Name: preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00
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Wir danken Trent Newman und Masuda Sharifi für ihre Kommentare zum Manuskript und An Nguyen für ihre Hilfe bei der Optimierung von Methoden zur Verbreitung und Färbung von Chromosomen aus Zebrafisch-Meiocyten. Diese Arbeit wurde von NIH R01 GM079115 an S.M.B.

Alle Methoden, die Zebrafische betreffen, wurden nach ethischen Standards durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der UC Davis genehmigt wurden.
1. Chromosomenausbreitungsverfahren
HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde entwickelt, um 4-6 Dias mit Hunderten von verteilten meiotischen Kernen pro Folie zu erstellen. Die Anzahl der verwendeten Hoden hängt von der Größe der Fische ab. Erwarten Sie, 20 Tiere bei 60 Tagen nach der Befruchtung (d...

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	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li><li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks,+synapsis,+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).</li><li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish.">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li><li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+recombination+in+human+males.">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li><li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+studies+of+human+meiosis:+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at,+or+prior+to,+establishment+of+double-strand+breaks.">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075 (2013).</li><li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes.">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442 (2014).</li><li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male.">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Saito, K., Siegfried, K. R., N&#252;sslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants.">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li><li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+by+breaking+and+repairing:+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination.">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li><li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females.">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li><li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes.">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).</li><li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+chiasmata+and+interference.">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li><li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies.">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li><li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene.">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).</li></ol>

Hier beschreiben wir Methoden zur Untersuchung der Lage von Telomeren und chromosomassoziierten Proteinen in nuklearen Oberflächenausbreitungen aus Spermatozyten, die aus Zebrafischhoden isoliert sind. Wir erwarten, dass diese Methoden für die Analyse von Spermatozyten in anderen Teleostarten mit Anpassung an die Größe der Hoden anwendbar sein werden.
Während nur wenige Antikörper zu meiotischen Proteinen von Zebrafischen erhoben wurden, hatten wir Erfolg mit den folgenden Antikörpern, ...

