Name: preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

אנו מודים טרנט ניומן ומאסדה שריפי על הערות על כתב היד ו נגוין על סיוע לייעל את השיטות למריחה ולצביעת כרומוזומים מן הדגים מייציטים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM079115 הוענק S.M.B.

כל השיטות הכרוכות בצדגים בוצעו באמצעות תקנים אתיים שאושרו על-ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים והשימוש ב-UC דיוויס.
1. הליך התפשטות כרומוזום
הערה: הפרוטוקול הבא נועד ליצור 4-6 שקופיות, עם מאות גרעינים מיוטיים מתפשטים לכל שקופית. מספר האשכים המשמשים יהיה תלוי ב...

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li><li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks,+synapsis,+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).</li><li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish.">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li><li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+recombination+in+human+males.">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li><li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+studies+of+human+meiosis:+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at,+or+prior+to,+establishment+of+double-strand+breaks.">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075 (2013).</li><li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes.">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442 (2014).</li><li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male.">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Saito, K., Siegfried, K. R., N&#252;sslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants.">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li><li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+by+breaking+and+repairing:+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination.">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li><li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females.">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li><li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes.">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).</li><li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+chiasmata+and+interference.">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li><li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies.">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li><li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene.">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).</li></ol>

כאן אנו מתארים שיטות כדי לחקור את המיקום של טלומרים ו כרומוזום הקשורים חלבונים בפני שטח גרעיני כפולות מבודד spermatocytes מתוך האשכים דג זברה. אנו מצפים כי שיטות אלה יחולו על ניתוח של ספרציטים במינים אחרים של teleost עם הסתגלות לגודל של בדיקת.
בעוד רק כמה נוגדנים הועלו כדי להשתמש בחלב...

רבייה מינית ההכנסות באמצעות שילוב של שני מגיים פלואידי, כל אחד סוחב חצי כרומוזום משלים של תא סומאטיק. Meiosis היא חלוקת תאים מיוחדים המייצרת את גמטות מגיים דרך סיבוב אחד של שכפול DNA ושני סיבובים רצופים של הפרדה כרומוזום. ב-prophase I, כרומוזומים הומוולוגי (הומוולוג) חייבים לעבור זיווג, שילוב מחדש וsynapsis, האחרון שמאופיין בהיווצרות הקומפלקס הsynaptonemal המורכב משני צירי הומולוג הגושרים על ידי החוט הרוחבי, Sycp1 (איור 1A, B). אי כראוי לבצע תהליכים אלה יכול להוביל לייצור של מגיים aneuploid, אשר הם הגורם המוביל של הפלות בבני אדם1. הידע שלנו על הקואורדינציה בין זיווג, שילוב מחדש וsynapsis הונחה על ידי מחקרים במגוון רחב של אורגניזמים, כגון שמרים,כגון העכבר, ודרוסופילה, בין השאר2. בעוד התהליך הכללי של שיוך כרומוזום הומוולוגי ואחריו הפרדה היא שמירה היטב, התלות שלה על שילוב מחדש ו synapsis ואת סדר האירועים האלה משתנה.
Meiotic הפסקה כפולה (dsb) היווצרות, אשר יוזם שילוב הומוולוגי, מתרחשת ליד טלומרים באשכולות הזר במהלך לפטוטנא ו synapsis תפתח זמן קצר לאחר3,4. תצורה זו של היווצרות dsb ו synapsis חניכה היא גם מאפיין של המיוזיס גברי בבני אדם, אבל לא בעכבר5,6,7,8, מציע כי דג זברה יכול לשמש כמודל הזרע האנושי. ישנם גם מספר יתרונות מעשיים של הלומדים מיוזיס. שני הזכרים והנקבות עוברים במהלך הבגרות, הגונדות שלהם נגישים בקלות, ומאות צאצאים מופקים מצלב אחד. בנוסף, העוברים שקופים ולפתח חיצונית, אשר מקלה על גילוי מוקדם של סטיות בהתפתחות העובריים בשל מגיים aneuploid3,9. החסרונות של השימוש דג זברה הם כי הם איטיים להגיע בגרות מינית (~ 60 ימים) ואת כמות החומר הדרוש עבור כפולות משטח גרעיני יש לאסוף מ-~ 10-20 בעלי חיים למבוגרים, בהתאם לגודלם.
ההכנות התפשטות כרומוזום מיוטית הם כלי חיוני עבור לימוד דינמיקה כרומוזום בכל האורגניזמים המודל, מאז חתימות מפתח של דינמיקה כרומוזום meiotic יכול להיות נחקר. ב zebrafish, היבטים מרכזיים של ההתקדמות של התוכנית meiotic והארגון הגרעיני כבר גזור דרך בודק כפולות משטח גרעיני, המכונה כאן כמו כרומוזום מתפשט, עם נוגדנים לזיהוי אימונוofor, חלבונים ו/או חומצות גרעין על ידי דגים3,4,9,10,11,12. ואכן, ניתן לשמור על ההתאמה המקוטלת של טלומרים באשכולות בפרחים בהכנה לכפולה (איור 1C). לאחרונה, השתמשנו בכרומוזום הספרציט spermatocyte מתפשט יחד עם שיטות זיהוי של הקרינה הפלואורסצנטית ומיקרוסקופ סופר ברזולוציה כדי להבהיר את ההתקדמות המפורטת של הדינמיקה של ההומופיש, שיוך כרומוזום הומוולוגי, לוקליזציה של כפול סטרנד, ו synapsis ב מעברים meiotic מפתח3. כאן אנו מציגים שיטות כדי להכין כרומוזום כפולות מן הזרע של האשכים דג זברה ולאחר מכן כתם אותם עם חומצות הגרעין של הפלורסנט פפטיד (הרשות הפלסטינית) בדיקות חוזרות ונשנות רצפי ו מimmunofluorescence זיהוי של חלבונים הקשורים בכרומוזום.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde, methanol-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 mm glasscoverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>363696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bag</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Used to make plastic coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>203775-500uL</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-zfSycp1</td>
			<td>Generated by Burgess lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10014CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Two are required for dissecting the testes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89429-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11042</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-hDMC1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8973</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-3683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>230401V (Model 5420)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Model Classic C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimerbly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Used for the humidity chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hamsterSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hMLH1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550838</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hRPA</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>MABE285</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Alexa647</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1013</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Cy3</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRPA</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-244A</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150292</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRad51</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX100469</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercut Scissors, 30&#176; angle, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-822-353</td>
			<td>Can also use any pair of small scissors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9897184</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9253-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes

Meiosis הוא תהליך הסלולר המפתח הנדרש כדי ליצור מגיים פלואידי עבור רבייה מינית. אורגניזמים מודל היו אינסטרומנטלי הבנת האירועים כרומוזום כי מתרחשים במהלך proiotic, כולל הזיווג, synapsis, ושילוב מחדש אירועים המבטיחים הפרדה כרומוזום נכון. בזמן שהעכבר היה מודל חשוב להבנת המנגנונים המולקולריים הנמצאים בבסיס תהליכים אלה, לא כל האירועים המיוטיים במערכת זו הינם מקבילה למיוזיס אנושי. לאחרונה הדגמנו את הפוטנציאל המרגש של דג הזיברפיש כמודל של זרע-בראשית אנושי. כאן אנו מתארים, בפרוטרוט, שיטות שלנו להמחיש כרומוזומים מיוטיים וחלבונים הקשורים ההכנות כרומוזום התפשטות. ההכנות הללו יש את היתרון של מתן ברזולוציה גבוהה ניתוח של מבנים כרומוזום. ראשית, אנו מתארים את ההליך לבתר את האשכים של מבוגרים zebrafish, ואחריו הדיסוציאציה תא, הליזה, והפצת הכרומוזומים. לאחר מכן, אנו מתארים את ההליך לגילוי הלוקליזציה של חלבונים כרומוזום meiotic, על ידי זיהוי אימונוofor, ו חומצות גרעין רצפים, על ידי היברידיזציה באתרו (דג). טכניקות אלה מהווים ערכה שימושית של כלים לניתוח ציטולוגי של אדריכלות כרומטין מיוטית במערכת הדגים. חוקרים בקהילה דג זברה צריך להיות מסוגל במהירות לשלוט בטכניקות אלה ולשלב אותם לניתוח הסטנדרטי שלהם של תפקוד הרבייה.

יש לנו מתווה שיטה כדי להכין ולהמחיש הדמיה של ההכנות התפשטות הזרע. כאשר מבוצעת בצורה נכונה, ההליך שלנו מניב היטב, גרעינים לא חופפים. כדי לשחזר את הגרעינים האלה, חשוב לקבל את הכמות המתאימה של חומר ההתחלה (כלומר, האשכים), לטפל באשכים למשך זמן מספיק בטריפסין ומספר הולם של טיפול ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

כפולות משטח גרעיני הם כלי הכרחי עבור לימוד אירועי כרומוזום במהלך meiosis. כאן אנו מדגימים שיטה כדי להכין ולדמיין כרומוזומים מיוטיים במהלך prophase הייתי מתוך הדגים הספרציטים.

הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

זברפיש מתגלה כמודל בעלי חוליות מצוין לחקר אירועי הכרומוזום של מיוזיס כולל זיווג כרומוזום הומולוגי, סינפסיה וקומבציה. פרוטוקול הפצת פני השטח הגרעיניים הזה איפשר לנו לדמיין תכונות מפתח של ארכיטקטורת כרומוזום מיוטית באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציית-על. החוקרים יכולים לצפות למאות גרעינים מפוזרים היטב לכל שקופית עם פחות פסולת מאשר פרוטוקולים אחרים של התפשטות זברה.החלק המאתגר ביותר מבחינה טכנית של הליך זה הוא ניתוח של האשכים zebrafish כפי שהוא בסמיכות לעור והוא מחובר גם לאיברים אחרים. הדמיה של הליך הניתוח תאפשר לחוקרים לדעת למה לצפות כשהם רואים את הקנאד מוטבע ברקמת החיה. לאחר המתת דם של דגי זברה זכרים, ערפו את ראשו של דג אחד בכל פעם במספריים קטנים ולאחר מכן השתמשו במספריים זעירים כדי לחתוך לאורך קו האמצע הגחוני כדי לחשוף את חלל הגוף.מניחים את הדגים בצלחת פטרי מצופה סיליקון ומכסים על ידי בריכה רדודה של 1X PBS. תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 1.65, לנתח את האשכים באמצעות מדפים. הסר ככל שומן הרקמה שמסביב מן האשכים ככל האפשר.הקנאד ייראה שקוף תחת אור היקף הניתוח בעוד השומן שמסביב עשוי להיות מראה מעט כהה יותר. כמות מסוימת של שומן ניתן להשאיר על gonad מבלי לעכב את ההליך. מוסיפים כל אשך נותח ישירות לתוך צינור חמישה מיליליטר עם שני מיליליטר של DMEM ולשמור על קרח.כדי לנטרל את תאי האשכים, להוסיף 200 microliters של פתרון קולגן לצינור חמישה מיליליטר עם האשכים. מערבבים את הפתרון על ידי היפוך אותו מספר פעמים. לנער בעדינות את האשכים בשייקר אינקובטור אופקית ב 100 סל"ד ב 32 מעלות צלזיוס.במהירות להפוך את הצינור כל 10 דקות כדי להקל על דיסוציאציה. לאחר שעה, ה- DMEM מעונן והתרכים נמצאים בגושים קטנים. בעוד האשכים הם דגירה קולגנס, לפני המלחמה 100 microliters של 0.1 פתרון סוכרוז טוחנת ל 37 מעלות צלזיוס.כדי לשטוף את הקולגנס, להוסיף DMEM לנפח סופי של חמישה מיליליטר ולהפוך את הצינור כמה פעמים. גלולה האשכים ב 200 גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. הסר שלושה מיליליטר של העל-טבעי כך שנותרו רק שני מיליליטר.חזור על שטיפה DMEM פעמיים נוספות. לאחר לשטוף DMEM האחרון, להסיר ארבעה מיליליטר של supernatant ולהוסיף מיליליטר אחד של DMEM, 200 microliters של פתרון טריפסין, ו 20 microliters של פתרון DNase I. להפוך את הצינור כמה פעמים כדי לערבב את הפתרון.לנער אופקית את הצינור ב 32 מעלות צלזיוס ב 100 סל"ד. הפוך במהירות את הצינור כל חמש דקות כדי להקל על דיסוציאציה. לאחר חמש עד 15 דקות, פתרון DMEM מכיל רק כמה גושים.הוסף 500 מיקרוליטרים של פתרון מעכבי טריפסין ו 50 microliters של פתרון DNase I. להפוך את הצינור כמה פעמים כדי לערבב ואז לסובב בקצרה למטה ב 200 גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר נוזלים או גושים שעשויים לדבוק כובע הצינור או בצד של הצינור. מניחים את הצינור על קרח ומעבירים מחדש את מתלי התא על ידי צינורות שוב ושוב למעלה ולמטה עם פיפטה העברת פלסטיק במשך שתי דקות כדי להקל על דיסוציאציה של כל הגושים הנותרים.ודא כי ההשעיה התא לא להיכנס הנורה של פיפטה העברה. ואז הרטיב מראש מסננת תא 100 מיקרון עם DMEM והמקם אותו על גבי צינור 50 מיליליטר על קרח. מעבירים את ההשעיה התא דרך מסננת טיפה אחת בכל פעם באמצעות פיפטה העברת פלסטיק.מעבירים את הסינון באמצעות פיפטה להעברת פלסטיק לצינור חדש של חמישה מיליליטר. הקפד לאסוף את התאים המחוברים לצד התחתון של המסנן. הוסף DMEM לתוך הצינור לנפח סופי של חמישה מיליליטר.גלולה התאים ב200 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסר על טבעי ככל האפשר מבלי להפריע גלולה ולהוסיף חמישה microliters של פתרון DNase אני ישירות לתוך גלולה. ואז לערבב את גלולה עם פתרון DNase אני על ידי גירוד בעדינות את החלק התחתון החיצוני של הצינור ארבע עד חמש פעמים לאורך מתלה צינור microcentrifuge ריק.