Name: preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Ringraziamo Trent Newman e Masuda Sharifi per i commenti sul manoscritto e An Nguyen per aver contribuito a ottimizzare i metodi per diffondere e macchiare i cromosomi dai meiociti del pesce zebra. Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 GM079115 assegnato a S.M.B.

Tutti i metodi che coinvolgono il pesce zebra sono stati effettuati utilizzando standard etici approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'UC Davis.
1. Procedura di diffusione dei cromosomi
NOTA: Il seguente protocollo è progettato per creare 4-6 vetrini, con centinaia di nuclei meiotici diffusi per diapositiva. Il numero di testicoli utilizzati dipenderà dalle dimensioni del pesce. Aspettatevi di utilizzare 20 animali a 60 giorni dopo la feconda...

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li><li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks,+synapsis,+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).</li><li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish.">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li><li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+recombination+in+human+males.">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li><li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+studies+of+human+meiosis:+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at,+or+prior+to,+establishment+of+double-strand+breaks.">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075 (2013).</li><li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes.">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442 (2014).</li><li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male.">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Saito, K., Siegfried, K. R., N&#252;sslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants.">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li><li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+by+breaking+and+repairing:+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination.">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li><li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females.">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li><li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes.">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).</li><li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+chiasmata+and+interference.">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li><li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies.">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li><li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene.">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).</li></ol>

Qui descriviamo i metodi per sondare la posizione dei telomeri e delle proteine associate ai cromosomi nella superficie nucleare si diffonde dagli spermatociti isolati dai testicoli dei pesci zebra. Prevediamo che questi metodi saranno applicabili per l'analisi di spermatociti in altre specie teleost con regolazione delle dimensioni dei testicoli.
Mentre solo pochi anticorpi sono stati sollevati per le proteine meiotiche dei pesci zebra, abbiamo avuto successo usando i seguenti anticorpi solle...

La riproduzione sessuale procede attraverso la combinazione di due gameti aploidi, ognuno dei quali trasporta metà del complemento cromosomico di una cellula somatica. La meiosi è una divisione cellulare specializzata che produce gameti aploidi attraverso un ciclo di replicazione del DNA e due cicli successivi di segregazione cromosomica. Nella profase I, i cromosomi omologhi (omologi) devono subire l'abbinamento, la ricombinazione e la sinapsi, quest'ultima caratterizzata dalla formazione del complesso sinatonemale che comprende due assi omologi colmati dal subverso, Sycp1 (Figura 1A,B). La mancata esecuzione corretta di questi processi può portare alla produzione di gameti aneuploidi, che sono una delle principali cause di aborti spontanei in esseri umani1. La nostra conoscenza del coordinamento tra abbinamento, ricombinazione e sinapsi è stata facilitata da studi in una vasta gamma di organismi, come lievito, C. elegans, topo e Drosophila, tra gli altri2. Mentre il processo generale di accoppiamento cromosomico omologato seguito dalla segregazione è ben conservato, la sua dipendenza dalla ricombinazione e dalla sinapsi e l'ordine di questi eventi varia.
La formazione meiotica di rottura a doppio filamento (DSB), che avvia una ricombinazione omologa, si verifica vicino ai telomeri raggruppati nel bouquet durante il leptotene e la sinapsi segue poco dopo3,4. Questa configurazione della formazione e dell'avvio della sinapsi di DSB è anche una caratteristica della meiosi maschile negli esseri umani ma non nel topo5,6,7,8, suggerendo che il pesce zebra può servire come modello per la spermatogenesi umana. Ci sono anche diversi vantaggi pratici dello studio della meiosi del pesce zebra. Sia i maschi che le femmine subiscono gametogenesi durante l'età adulta, le loro gonadi sono facilmente accessibili e centinaia di prole sono generate da una singola croce. Inoltre, gli embrioni sono trasparenti e si sviluppano esternamente, il che facilita la diagnosi precoce di aberrazioni nello sviluppo embrionale a causa di gameti aneuploidi3,9. Svantaggi dell'uso di pesci zebra sono che sono lenti a raggiungere la maturità sessuale (60 giorni) e la quantità di materiale necessaria per gli spread di superficie nucleare deve essere raccolta da 10-20 dollari animali adulti, a seconda delle loro dimensioni.
I preparati meiotici sono uno strumento vitale per studiare la dinamica cromosomica in tutti gli organismi modello, poiché è possibile sondare le firme chiave della dinamica cromosomica meiotica. Nel pesce zebra, gli aspetti chiave della progressione del programma meiotico e dell'organizzazione nucleare sono stati sezionati attraverso la sonda di diffusione della superficie nucleare, indicati qui come si diffonde cromosomica, con anticorpi per il rilevamento immunofluorescenza di proteine e/o acidi nucleici da FISH3,4,9,10,11,12. Infatti, la localizzazione polarizzata dei telomeri raggruppati nel bouquet può essere preservata nella preparazione della diffusione (Figura 1C). Recentemente, abbiamo usato i cromosomi di spermatociti zebrati insieme a metodi di rilevamento della fluorescenza e microscopia a super-risoluzione per chiarire la progressione dettagliata della dinamica dei telomeri di pesce zebra, l'abbinamento cromologo omologoso, la localizzazione delle rotture a doppio filamento e la sinapsi alle transizioni meiotiche chiave3. Qui presentiamo metodi per preparare le crescite cromosomiche dagli spermatociti dei testicoli del pesce zebra e successivamente le macchiamo con sonde fluorescenti di acido nucleico peptide (PNA) a sequenze di telomeri ripetute e rilevamento di immunofluorescenza delle proteine associate al cromosoma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde, methanol-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 mm glasscoverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>363696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bag</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Used to make plastic coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>203775-500uL</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-zfSycp1</td>
			<td>Generated by Burgess lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10014CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Two are required for dissecting the testes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89429-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11042</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-hDMC1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8973</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-3683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>230401V (Model 5420)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Model Classic C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimerbly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Used for the humidity chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hamsterSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hMLH1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550838</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hRPA</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>MABE285</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Alexa647</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1013</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Cy3</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRPA</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-244A</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150292</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRad51</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX100469</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercut Scissors, 30&#176; angle, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-822-353</td>
			<td>Can also use any pair of small scissors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9897184</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9253-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes

