Name: preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Nous remercions Trent Newman et Masuda Sharifi pour leurs commentaires sur le manuscrit et An Nguyen pour avoir aidé à optimiser les méthodes de propagation et de coloration des chromosomes des méiocytes de poissons zèbres. Ce travail a été soutenu par NIH R01 GM079115 attribué à S.M.B.

Toutes les méthodes impliquant le poisson zèbre ont été effectuées en utilisant des normes éthiques approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’UC Davis.
1. Procédure d’épandage de chromosome
REMARQUE : Le protocole suivant est conçu pour créer 4-6 diapositives, avec des centaines de noyaux méiotiques de propagation par diapositive. Le nombre de testicules utilisés dépendra de la taille du poisson. Attendez-v...

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	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li><li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks,+synapsis,+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).</li><li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish.">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li><li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+recombination+in+human+males.">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li><li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+studies+of+human+meiosis:+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at,+or+prior+to,+establishment+of+double-strand+breaks.">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075 (2013).</li><li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes.">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442 (2014).</li><li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male.">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Saito, K., Siegfried, K. R., N&#252;sslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants.">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li><li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+by+breaking+and+repairing:+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination.">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li><li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females.">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li><li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes.">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).</li><li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+chiasmata+and+interference.">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li><li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies.">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li><li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene.">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).</li></ol>

Ici nous décrivons des méthodes pour sonder l’emplacement des télomères et des protéines chromosome-associées dans les écarts de surface nucléaire des spermatocytes isolés des testicules de poisson zèbre. Nous nous attendons à ce que ces méthodes soient applicables pour l’analyse des spermatozoïdes chez d’autres espèces de téléostéos avec ajustement à la taille du testicule.
Alors que seulement quelques anticorps ont été élevés aux protéines méiotiques de poisson ...

La reproduction sexuelle se poursuit par la combinaison de deux gamètes haploïdes, chacun portant la moitié du complément chromosomique d’une cellule somatique. La méiose est une division cellulaire spécialisée qui produit des gamètes haploïdes à travers une série de réplication de l’ADN et deux cycles successifs de ségrégation chromosomique. Dans la prophase I, les chromosomes homologues (homologs) doivent subir l’appariement, la recombinaison et la synapse, ce dernier étant caractérisé par la formation du complexe synaptonemal qui comprend deux axes homologués pontés par le filament transversal, Sycp1 (Figure 1A,B). Le défaut d’exécuter correctement ces processus peut conduire à la production de gamètes aneuploid, qui sont une cause principale de fausses couches chez l’homme1. Notre connaissance de la coordination entre l’appariement, la recombinaison et la synapse a été facilitée par des études dans un large éventail d’organismes, tels que la levure, C. elegans, la souris, et la drosophile, entre autres2. Tandis que le processus général de l’appariement homologue de chromosome suivi de la ségrégation est bien conservé, sa dépendance à la recombinaison et à la synapse et l’ordre de ces événements varie.
La formation de rupture à double brin méiotique (DSB), qui initie une recombinaison homologue, se produit près des télomères regroupés dans le bouquet pendant le leptotene et la synapse s’ensuit peu après3,4. Cette configuration de la formation de l’ASD et de l’initiation à la synapse est également une caractéristique de la méiose masculine chez l’homme, mais pas chez la souris5,6,7,8, suggérant que le poisson zèbre peut servir de modèle pour la spermatogénèse humaine. Il y a également plusieurs avantages pratiques d’étudier la méiose de poisson zèbre. Les mâles et les femelles subissent la gamétogenèse tout au long de l’âge adulte, leurs gonades sont facilement accessibles, et des centaines de descendants sont générés à partir d’une seule croix. En outre, les embryons sont transparents et se développent à l’extérieur, ce qui facilite la détection précoce des aberrations dans le développement embryonnaire en raison de gamètes aneuploides3,9. Les inconvénients de l’utilisation du poisson zèbre sont qu’ils sont lents à atteindre la maturité sexuelle (environ 60 jours) et la quantité de matière nécessaire pour les écarts de surface nucléaire doit être recueillie à partir d’animaux adultes de 10 à 20, selon leur taille.
Les préparations de propagation de chromosome méiotique sont un outil essentiel pour étudier la dynamique de chromosome à travers tous les organismes modèles, puisque les signatures clés de la dynamique méiotique de chromosome peuvent être sondées. Chez le poisson zèbre, les aspects clés de la progression du programme méiotique et de l’organisation nucléaire ont été disséqués par le biais de l’enquête sur les propagations de surface nucléaire, appelées ici les propagations chromosomiques, avec des anticorps pour la détection d’immunofluorescence des protéines et/ou des acides nucléiques par FISH3,4,9,10,11,12. En effet, la localisation polarisée des télomères groupés dans le bouquet peut être préservée dans la préparation de la propagation (Figure 1C). Récemment, nous avons utilisé des propagations du chromosome spermatocyte du poisson zèbre ainsi que des méthodes de détection de fluorescence et de microscopie à super résolution pour élucider la progression détaillée de la dynamique des télomères du poisson zèbre, de l’appariement chromosomique homologue, de la localisation des ruptures à double brin et de la synapse lors des transitions méiotiques clés3. Ici nous présentons des méthodes pour préparer des écarts de chromosome des spermatocytes des testicules de poisson zèbre et par la suite les tacher avec des sondes fluorescentes d’acide nucléique de peptide (PNA) aux séquences répétées de telomere et à la détection d’immunofluorescence des protéines associées de chromosome.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde, methanol-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 mm glasscoverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>363696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bag</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Used to make plastic coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>203775-500uL</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-zfSycp1</td>
			<td>Generated by Burgess lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10014CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Two are required for dissecting the testes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89429-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11042</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-hDMC1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8973</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-3683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>230401V (Model 5420)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Model Classic C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimerbly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Used for the humidity chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hamsterSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hMLH1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550838</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hRPA</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>MABE285</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Alexa647</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1013</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Cy3</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRPA</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-244A</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150292</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRad51</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX100469</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercut Scissors, 30&#176; angle, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-822-353</td>
			<td>Can also use any pair of small scissors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9897184</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9253-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes

La méiose est le processus cellulaire clé nécessaire pour créer des gamètes haploïdes pour la reproduction sexuelle. Les organismes modèles ont joué un rôle déterminant dans la compréhension des événements chromosomiques qui ont lieu pendant la prophase méiotique, y compris les événements d’appariement, de synapse et de recombinaison qui assurent une ségrégation chromosomique appropriée. Bien que la souris ait été un modèle important pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces processus, tous les événements méiotiques de ce système ne sont pas analogues à la méiose humaine. Nous avons récemment démontré le potentiel passionnant du poisson zèbre comme modèle de spermatogénèse humaine. Ici nous décrivons, en détail, nos méthodes pour visualiser les chromosomes méiotiques et les protéines associées dans les préparations de propagation de chromosome. Ces préparations ont l’avantage de permettre l’analyse à haute résolution des structures chromosomiques. Tout d’abord, nous décrivons la procédure pour disséquer des testicules du poisson zèbre adulte, suivi de la dissociation cellulaire, de la lyse, et de la diffusion des chromosomes. Ensuite, nous décrivons la procédure pour détecter la localisation des protéines méiotiques de chromosome, par détection d’immunofluorescence, et séquences d’acide nucléique, par hybridation in situ de fluorescence (FISH). Ces techniques constituent un ensemble utile d’outils pour l’analyse cytologique de l’architecture de la chromatine méiotique dans le système de poisson zèbre. Les chercheurs de la communauté des poissons zèbres devraient être en mesure de maîtriser rapidement ces techniques et de les intégrer dans leurs analyses standard de la fonction reproductrice.

Nous avons décrit une méthode pour préparer et visualiser les préparations de propagation de spermatocyte salèbre. Lorsqu’elle est exécutée correctement, notre procédure donne des noyaux bien répartis et non superposés. Pour récupérer de tels noyaux, il est important d’avoir la quantité appropriée de matériel de démarrage (c.-à-d. les testicules), traiter les testicules pour une durée suffisante dans la trypsine et un nombre suffisant de traitements DNase I. Ces tart...

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Les écarts de surface nucléaires sont un outil indispensable pour étudier les événements chromosomiques pendant la méiose. Ici nous démontrons une méthode pour préparer et visualiser des chromosomes méiotiques pendant la prophase I des spermatocytes de poisson zèbre.