הוסף DMEM לנפח סופי של חמישה מיליליטר ומערבבים את הפתרון על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. גלולה ההשעיה התא ב 200 גרם במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. חזור על הטיפול DNase עוד פעם עד שלוש פעמים עד גלולה לשימוש חוזר לא גוש על תוספת של DMEM.לאחר הספין האחרון, להסיר ככל supernatant ככל האפשר מבלי להפריע גלולה. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של 1X PBS ו resuspend את גלולה על ידי בעדינות מגרד את החלק התחתון החיצוני של הצינור לאורך מתלה צינור ריק. גלולה ההשעיה התא ב 200 גרם במשך חמש דקות ולאחר מכן להסיר על טבעי ככל האפשר מבלי להפריע גלולה.חותכים שלושה מילימטרים מקצה קצה פיפיאט 200 מיקרוליטר כדי להרחיב את הצמצם. עם קצה פיפטה לחתוך, resuspend את גלולה ב 80 microliters של 0.1 פתרון סוכרוז טוחנת על ידי צינור למעלה ולמטה. תן להשעיית התא לשבת בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות.לאחר מכן, עם קצה פיפטה, מצפים שקופית אחת עם 100 מיקרוליטרים של 1% פורמלדהיד עם 0.15% טריטון X-100. לאחר מכן להוסיף 18 microliters של ההשעיה תא סוכרוז על מרכז השקופית בקו ישר בניצב לקצה הארוך. הטה את השקופית קדימה ואחורה כדי להקל על התפשטות מתלי התא לכל הפינות.מניחים את השקופיות שטוח למטה בתא לחות פתוח סדוק מעט כדי למנוע את פתרון פורמלדהיד מלהיות ייבוש. מניחים את תא הלחות במגירה כהה בן לילה. בבוקר, מוציאים את המכסה מתא הלחות ומאפשרים לשקופיות להתייבש לחלוטין.מניחים את המגלשות בצנצנת קופלין ואז ממלאים את צנצנת הקופלין במים מזוקקים. דגירה במשך חמש דקות עם רעידות עדינות בטמפרטורת החדר. יוצקים את המים וממלאים את הצנצנת בסוכן הרטבה אחד עד 250.לשטוף פעמיים במשך חמש דקות כל אחד עם רעידות עדינות בטמפרטורת החדר. אפשרו לשקופיות להתייבש לחלוטין ולאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהן מוכתמות. פרוטוקול זה התווה שיטה להכין ולדמיין את התפשטות זרע דג הזברה המניבה גרעינים שאינם חופפים היטב.הלוחות משמאל מציגים שלושה שלבים של פרופאזה מיוטית, לפטוטן, זיגוטן מוקדם ופצ'יטין. הטלומרים היו מגנטה מוכתמים לכל שלב. דוגמה של ממרחים באיכות ירודה בשל טיפולים DNase אני מספיק מוצגים כאן.כרומוזומים מיוטיים מוכתמים עבור SYCP3 מצביעים על גרעינים חופפים עקב השעיית תא סוכרוז צמיג המונעת מתאים להתפשט כראוי בשקופית. חשוב מאוד להתחיל עם הכמות הנכונה של חומר התחלתי, לטפל אשכי זברה במשך הזמן המתאים טריפסין, ולבצע את המספר הדרוש של טיפולים DNase אני כמו כישלון לעשות זאת יכול להוביל מעט מאוד גרעינים או גרעינים מגושמים. PPE הנכון תמיד צריך להיות משוחק בעת עבודה עם פורמלדהיד.בעקבות הליך ההתפשטות, כרומוזומים יכולים להיות מוכתמים כדי לדמיין מבנים כרומוזומליים שונים, כמו גם הפסקות גדיל כפול כדי לנתח את התלות בעיתוי לוקליזציה של אירועים meiotic. הטכניקה שלנו סללה את הדרך להראות כי דג זברה עשוי להיות מודל טוב יותר של זרע אנושי מאשר עכבר המבוסס על תכונות כרומוזום זר הטלומר.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

קרינה מזורז Biodosimetry אוטומטית על ידי כרומוזום Dicentric זיהוי (ADCI) והשערוך מינון

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

במאגר shRNA מסך עבור הפעלה מחדש של MeCP2 על כרומוזום X לא פעיל

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

מודל עכבר שאינו אקראי עבור ההפעלה הפרמקולוגית של Mecp2 על כרומוזום X לא פעיל

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

זיהוי אנשי קשר של משפר-יזם ב Embryoid גופים על-ידי לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותית (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

בדיקת כרומוזומים של עוברים אנושיים טרום השרשה באמצעות מדיום תרבית משומש: איסוף דגימות וניתוח פלואידיות כרומוזומליות

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

לכידת קונפורמציה של כרומוזומים על פני סולמות אורך

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...