Die sexuelle Fortpflanzung erfolgt durch die Kombination zweier haploider Gameten, die jeweils die Hälfte des Chromosoms einer somatischen Zelle tragen. Meiose ist eine spezialisierte Zellteilung, die haploide Gameten durch eine Runde DNA-Replikation und zwei aufeinander folgende Runden der Chromosomensegregation produziert. In proPhase I müssen homologe Chromosomen (Homologe) paarwerden, rekombinieren und synapsisieren, wobei letztere durch die Bildung des synaptonemalen Komplexes gekennzeichnet ist, der zwei Homologachsen umfasst, die durch das Querfilament, Sycp1 (Abbildung 1A,B) überbrückt werden. Wenn diese Prozesse nicht ordnungsgemäß ausgeführt werden, kann dies zur Produktion von aneuploiden Gameten führen, die eine der Hauptursachen für Fehlgeburten beim Menschen sind1. Unser Wissen über die Koordination zwischen Paarung, Rekombination und Synapse wurde durch Studien in einer Vielzahl von Organismen, wie Hefe, C. elegans,Maus und Drosophila,unter anderem2erleichtert. Während der allgemeine Prozess der homologen Chromosomenpaarung, gefolgt von Segregation, gut konserviert ist, variiert seine Abhängigkeit von Rekombination und Synapse und die Reihenfolge dieser Ereignisse.
Meiotische Doppelstrangbruchbildung (DSB), die eine homologe Rekombination initiiert, tritt in der Nähe von Telomere auf, die während Leptotene im Bouquet gebündelt sind, und Synapse folgt kurz nach3,4. Diese Konfiguration der DSB-Bildung und Synapsis-Initiation ist auch ein Merkmal der männlichen Meiose beim Menschen, aber nicht in Maus5,6,7,8, was darauf hindeutet, dass Zebrafische als Modell für die menschliche Spermatogenese dienen können. Es gibt auch mehrere praktische Vorteile des Studiums Zebrafisch Meiose. Sowohl Männchen als auch Weibchen durchlaufen Gametogenese während des gesamten Erwachsenenalters, ihre Gonaden sind leicht zugänglich, und Hunderte von Nachkommen werden aus einem einzigen Kreuz erzeugt. Darüber hinaus sind die Embryonen transparent und entwickeln sich extern, was die Früherkennung von Aberrationen in der embryonalen Entwicklung durch aneuploide Gameten3,9erleichtert. Nachteile der Verwendung von Zebrafischen sind, dass sie langsam die Geschlechtsreife erreichen (ca. 60 Tage) und die Menge an Material, das für nukleare Oberflächenausbreitungen benötigt wird, muss von 10-20 erwachsenen Tieren gesammelt werden, abhängig von ihrer Größe.
Meiotische Chromosomenausbreitungspräparate sind ein wichtiges Werkzeug, um die Chromosomendynamik über alle Modellorganismen hinweg zu untersuchen, da Schlüsselsignaturen der meiotischen Chromosomendynamik untersucht werden können. Bei Zebrafischen wurden Schlüsselaspekte des Fortschreitens des meiotischen Programms und der nuklearen Organisation durch die Sondierung von nuklearen Oberflächenausbreitungen, hier als Chromosomausbreitung bezeichnet, mit Antikörpern zum Immunfluoreszenznachweis von Proteinen und/oder Nukleinsäuren durch FISH3,4,9,10,11,12seziert. Tatsächlich kann die polarisierte Lokalisierung von gruppierten Telomere im Bouquet in der Ausbreitungszubereitung erhalten bleiben (Abbildung 1C). Kürzlich haben wir Zebrafisch-Spermatozyten-Chromosom-Spreads zusammen mit Fluoreszenz-Detektionsmethoden und superhochauflösender Mikroskopie verwendet, um das detaillierte Fortschreiten der Zebrafisch-Telomer-Dynamik, homologen Chromosomenpaarung, Doppelstrang-Break-Lokalisierung und Synapsen an wichtigen meiotischen Übergängen3zu klären. Hier stellen wir Methoden zur Vorbereitung von Chromosomenausbreitungen aus Spermatozyten der Zebrafischhoden vor und färben sie anschließend mit fluoreszierenden Peptidnukleinsäure-Sonden (PNA) zu wiederholten Telomersequenzen und Immunfluoreszenznachweis von Chromosomen-assoziierten Proteinen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde, methanol-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 mm glasscoverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>363696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bag</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Used to make plastic coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>203775-500uL</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-zfSycp1</td>
			<td>Generated by Burgess lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10014CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Two are required for dissecting the testes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89429-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11042</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-hDMC1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8973</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-3683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>230401V (Model 5420)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Model Classic C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimerbly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Used for the humidity chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hamsterSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hMLH1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550838</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hRPA</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>MABE285</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Alexa647</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1013</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Cy3</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRPA</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-244A</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150292</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRad51</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX100469</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercut Scissors, 30&#176; angle, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-822-353</td>
			<td>Can also use any pair of small scissors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9897184</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9253-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes

Meiose ist der wichtigste zelluläre Prozess erforderlich, um haploide Gameten für die sexuelle Reproduktion zu erstellen. Modellorganismen haben entscheidend dazu beigetragen, die Chromosomenereignisse zu verstehen, die während der meiotischen Prophase stattfinden, einschließlich der Paarungs-, Synapsen- und Rekombinationsereignisse, die eine korrekte Chromosomensegregation gewährleisten. Während die Maus ein wichtiges Modell für das Verständnis der molekularen Mechanismen war, die diesen Prozessen zugrunde liegen, sind nicht alle meiotischen Ereignisse in diesem System analog zur menschlichen Meiose. Kürzlich haben wir das spannende Potenzial des Zebrafisches als Modell der menschlichen Spermatogenese demonstriert. Hier beschreiben wir detailliert unsere Methoden zur Visualisierung meiotischer Chromosomen und zugehöriger Proteine in Chromosomenausbreitungspräparaten. Diese Präparate haben den Vorteil, dass eine hochauflösende Analyse von Chromosomenstrukturen möglich ist. Zunächst beschreiben wir das Verfahren zur Zersebung von Hoden von erwachsenen Zebrafischen, gefolgt von Zelldissoziation, Lyse und Verbreitung der Chromosomen. Als Nächstes beschreiben wir das Verfahren zum Nachweis der Lokalisation von meiotischen Chromosomenproteinen durch Immunfluoreszenznachweis und Nukleinsäuresequenzen durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). Diese Techniken umfassen eine nützliche Reihe von Werkzeugen für die zytologische Analyse der meiotischen Chromatin-Architektur im Zebrafischsystem. Forscher in der Zebrafischgemeinschaft sollten in der Lage sein, diese Techniken schnell zu beherrschen und in ihre Standardanalysen der Fortpflanzungsfunktion zu integrieren.