La meiosi è il processo cellulare chiave necessario per creare gameti aploidi per la riproduzione sessuale. Gli organismi modello sono stati determinanti nella comprensione degli eventi cromosomici che si verificano durante la profase meiotica, tra cui l'accoppiamento, la sinapsi e gli eventi di ricombinazione che garantiscono una corretta segregazione cromosomica. Mentre il topo è stato un modello importante per comprendere i meccanismi molecolari alla base di questi processi, non tutti gli eventi meiotici in questo sistema sono analoghi alla meiosi umana. Recentemente abbiamo dimostrato l'entusiasmante potenziale del pesce zebra come modello di spermatogenesi umana. Qui descriviamo, in dettaglio, i nostri metodi per visualizzare i cromosomi meiotici e le proteine associate nei preparati di diffusione cromosomica. Questi preparati hanno il vantaggio di consentire l'analisi ad alta risoluzione delle strutture cromosomiche. In primo luogo, descriviamo la procedura per la sezionamento dei testicoli da pesci zebra adulti, seguita da dissociazione cellulare, lisi e diffusione dei cromosomi. Successivamente, descriviamo la procedura per rilevare la localizzazione delle proteine cromosomiche meiotiche, mediante rilevamento dell'immunofluorescenza e sequenze di acidi nucleici, mediante fluorescenza nell'ibridazione in situ (FISH). Queste tecniche comprendono un utile insieme di strumenti per l'analisi citologica dell'architettura della cromatina meiotica nel sistema del pesce zebra. I ricercatori della comunità dei pesci zebra dovrebbero essere in grado di padroneggiare rapidamente queste tecniche e incorporarle nelle loro analisi standard della funzione riproduttiva.

Abbiamo delineato un metodo per preparare e visualizzare i preparativi per la diffusione dello spermatocito del pesce zebra. Se eseguita correttamente, la nostra procedura produce nuclei ben diffusi e non sovrapposti. Per recuperare tali nuclei, è importante avere la quantità appropriata di materiale di partenza (cioè testicoli), trattare i testicoli per un periodo di tempo sufficiente nella trypsina e un numero adeguato di trattamenti DNase I. Questi spread possono quindi essere macch...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Le creme nucleari sono uno strumento indispensabile per studiare gli eventi cromosomici durante la meiosi. Qui dimostriamo un metodo per preparare e visualizzare cromosomi meiotici durante la profase I dagli spermatociti del pesce zebra.

