, der sikrer korrekt kromosomadskillelse. Mens musen har været en vigtig model for at forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for disse processer, er det ikke alle meiotiske hændelser i dette system, der svarer til menneskelig meiose. Vi har for nylig vist zebrafiskens spændende potentiale som en model af human spermatogenese. Her beskriver vi i detaljer vores metoder til at visualisere meiotiske kromosomer og tilhørende proteiner i kromosomspredende præparater. Disse præparater har den fordel, at de tillader høj opløsningsanalyse af kromosomstrukturer. For det første beskriver vi proceduren for dissekere fra voksne zebrafisk, efterfulgt af celledissociation, lysis og spredning af kromosomerne. Dernæst beskriver vi proceduren for påvisning af lokalisering af meiotiske kromosomproteiner ved immunofluorescensdetektion og nukleinsyresekvenser ved fluorescens in situ hybridisering (FISH). Disse teknikker omfatter et nyttigt sæt værktøjer til cytologisk analyse af meiotisk kromatinarkitektur i zebrafisksystemet. Forskere i zebrafisk samfund bør være i stand til hurtigt at mestre disse teknikker og indarbejde dem i deres standard analyser af reproduktiv funktion.

Vi har skitseret en metode til at forberede og visualisere zebrafisk spermatocyt sprede præparater. Når den udføres korrekt, giver vores procedure godt spredt, ikke-overlappende kerner. For at genvinde sådanne kerner, er det vigtigt at have den passende mængde udgangsmateriale (dvs. testikler), behandle testikler i en tilstrækkelig lang tid i trypsin og et tilstrækkeligt antal DNase I behandlinger. Disse spreads kan derefter farves for telomerer og meiotiske proteiner til at studer...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Nukleare overflade spreads er et uundværligt redskab til at studere kromosom begivenheder under meiose. Her demonstrerer vi en metode til at forberede og visualisere meiotiske kromosomer under profase I fra zebrafisk spermatocytter.