Wir haben eine Methode zur Vorbereitung und Visualisierung von Zebrafisch Spermatozyten-Spread-Präparate skizziert. Bei korrekter Durchgeführte ergibt unser Verfahren gut verteilte, nicht überlappende Kerne. Um solche Kerne zurückzugewinnen, ist es wichtig, die entsprechende Menge an Ausgangsmaterial (d.h. Hoden), Hoden für eine ausreichende Dauer in Trypsin und eine ausreichende Anzahl von DNase I Behandlungen zu behandeln. Diese Aufstriche können dann für Telomere und meiotische ...

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Nukleare Oberflächenausbreitungen sind ein unverzichtbares Werkzeug, um Chromosomenereignisse während der Meiose zu untersuchen. Hier zeigen wir eine Methode zur Vorbereitung und Visualisierung meiotischer Chromosomen während der Prophase I aus Zebrafisch-Spermatozyten.

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Zebrafisch entwickelt sich zu einem ausgezeichneten Wirbeltiermodell für die Untersuchung der Chromosomenereignisse der Meiose einschließlich homologer Chromosomenpaarung, Synapsis und Rekombination. Dieses Protokoll zur Verbreitung nuklearer Oberflächen hat es uns ermöglicht, die wichtigsten Merkmale der meiotischen Chromosomenarchitektur mithilfe der Superauflösungsmikroskopie zu visualisieren. Forscher können Hunderte von gut verteilten Kernen pro Rutsche mit weniger Schutt als andere Zebrafisch-Verbreitungprotokolle erwarten.Der technisch anspruchsvollste Teil dieses Verfahrens ist die Zerlegung der Zebrafischhoden, da sie sich in unmittelbarer Nähe zur Haut befinden und auch an anderen Organen befestigt sind. Die Visualisierung des Sezierverfahrens ermöglicht es den Forschern zu wissen, was sie erwartet, wenn sie die Imobaden im Gewebe des Tieres eingebettet sehen. Nach der Einschläferne männlicher Zebrafische enthaupten Sie einen Fisch nach dem anderen mit einer kleinen Schere und verwenden Sie dann eine Mikroschere, um entlang der ventralen Mittellinie zu schneiden, um die Körperhöhle freizulegen.Legen Sie den Fisch in eine silikonbeschichtete Petrischale und decken Sie ihn mit einem flachen Pool von 1X PBS ab. Unter einem Mikroskop bei 1,65-facher Vergrößerung sezieren Sie die Hoden mit Zangen. Entfernen Sie so viel wie Fett und umgebendes Gewebe aus den Hoden wie möglich.Die Gonade erscheint lichtdurchlässig unter dem Sezierbereich, während das umgebende Fett ein etwas dunkleres Aussehen haben kann. Einige Menge an Fett kann auf der Gonade gelassen werden, ohne das Verfahren zu behindern. Fügen Sie jeden sezierten Hoden direkt in eine Fünf-Milliliter-Röhre mit zwei Milliliter DMEM und halten Sie auf Eis.Um die Hodenzellen zu dissoziieren, fügen Sie 200 Mikroliter Kollagenaselösung mit den Hoden in die Fünf-Milliliter-Röhre ein. Mischen Sie die Lösung, indem Sie sie mehrmals invertieren. Schütteln Sie die Hoden in einem Inkubator-Shaker bei 100 Umdrehungen bei 32 Grad Celsius vorsichtig.Schnell es alle 10 Minuten invertieren, um die Dissoziation zu erleichtern. Nach einer Stunde ist das DMEM trüb und die Hoden sind in kleinen Brocken. Während die Hoden in Kollagennase inkubiert werden, vorwärmen 100 Mikroliter 0,1 Molar Saccharose Lösung auf 37 Grad Celsius.Um die Kollagenase auszuwaschen, fügen Sie DMEM zu einem Endvolumen von fünf Millilitern hinzu und invertieren Sie das Rohr ein paar Mal. Pellet die Hoden bei 200 g für drei Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie drei Milliliter des Überstandes, so dass nur noch zwei Milliliter übrig