Préparation des propagations méiotiques de chromosome des spermatocytes de poisson-zèbre

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Zebrafish émerge comme un excellent modèle vertébré pour étudier les événements chromosomiques de la méiose, y compris l’appariement des chromosomes homologues, la synapse et la recombinaison. Ce protocole de propagation de surface nucléaire nous a permis de visualiser les caractéristiques clés de l’architecture chromosomique méiotique à l’aide d’une microscopie à super résolution. Les chercheurs peuvent s’attendre à des centaines de noyaux bien répandus par toboggan avec moins de débris que les autres protocoles de propagation du poisson zèbre.La partie la plus difficile techniquement de cette procédure est la dissection des testicules de poisson zèbre car il est à proximité de la peau et est également attaché à d’autres organes. La visualisation de la procédure de dissection permettra aux chercheurs de savoir à quoi s’attendre lorsqu’ils verront la gonad encastrée dans le tissu de l’animal. Après avoir euthanasié le poisson zèbre mâle, décapiter un poisson à la fois avec de petits ciseaux, puis utiliser des micro ciseaux pour couper le long de la ligne médiane ventrale pour exposer la cavité corporelle.Placer le poisson dans une boîte de Pétri recouverte de silicone et couvrir d’une piscine peu profonde de 1X PBS. Au microscope à 1,65 X grossissement, disséquer les testicules à l’aide de forceps. Retirez autant que possible la graisse et les tissus environnants des testicules.La médina apparaîtra translucide sous la lumière de portée de dissection tandis que la graisse environnante peut avoir un aspect légèrement plus foncé. Une certaine quantité de graisse peut être laissée sur la 9ed sans encrager la procédure. Ajouter chaque testicules disséqués directement dans un tube de cinq millilitres avec deux millilitres de DMEM et garder sur la glace.Pour dissocier les cellules des testicules, ajouter 200 microlitres de solution de collagène au tube de cinq millilitres avec les testicules. Mélangez la solution en l’inversant plusieurs fois. Secouez doucement les testicules dans un shaker d’incubateur horizontalement à 100 RPM à 32 degrés Celsius.Inversez rapidement le tube toutes les 10 minutes pour faciliter la dissociation. Après une heure, le DMEM est nuageux et les testicules sont en petits morceaux. Tandis que les testicules sont incubés dans le collagène, avant-guerre 100 microlitres de solution de saccharose molaire de 0,1 à 37 degrés Celsius.Pour laver la collagène, ajouter le DMEM à un volume final de cinq millilitres et inverser le tube à quelques reprises. Pelleter les testicules à 200 g pendant trois minutes à température ambiante. Retirez trois millilitres du supernatant de sorte qu’il ne reste que deux millilitres.Répétez le lavage DMEM deux fois de plus. Après le dernier lavage DMEM, retirez quatre millilitres du supernatant et ajoutez un millilitre de DMEM, 200 microlitres de solution trypsine et 20 microlitres de solution DNase I. Inverser le tube à quelques reprises pour mélanger la solution.Secouez horizontalement le tube à 32 degrés Celsius à 100 RPM. Inversez rapidement le tube toutes les cinq minutes pour faciliter la dissociation. Après cinq à 15 minutes, la solution DMEM ne contient que quelques touffes.Ajoutez 500 microlitres de la solution inhibiteur de la trypsine et 50 microlitres de solution DNase I. Inverser le tube à quelques reprises pour mélanger puis tourner brièvement vers le bas à 200 g pendant trois minutes à température ambiante pour enlever le liquide ou les touffes qui peuvent adhérer au bouchon du tube ou le côté du tube. Placez le tube sur la glace et réutilisez la suspension cellulaire en évadant de haut en bas à plusieurs reprises avec une pipette de transfert en plastique pendant deux minutes pour faciliter la dissociation des touffes restantes.Assurez-vous que la suspension cellulaire n’entre pas dans l’ampoule de la pipette de transfert. Ensuite, pré-mouiller une passoire cellulaire de 100 microns avec DMEM et le placer sur le dessus d’un tube de 50 millilitres sur la glace. Transférer la suspension cellulaire à travers la passoire une goutte à la fois à l’aide d’une pipette de transfert en plastique.Transférer le filtrate à l’aide d’une pipette de transfert en plastique dans un nouveau tube de cinq millilitres. Assurez-vous de recueillir les cellules poolées fixées à la face inférieure du filtre. Ajouter DMEM dans le tube à un volume final de cinq millilitres.Pelleter les cellules à 200 g pendant cinq minutes à température ambiante. Enlever autant de supernatant que possible sans déranger la pastille et ajouter cinq microlitres de solution DNase I directement dans la pastille. Mélangez ensuite la pastille avec la solution DNase I en raclant doucement le fond extérieur du tube quatre à cinq fois le long d’une grille de tube de microcentrifugeuse vide.Ajoutez DMEM à un volume final de cinq millilitres et mélangez la solution en inversant le tube plusieurs fois. Pelleter la suspension cellulaire à 200 g pendant deux minutes à température ambiante. Répétez le traitement DNase une à trois fois de plus jusqu’à ce que la pastille résuspendée ne s’agglutine pas à l’ajout de DMEM.Après