Preparazione delle scime cromosomiche meiotiche da Spermatociti di pesce zebra

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Zebrafish sta emergendo come un eccellente modello di vertebrato per lo studio degli eventi cromosomici della meiosi tra cui l'accoppiamento cromosomico omologo, la sinapsi e la ricombinazione. Questo protocollo di diffusione della superficie nucleare ci ha permesso di visualizzare le caratteristiche chiave dell'architettura del cromosoma meiotico usando la microscopia a super risoluzione. I ricercatori possono aspettarsi centinaia di nuclei ben diffusi per scivolo con meno detriti rispetto ad altri protocolli di diffusione del pesce zebra.La parte tecnicamente più impegnativa di questa procedura è la dissezione dei teste di zebrafish in quanto è in prossimità della pelle ed è anche attaccata ad altri organi. La visualizzazione della procedura di dissezione consentirà ai ricercatori di sapere cosa aspettarsi quando vedono il gonad incorporato nel tessuto dell'animale. Dopo aver eutanasiato il pesce zebra maschio, decapitare un pesce alla volta con piccole forbici e quindi utilizzare micro forbici per tagliare lungo la linea mediana ventrale per esporre la cavità corporea.Mettere il pesce in una piastra di Petri rivestita in silicone e coprire da una piscina poco profonda di 1X PBS. Al microscopio con ingrandimento 1,65X, sezionare i tester utilizzando le forcep. Rimuovere il più possibile il grasso e il tessuto circostante dai tester.Il gonade apparirà traslucido sotto la luce del mirino della dissezione mentre il grasso circostante potrebbe avere un aspetto leggermente più scuro. Una certa quantità di grasso può essere lasciata sul gonad senza ostacolare la procedura. Aggiungere ogni teste sezionato direttamente in un tubo da cinque millilitri con due millilitri di DMEM e tenere sul ghiaccio.Per dissociare le cellule testes, aggiungere 200 microlitri di soluzione di collagenasi al tubo dei cinque millilitri con i teste. Mescolare la soluzione inverterla più volte. Agitare delicatamente i tester in uno shaker dell'incubatore orizzontalmente a 100 giri/min a 32 gradi Celsius.Invertire rapidamente il tubo ogni 10 minuti per facilitare la dissociazione. Dopo un'ora, il DMEM è nuvoloso e i teste sono in piccoli blocchi. Mentre i teste vengono incubati in collagenasi, prewarm 100 microlitri di soluzione di saccarosio molare a 37 gradi Celsius.Per lavare la collagenasi, aggiungere DMEM a un volume finale di cinque millilitri e invertire il tubo alcune volte. Pellet i tester a 200 g per tre minuti a temperatura ambiente. Rimuovere tre millilitri del supernatante in modo che rimangano solo due millilitri.Ripetere il lavaggio DMEM due volte in più. Dopo l'ultimo lavaggio DMEM, rimuovere quattro millilitri del supernatante e aggiungere un millilitro di DMEM, 200 microlitri di soluzione di tripina e 20 microlitri della soluzione di DNasi I. Invertire il tubo alcune volte per mescolare la soluzione.Scuotere orizzontalmente il tubo a 32 gradi Celsius a 100 giri/min. Invertire rapidamente il tubo ogni cinque minuti per facilitare la dissociazione. Dopo cinque o 15 minuti, la soluzione DMEM contiene solo pochi grumi.Aggiungere 500 microlitri della soluzione inibitore della tripside e 50 microlitri della soluzione di DNasi I. Invertire il tubo alcune volte per mescolare, quindi girare brevemente verso il basso a 200 g per tre minuti a temperatura ambiente per rimuovere il liquido o i grumi che possono aderire al tappo del tubo o al lato del tubo. Posizionare il tubo sul ghiaccio e rimpiorsi la sospensione cellulare tubazionando ripetutamente su e giù con una pipetta di trasferimento in plastica per due minuti per facilitare la dissociazione di eventuali grumi rimanenti.Assicurarsi che la sospensione cellulare non vada nel bulbo della pipetta di trasferimento. Quindi pre-bagnare un colino a celle da 100 micron con DMEM e posizionarlo sopra un tubo da 50 millilitri sul ghiaccio. Trasferire la sospensione cellulare attraverso il filtro una goccia alla volta utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica.Trasferire il filtrato utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica su un nuovo tubo da cinque millilitri. Assicurarsi di raccogliere le celle raggruppate collegate alla parte inferiore del filtro. Aggiungere DMEM nel tubo a un volume finale di cinque millilitri.Pellet le cellule a 200 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il più possibile il supernatante senza disturbare il pellet e aggiungere cinque microlitri della soluzione di DNasi I direttamente nel pellet. Quindi mescolare il pellet con la soluzione DNase I raschiando delicatamente il fondo esterno del tubo da quattro a cinque volte lungo un rack vuoto per tubi a microcentrifugo.Aggiungere DMEM a un volume finale di cinque millilitri e mescolare