bleiben.Wiederholen Sie die DMEM-Wäsche zwei weitere Male. Nach der letzten DMEM-Wäsche vier Milliliter des Überstandes entfernen und einen Milliliter DMEM, 200 Mikroliter Trypsinlösung und 20 Mikroliter DNase I-Lösung hinzufügen. Invertieren Sie das Rohr ein paar Mal, um die Lösung zu mischen.Schütteln Sie das Rohr bei 32 Grad Celsius bei 100 U/min horizontal. Schnell es alle fünf Minuten invertieren, um die Dissoziation zu erleichtern. Nach fünf bis 15 Minuten enthält die DMEM-Lösung nur wenige Klumpen.Fügen Sie 500 Mikroliter der Trypsin-Inhibitor-Lösung und 50 Mikroliter DNase I-Lösung hinzu. Invertieren Sie das Rohr ein paar Mal zu mischen, dann kurz drehen Sie sich bei 200 g für drei Minuten bei Raumtemperatur, um Flüssigkeit oder Klumpen zu entfernen, die an der Rohrkappe oder der Seite des Rohres haften können. Legen Sie das Rohr auf Eis und setzen Sie die Zellsuspension wieder auf, indem Sie wiederholt mit einer Kunststoff-Transferpipette für zwei Minuten nach oben und unten pfeifen, um die Dissoziation aller verbleibenden Klumpen zu erleichtern.Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension nicht in die Glühbirne der Transferpipette gelangt. Dann ein 100-Mikron-Zellsieb mit DMEM vorbefeuchten und auf eine 50-Milliliter-Röhre auf Eis legen. Übertragen Sie die Zellsuspension durch das Sieb einen Tropfen nach dem anderen mit einer Kunststoff-Transferpipette.Übertragen Sie das Filtrat mit einer Kunststoff-Transferpipette in ein neues Fünf-Milliliter-Rohr. Achten Sie darauf, die gepoolten Zellen zu sammeln, die an der Unterseite des Filters befestigt sind. DMEM in die Röhre zu einem Endvolumen von fünf Millilitern geben.Pellet die Zellen bei 200 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören und fügen Sie fünf Mikroliter DNase I Lösung direkt in das Pellet. Mischen Sie dann das Pellet mit der DNase I Lösung, indem Sie den äußeren Boden des Rohres vier- bis fünfmal entlang eines leeren Mikrozentrifugenrohrträgers vorsichtig kratzen.Fügen Sie DMEM zu einem Endvolumen von fünf Millilitern hinzu und mischen Sie die Lösung, indem Sie das Rohr mehrmals invertieren. Pellet die Zellsuspension bei 200 g für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie die DNase-Behandlung ein bis drei Mal zusätzlich, bis das resuspendierte Pellet nach Zugabe von DMEM nicht verklumpt.Entfernen Sie nach der letzten Drehung so viel wie möglich, ohne das Pellet zu stören. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter 1X PBS hinzu und setzen Sie das Pellet wieder auf, indem Sie den äußeren Boden des Rohres entlang eines leeren Rohrgestells vorsichtig kratzen. Pellet die Zellsuspension bei 200 g für fünf Minuten und dann entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören.Schneiden Sie drei Millimeter vom Ende einer 200 Mikroliter Pipettenspitze, um die Blende zu verbreitern. Mit der geschnittenen Pipettenspitze das Pellet in 80 Mikrolitern 0,1 Molar-Saccharoselösung durch Pipettieren nach oben und unten wieder aufhängen. Lassen Sie die Zellaufhängung drei Minuten bei Raumtemperatur sitzen.Als nächstes, mit einer Pipette Spitze, beschichten Sie einen Schlitten mit 100 Mikroliter 1%Formaldehyd mit 0.15%Triton X-100. Dann fügen Sie 18 Mikroliter der Saccharosezellsuspension auf die Mitte der Rutsche in einer geraden Linie senkrecht zur langen Kante. Neigen Sie die Folie hin und her, um die Ausbreitung der Zellsuspension auf alle Ecken zu erleichtern.Legen Sie die Dias flach in eine leicht