le dernier tour, retirer autant que possible le surnatant sans déranger la pastille. Ensuite, ajoutez un millilitre de 1X PBS et résuspendez la pastille en raclant doucement le fond extérieur du tube le long d’une grille à tube vide. Pelleter la suspension cellulaire à 200 g pendant cinq minutes, puis enlever autant de supernatant que possible sans déranger la pastille.Couper trois millimètres à partir de l’extrémité d’une pointe de pipette de 200 microlitres pour élargir l’ouverture. Avec la pointe de pipette coupée, resuspendez la pastille dans 80 microlitres de solution de saccharose molaire de 0,1 par pipetting de haut en bas. Laissez reposer la suspension cellulaire à température ambiante pendant trois minutes.Ensuite, avec une pointe de pipette, enduire une diapositive de 100 microlitres de 1% de formaldéhyde avec 0,15%Triton X-100. Ajouter ensuite 18 microlitres de la suspension de cellules saccharose sur le centre de la glissière en ligne droite perpendiculaire au long bord. Inclinez la glissière d’avant en arrière pour faciliter la propagation de la suspension cellulaire à tous les coins.Placez les glissières à plat dans une chambre d’humidité ouverte légèrement fissurée pour empêcher la solution de formaldéhyde de sécher. Placez la chambre d’humidité dans un tiroir sombre pendant la nuit. Le matin, retirez le couvercle de la chambre d’humidité et laissez sécher complètement les glissières.Placez les glissières dans un bocal de coplin, puis remplissez le pot de coplin d’eau distillée. Incuber pendant cinq minutes avec des secousses douces à température ambiante. Verser l’eau et remplir le bocal d’un à 250 agents mouillants.Lavez-les deux fois pendant cinq minutes chacun avec des secousses douces à température ambiante. Laissez sécher complètement les glissières et conservez-les à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient tachées. Ce protocole décrit une méthode pour préparer et visualiser la propagation des spermatozoïdes du poisson zèbre qui donne des noyaux non superposés bien répandus.Les panneaux sur la gauche montrent trois étapes de prophase méiotique, leptotene, zygotène tôt, et pachytene. Les télomères étaient des magenta tachés pour chaque étape. Un exemple de propagations de mauvaise qualité en raison de traitements DNase I insuffisants sont montrés ici.Les chromosomes méiotiques tachés pour SYCP3 indiquent des noyaux qui se chevauchent en raison d’une suspension visqueuse des cellules saccharose qui empêche les cellules de se propager correctement sur la lame. Il est très important de commencer avec la quantité correcte de matériel de départ, traiter les testicules de poisson zèbre pour la quantité appropriée de temps dans la trypsine, et d’effectuer le nombre nécessaire de traitements DNase I que l’échec de le faire peut conduire à très peu de noyaux ou de noyaux agglutinés. Le PPE approprié doit toujours être porté en travaillant avec le formaldéhyde.Après la procédure de propagation, les chromosomes peuvent être tachés pour visualiser diverses structures chromosomiques ainsi que des ruptures à double brin pour analyser la dépendance au moment et la localisation des événements méiotiques. Notre technique a ouvert la voie pour montrer que le poisson zèbre peut être un meilleur modèle de spermatogenèse humaine que la souris basée sur les caractéristiques chromosomiques et le bouquet de télomères.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Préparation des échantillons et l’analyse des données sur l’Expression génique à base RNASeq de poisson-zèbre

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Recherche

Génétique

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

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Rayonnement accéléré biodosimétrie automatisé par Identification des chromosomes dicentriques (ADCI) et l’Estimation de la Dose

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

ShARN regroupée écran pour la réactivation de MeCP2 sur le Chromosome X inactif

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultra basse génome d’entrée séquençage bibliothèque préparation à partir d’un seul spécimen Tardigrade

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High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Extraction d’ADN de haut débit et le génotypage des larves de poisson zèbre 3dpf de découpage Fin

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput Identification des séquences régulatrices du gène à l’aide de prochaine génération séquençage du Chromosome circulaire Conformation Capture (4C-seq)

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Un modèle de souris non aléatoire pour la réactivation pharmacologique de Mecp2 sur le chromosome X inactif

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identification des contacts Enhancer-Promoteur dans les corps embryonnaires par capture quantitative de conformation des chromosomes (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

Criblage chromosomique d’embryons humains préimplantatoires à l’aide de milieux de culture épuisés : prélèvement d’échantillons et analyse de la ploïdie chromosomique

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

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