Forberedelse af meiotiske kromosomspreads fra zebrafisk spermatocytter

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Zebrafisk fremstår som en fremragende hvirveldyr model for at studere kromosom begivenheder af meiose herunder homologe kromosom parring, synapsis og rekombination. Denne nukleare overflade spredning protokol har gjort det muligt for os at visualisere centrale funktioner i meiotiske kromosom arkitektur ved hjælp af super opløsning mikroskopi. Forskere kan forvente hundredvis af velspredning kerner pr dias med mindre snavs end andre zebrafisk sprede protokoller.Den mest teknisk udfordrende del af denne procedure er dissektion af zebrafisk testiklerne, da det er i nærheden af huden og er også knyttet til andre organer. Visualisering af dissektion procedure vil give forskerne mulighed for at vide, hvad de kan forvente, når de ser gonad indlejret i væv af dyret. Efter euthanizing mandlige zebrafisk, halshugge en fisk ad gangen med en lille saks og derefter bruge mikro saks til at skære langs ventrale midterlinjen at udsætte kroppen hulrum.Placer fisken i en silikone-belagt petriskål og dække ved en lavvandet pulje af 1X PBS. Under et mikroskop ved 1,65 X forstørrelse, dissekere testiklerne ved hjælp af kraftafføring. Fjern så meget fedt og omgivende væv fra testiklerne som muligt.Gonaden vises gennemskinnelig under dissektionsforekomst lyset, mens det omgivende fedt kan have et lidt mørkere udseende. En vis mængde fedt kan efterlades på gonad uden at hindre proceduren. Tilsæt hver dissekeret testikler direkte i en fem milliliter rør med to milliliter DMEM og holde på is.For at adskille testiklerne celler, tilsættes 200 mikroliter af kollagenase opløsning til de fem milliliter rør med testiklerne. Bland opløsningen ved at vende den flere gange. Ryst forsigtigt testiklerne i en inkubatorshaker vandret ved 100 omdr./min. ved 32 grader Celsius.Hurtigt vende røret hver 10 minutter for at lette dissociation. Efter en time er DMEM overskyet, og testiklerne er i små bidder. Mens testiklerne inkuberes i kollagenase, prewarm 100 mikroliter af 0,1 molar saccharose opløsning til 37 grader Celsius.For at vaske kollagenase, tilføje DMEM til et endeligt volumen på fem milliliter og vende røret et par gange. Pellet testiklerne ved 200 g i tre minutter ved stuetemperatur. Fjern tre milliliter af supernatanten, så der kun er to milliliter tilbage.DMEM-vasken gentages yderligere to gange. Efter den sidste DMEM vask fjernes fire milliliter af supernatanten og der tilsættes en milliliter DMEM, 200 mikroliter trypsinopløsning og 20 mikroliter DNase I-opløsning. Inverter røret et par gange for at blande opløsningen.Ryst røret vandret ved 32 grader Celsius ved 100 omdr./min. Hurtigt vende røret hvert femte minut for at lette dissociation. Efter fem til 15 minutter indeholder DMEM-opløsningen kun nogle få klumper.Der tilsættes 500 mikroliter af trypsinhæmmeropløsningen og 50 mikroliter DNase I-opløsning. Inverter røret et par gange for at blande derefter kort spin ned ved 200 g i tre minutter ved stuetemperatur for at fjerne væske eller klumper, der kan holde sig til rørhætten eller siden af røret. Rørret på is og opstimer cellesuspensionen ved gentagne gange at pipettere op og ned med en plastoverførselspipette i to minutter for at lette dissociation af eventuelle resterende klumper.Sørg for, at celleaffjedringen ikke går ind i pæren på overførselspipetten. Derefter pre-våd en 100 mikron celle si med DMEM og læg den oven på en 50 milliliter rør på is. Cellesuspensionen overføres gennem semnerne én dråbe ad gangen ved hjælp af en plastoverførselspipette.Filtratet overføres ved hjælp af en plastoverførselspipette til et nyt fem milliliterrør. Sørg for at indsamle de samlede celler, der er fastgjort til undersiden af filteret. DMEM i røret til et endeligt volumen på fem milliliter.Pellet cellerne ved 200 g i fem minutter ved stuetemperatur. Fjern så meget supernatant som muligt uden at forstyrre pellet og tilsæt fem mikroliter af DNase I opløsning direkte ind i pellet. Bland derefter pellet med DNase I opløsning ved forsigtigt skrabe ydersiden bunden af røret fire til fem gange langs en tom mikrocentrifuge rør rack.Dmem til et endeligt volumen på fem milliliter og bland opløsningen ved at vende røret flere gange. Pellet celle suspensionen ved 200 g i to minutter ved stuetemperatur. DNase-behandlingen gentages yderligere en til tre gange, indtil den opsbrugte pellet ikke klumper sig sammen ved tilsætning af DMEM.Efter det sidste spin fjernes så meget som supernatant som muligt uden at forstyrre pellet. Dernæst tilsættes en milliliter 1X PBS og opslænkning af pellet ved forsigtigt at skrabe den udvendige bund af røret langs en tom rørstativ. Pellet celle suspensionen ved 200 g i fem minutter og derefter fjerne så meget supernatant som muligt uden at forstyrre pellet.Skær tre millimeter fra slutningen af en 200 mikroliter pipette spids til at udvide blænden. Med den afskårne pipettespids skal pelletsen resuspendere pellet i 80 mikroliter af 0,1 molarsucroseopløsning ved pipettering op og ned. Lad celleaffjedringen sidde ved stuetemperatur i tre minutter.Dernæst med en pipettespids, frakke en slide med 100 mikroliter på 1% formaldehyd med 0,15% Triton X-100. Derefter tilsættes 18 mikroliter af saccharosecelleaffjedringen på midten af diaset i en lige linje vinkelret på den lange kant. Vip diaset frem og tilbage for at lette spredningen af cellesuspensionen til alle hjørner.Placer objektglassene fladt ned i et let revnet åbent fugtighedskammer for at forhindre formaldehydopløsningen i at tørre. Placer fugtighedskammeret i en mørk skuffe natten over. Tag låget ud af fugtighedskammeret om morgenen, og lad objektglassene tørre helt.Placer dias i en coplin krukke og derefter fylde coplin krukke med destilleret vand. Inkuber i fem minutter med forsigtig omrystning ved stuetemperatur. Hæld vandet ud og fyld krukken med en til 250 befugtningsmiddel.Vask to gange i fem minutter hver med forsigtig omrystning ved stuetemperatur. Lad objektglassene tørre helt og opbevares ved minus 20 grader Celsius, indtil de er plettet. Denne protokol skitseret en metode til at forberede og visualisere zebrafisk spermatocyt spredning, som giver velspredning ikke-overlappende kerner.Panelerne til venstre viser tre faser af meiotiske prophase, leptotene, tidlig zygotene, og pachytene. Telomeres blev farves magenta for hver fase. Et eksempel på dårlig kvalitet spreads på grund af utilstrækkelig DNase I behandlinger er vist her.Meiotiske kromosomer, der farves for SYCP3, indikerer overlappende kerner på grund af en tyktflydende saccharosecellesuspension, der forhindrer celler i at sprede sig korrekt på diaset. Det er meget vigtigt at starte med den korrekte mængde udgangsmateriale, behandle zebrafisk testikler for en passende mængde tid i trypsin, og udføre det nødvendige antal DNase I behandlinger som undladelse af at gøre det kan føre til meget få kerner eller klumpet kerner. Korrekt PV bør altid bæres, når der arbejdes med formaldehyd.Efter spredningsproceduren kan kromosomer farves for at visualisere forskellige kromosomstrukturer samt dobbelt-strand pauser til at analysere timing afhængighed og lokalisering af meiotiske begivenheder. Vores teknik har banet vejen for at vise, at zebrafisk kan være en bedre model af menneskelig spermatogenesis end mus baseret på kromosomfunktioner og telomere buket.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Forberedelse af prøver og analyser af RNASeq-baseret genekspression Data fra zebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Fremskyndet stråling Biodosimetry automatiseret ved Dicentric kromosom identifikation (ADCI) og dosis estimering

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Poolet shRNA skærmen for reaktivering af MeCP2 på det inaktive X kromosom

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow Input Genome Sequencing bibliotek forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøvemateriale

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Høj overførselshastighed DNA-ekstraktion og genotypebestemmelse af 3dpf zebrafisk larver af Fin klipning

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høj overførselshastighed identifikation af regulerende gensekvenser ved hjælp af næste generations sekventering af cirkulære kromosom kropsbygning Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

En ikke-tilfældig muse model for farmakologisk reaktivering af Mecp2 på inaktiv X-kromosom

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identifikation af forstærker-promotor kontakter i embryolede organer ved kvantitative kromosom kropsbygning Capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

Kromosomscreening af humane præimplantationsembryoner ved hjælp af brugt dyrkningsmedium: prøveindsamling og kromosomal ploidianalyse

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Indfangning af kromosomkonformation på tværs af længdeskalaer

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...