rissige offene Feuchtigkeitskammer, um das Trocknen der Formaldehydlösung zu verhindern. Legen Sie die Feuchtigkeitskammer über Nacht in eine dunkle Schublade. Am Morgen den Deckel aus der Feuchtigkeitskammer entfernen und die Rutschen vollständig trocknen lassen.Legen Sie die Dias in ein Coplin-Glas und füllen Sie dann das Coplin-Glas mit destilliertem Wasser. Fünf Minuten mit sanftem Schütteln bei Raumtemperatur inkubieren. Gießen Sie das Wasser aus und füllen Sie das Glas mit einem bis 250 Benetzungsmittel.Zwei Mal für jeweils fünf Minuten mit sanftem Schütteln bei Raumtemperatur waschen. Lassen Sie die Rutschen vollständig trocknen und lagern Sie bei minus 20 Grad Celsius, bis sie gebeizt sind. Dieses Protokoll skizzierte eine Methode zur Vorbereitung und Visualisierung der Spermatozytenausbreitung von Zebrafischen, die gut verteilte, nicht überlappende Kerne hervorbringt.Die Panels auf der linken Seite zeigen drei Stufen von meiotischer Prophase, Leptotene, frühes Zygoten und Pachytene. Telomere waren für jede Stufe magentagefärbt. Ein Beispiel für schlechte Qualität Spreads aufgrund unzureichender DNase I Behandlungen werden hier gezeigt.Meiotische Chromosomen, die für SYCP3 gebeizt werden, deuten auf überlappende Kerne aufgrund einer viskosen Saccharosezellsuspension hin, die verhindert, dass sich Zellen auf dem Dia richtig ausbreiten. Es ist sehr wichtig, mit der richtigen Menge an Ausgangsmaterial zu beginnen, Zebrafischhoden für die entsprechende Zeit in Trypsin zu behandeln und die notwendige Anzahl von DNase-I-Behandlungen durchzuführen, da dies nicht zu sehr wenigen Kernen oder verklumpten Kernen führen kann. Bei der Arbeit mit Formaldehyd sollte immer die richtige PSA getragen werden.Im Anschluss an das Verbreitungsverfahren können Chromosomen gefärbt werden, um verschiedene Chromosomenstrukturen sowie Doppelstrangbrüche zu visualisieren, um die zeitliche Abhängigkeit und Lokalisierung meiotischer Ereignisse zu analysieren. Unsere Technik hat den Weg geebnet, um zu zeigen, dass Zebrafische ein besseres Modell der menschlichen Spermatogenese sein können als Maus basierend auf den Chromosomenmerkmalen und dem Telomerstrauß.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Forschung

Genetik

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Beschleunigten Strahlung Biodosimetry automatisiert durch dizentrische Chromosom Identifikation (ADCI) und Abschätzung der Dosis

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Gepoolte ShRNA Bildschirm für die Reaktivierung des MeCP2 auf dem inaktiven X-Chromosom

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Frequenzverschiebungen Eingabe Genom Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von einem einzigen Tardigrade Exemplar

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Ein nicht zufälliges Mausmodell zur pharmakologischen Reaktivierung von Mecp2 auf dem inaktiven X-Chromosom

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identifizierung von Enhancer-Promoter-Kontakten in embryoiden Körpern durch quantitative Chromosomenkonformationserfassung (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

Chromosomen-Screening von humanen Präimplantationsembryonen unter Verwendung von verbrauchtem Kulturmedium: Probenentnahme und Chromosomenploidie-Analyse

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Erfassung der Chromosomenkonformation über Längenskalen hinweg

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...