la soluzione invertendo più volte il tubo. Pellet la sospensione cellulare a 200 g per due minuti a temperatura ambiente. Ripetere il trattamento della DNasi da uno a tre volte in più fino a quando il pellet rimescolato non si intasa all'aggiunta di DMEM.Dopo l'ultimo giro, rimuovere il più possibile il supernatante senza disturbare il pellet. Quindi, aggiungere un millilitro di 1X PBS e rimospendare il pellet raschiando delicatamente il fondo esterno del tubo lungo un rack a tubo vuoto. Pellettare la sospensione cellulare a 200 g per cinque minuti e quindi rimuovere il più supernatante possibile senza disturbare il pellet.Tagliare tre millimetri dalla fine di una punta della pipetta da 200 microlitri per allargare l'apertura. Con la punta della pipetta tagliata, resuspend il pellet in 80 microlitri di soluzione di saccarosio molare 0.1 pipettando su e giù. Lasciare riposare la sospensione cellulare a temperatura ambiente per tre minuti.Successivamente, con una punta di pipetta, rivestire una diapositiva con 100 microlitri di formaldeide all'1% con 0,15%Triton X-100. Quindi aggiungere 18 microlitri della sospensione cellulare del saccarosio al centro dello scivolo in linea retta perpendicolare al bordo lungo. Inclinare lo scivolo avanti e indietro per facilitare la diffusione della sospensione cellulare in tutti gli angoli.Posizionare i vetrini piatti in una camera di umidità aperta leggermente incrinato per evitare che la soluzione di formaldeide si asciughi. Posizionare la camera di umidità in un cassetto scuro durante la notte. Al mattino, rimuovere il coperchio dalla camera di umidità e lasciare asciugare completamente gli scivoli.Posizionare gli scivoli in un barattolo di coplin e quindi riempire il barattolo di coplin con acqua distillata. Incubare per cinque minuti con tremori delicati a temperatura ambiente. Versare l'acqua e riempire il barattolo con uno o 250 agenti bagnanti.Lavare due volte per cinque minuti ciascuno con tremori delicati a temperatura ambiente. Lasciare asciugare completamente le diapositive e conservarsi a meno 20 gradi Celsius fino a quando non sono macchiate. Questo protocollo delineava un metodo per preparare e visualizzare la diffusione degli spermatociti di zebrafish che produce nuclei non sovrapposti ben diffusi.I pannelli a sinistra mostrano tre fasi di prophase meiotico, leptotene, zigotene precoce e pachytene. I telomeri erano macchiati di magenta per ogni tappa. Un esempio di diffusione di scarsa qualità a causa di trattamenti DNasi I insufficienti sono mostrati qui.I cromosomi meiotici macchiati per SYCP3 indicano nuclei sovrapposti a causa di una sospensione viscosa delle cellule di saccarosio che impedisce alle cellule di diffondersi correttamente sullo scivolo. È molto importante iniziare con la giusta quantità di materiale di partenza, trattare i tester zebrafish per la quantità appropriata di tempo nella tripparina ed eseguire il numero necessario di trattamenti di DNasi I in quanto in caso di incapacità può portare a pochissimi nuclei o nuclei raggruppati. I DPI appropriati devono sempre essere indossati quando si lavora con la formaldeide.Seguendo la procedura di diffusione, i cromosomi possono essere macchiati per visualizzare varie strutture cromosomiche e interruzioni a doppio filamento per analizzare la dipendenza da temporizzazione e localizzazione degli eventi meiotici. La nostra tecnica ha spianato la strada a dimostrare che il pesce zebra può essere un modello migliore di spermatogenesi umana rispetto al topo in base alle caratteristiche cromosomici e al bouquet di telomeri.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Ricerca

Genetica

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Accelerato radiazione Biodosimetry automatizzato di identificazione del cromosoma dicentrico (ADCI) e stima della Dose

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

In pool shRNA schermo per riattivazione di MeCP2 sul cromosoma di X inattivo

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Bassissimo ingresso il sequenziamento del genoma libreria preparazione da un singolo esemplare di Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Un modello di mouse non casuale per la riattivazione farmacologica di MECP2 sul cromosoma X inattivo

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identificazione dei contatti Enhancer-Promoter nei corpi embrionali mediante Quantitative Chromosoma Conformation Capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

Screening cromosomico di embrioni umani preimpianto mediante l'utilizzo di terreno di coltura esausto: raccolta del campione e analisi della ploidia cromosomica

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Acquisizione della conformazione cromosomica su scale di lunghezza

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...