Name: preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

私たちは、原稿とアン・グエンに関するコメントに対するトレント・ニューマンとマスダ・シャリフィに感謝します。この作品は、S.M.Bに授与されたNIH R01 GM079115によってサポートされました。

ゼブラフィッシュを含むすべての方法は、UCデイビスの機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された倫理基準を使用して行われました。
1. 染色体の拡散手順
注: 次のプロトコルは、スライドごとに数百個のマイオティック核が広がる 4 ~ 6 枚のスライドを作成するように設計されています。使用される精巣の数は、魚の大きさによって異なります...

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li><li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks,+synapsis,+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).</li><li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish.">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li><li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+recombination+in+human+males.">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li><li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+studies+of+human+meiosis:+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at,+or+prior+to,+establishment+of+double-strand+breaks.">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075 (2013).</li><li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes.">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442 (2014).</li><li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male.">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Saito, K., Siegfried, K. R., N&#252;sslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants.">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li><li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+by+breaking+and+repairing:+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination.">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li><li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females.">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li><li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes.">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).</li><li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+chiasmata+and+interference.">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li><li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies.">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li><li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene.">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).</li></ol>

ここでは、ゼブラフィッシュ精巣から分離された精子から広がる核表面におけるテロメアおよび染色体関連タンパク質の位置を探査する方法について説明する。我々は、これらの方法が精巣の大きさに調整して他のテレオスト種の精子細胞の分析に適用可能であることを期待する。
ゼブラフィッシュのマイオティックタンパク質に対して抗体が少ないのに対し、ヒト(h)?...

性的生殖は、2つのハプロイド・アプタの組み合わせを通して進行し、それぞれが体細胞の染色体補体の半分を運ぶ。Meiosisは、DNA複製の1ラウンドと染色体分離の2つの連続したラウンドを通じてハプロイドのアホテを生成する特殊な細胞分裂である。前相Iでは、相同染色体(ホモログ)は、対合、組換え、およびシナプス化を受けなければならないが、後者は、横断フィラメントによって架橋された2つの相同軸を含むシナプトン複合体の形成によって特徴付けられる、Sycp1(図1A、B)。これらのプロセスを適切に実行しないと、人間の流産の主な原因である異常の多い球体の生産につながる可能性があります1.組み合わせ、組換え、シナプスの間の協調に関する我々の知識は、酵母、C.エレガンス、マウス、ショウジョウバエなどの幅広い生物の研究によって促進されてきた2。相同染色体の組み合わせの一般的なプロセスは、分離が続くが十分に保存されているが、組換えとシナプス化への依存性とこれらのイベントの順序は異なります。
相同の組換えを開始するマイオティック二重鎖破断(DSB)形成は、レプトテンおよびシナプスの間に花束に集まったテロメアの近くで発生し、シナプスは3、4の直後に続く。DSB形成およびシナプス開始のこの構成はまた、ヒトにおける男性のマイオシスの特徴であるが、マウス5、6、7、8では、 ゼブラフィッシュがヒト精子形成のモデルとして役立つことを示唆している。ゼブラフィッシュのマイオーザ症を研究するいくつかの実用的な利点もあります。男性と女性の両方が成人期を通じてゲーム形成を受け、生殖腺は簡単にアクセスでき、何百もの子孫が単一の十字架から生成されます。さらに、胚は透明であり、外部的に発達し、これは、異常体素3、9による胚発生における収差の早期発見を容易にする。ゼブラフィッシュを使用することの欠点は、性的成熟度(約60日)に達するのが遅く、核表面に必要な物質の量は、その大きさに応じて〜10〜20匹の成虫動物から収集されなければならないということです。
マイオティック染色体広がり製剤は、マイオティック染色体ダイナミクスの主要なシグネチャを調べることができるので、すべてのモデル生物間で染色体ダイナミクスを研究するための重要なツールです。ゼブラフィッシュでは、マイオティックプログラムと核組織の進行の重要な側面は、魚3、4、9、10、12によるタンパク質および/または核酸の免疫蛍光検出のための抗体を用いて、ここで染色体拡散と呼ばれる核表面広がりを探査することによって解剖されてきた。実際、花束中のクラスター化テロメアの偏光局在化は、スプレッド製剤中に保存することができる(図1C)。最近では、ゼブラフィッシュの精子染色体を蛍光検出法や超解像顕微鏡法とともに用い、ゼブラフィッシュテロメアダイナミクス、相同染色体の組み合わせ、二重鎖破壊局在化、および主要なマイオティック遷移におけるシナプスの詳細な進行を解明した。ここではゼブラフィッシュ精巣の精子から発色広がりの染色体を調製し、続いて蛍光ペプチド核酸(PNA)プローブで染色し、染色体関連タンパク質の繰り返しテロメア配列と免疫蛍光検出を行う方法を紹介します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde, methanol-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 mm glasscoverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>363696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bag</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Used to make plastic coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>203775-500uL</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-zfSycp1</td>
			<td>Generated by Burgess lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10014CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Two are required for dissecting the testes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89429-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11042</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-hDMC1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8973</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-3683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>230401V (Model 5420)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Model Classic C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimerbly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Used for the humidity chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hamsterSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hMLH1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550838</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hRPA</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>MABE285</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Alexa647</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1013</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Cy3</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRPA</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-244A</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150292</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRad51</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX100469</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercut Scissors, 30&#176; angle, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-822-353</td>
			<td>Can also use any pair of small scissors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9897184</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9253-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes

Meiosisは、性的生殖のためのハプロイドの解球を作成するために必要な重要な細胞プロセスです。モデル生物は、ペアリング、シナプス、適切な染色体分離を保証する組み換えイベントなど、マイオティックの前相中に起こる染色体事象を理解するのに役立っています。マウスは、これらのプロセスの根底にある分子メカニズムを理解するための重要なモデルであったが、このシステム内のすべてのマイオティック事象は人間のマイオーシスに類似しているわけではない。我々は最近、ヒト精子形成のモデルとしてゼブラフィッシュのエキサイティングな可能性を実証した。ここでは、染色体広がり製剤におけるマイオサイト染色体および関連タンパク質を可視化する方法について詳しく説明します。これらの製剤は、染色体構造の高解像度分析を可能にするという利点を有する。まず、成体ゼブラフィッシュから精巣を解剖し、続いて細胞解離、分解、染色体の広がりについて説明する。次に、蛍光インシトゥハイブリダイゼーション(FISH)による生声染色体タンパク質の局在を検出する方法について、免疫蛍光検出、および核酸配列を挙げる。これらの技術はゼブラフィッシュ系におけるマイオティッククロマチンアーキテクチャの細胞学的分析に有用なツールセットを含む。ゼブラフィッシュコミュニティの研究者は、これらの技術を迅速に習得し、生殖機能の標準的な分析に組み込むことができるはずです。

ゼブラフィッシュの精子拡散製剤を準備・可視化する方法を概説した。正しく実行すると、我々の手順は、よく広がり、重複しない核をもたらす。このような核を回収するには、適切な量の出発物質(すなわち、精巣)を有し、トリプシンおよび十分な数のDNase I処理において十分な時間の精巣を治療することが重要である。これらのスプレッドは、テロメアおよびマイ?...

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

核表面の拡散は、間見下がれの間に染色体の事象を研究するために不可欠なツールです。ゼブラフィッシュの精子から前相Iの間にマイオサイト染色体を調製し、可視化する方法を実証する。

ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

ゼブラフィッシュは、相同染色体ペア、シナプス、組み換えを含むmeiosの染色体事象を研究するための優れた脊椎動物モデルとして浮上しています。この核表面拡散プロトコルは、超解像顕微鏡を用いて、大染色体アーキテクチャの主要な特徴を可視化することを可能にしました。研究者は、他のゼブラフィッシュスプレッドプロトコルよりも少ない破片でスライドあたり何百もの十分に広がる核を期待することができます。この手順の最も技術的に困難な部分は、皮膚に近接し、他の器官にも付着しているので、ゼブラフィッシュ精巣の解剖です。解剖手順を視覚化することで、研究者は動物の組織に埋め込まれた生殖腺を見たときに何を期待するかを知ることができます。オスのゼブラフィッシュを安楽死させた後、小さなはさみで一度に1匹の魚を切断し、マイクロハサミを使って腹側の正中線に沿って切断して体腔を露出させます。シリコーンコーティングされたペトリ皿に魚を入れ、1X PBSの浅いプールで覆います。1.65倍の倍率で顕微鏡の下で、鉗子を使用して精巣を解剖する。精巣からできるだけ多くの脂肪と周囲の組織を取り除きます。周りの脂肪は少し暗い外観を持っている可能性がありますが、腺は解剖スコープの光の下に半透明に表示されます。脂肪のいくつかの量は、手順を妨げることなく、生殖腺に残される可能性があります。解剖された精巣を2ミリリットルのDMEMを用いた5ミリリットルチューブに直接加え、氷の上に置いてください。精巣細胞を解約するには、精巣で5ミリリットルチューブに200マイクロリットルのコラゲターゼ溶液を加える。溶液を数回反転して混ぜます。32°Cで100 RPMでインキュベーターシェーカーで精巣をそっと振ります。10分ごとにチューブを迅速に反転し、解離を容易にします。1 時間後、DMEM は曇りになり、精巣は小さな塊になります。精巣はコラゲラーゼでインキュベートされている間、摂氏37度に0.1モルスクロース溶液の100マイクロリットルを前温。コラゲターゼを洗い流すために、DMEMを5ミリリットルの最終体積に加え、チューブを数回反転します。ペレットは、室温で3分間200gで精巣を出す。上清の3ミリリットルを取り除き、2ミリリットルしか残らないようにします。DMEMを2回繰り返します。最後のDMEM洗浄後、上清を4ミリリットル除去し、DMEMを1ミリリットル、トリプシン溶液200マイクロリットル、DNase I溶液20マイクロリットルを添加します。チューブを数回反転して溶液を混合します。100 RPMで32°Cで管を水平に振ります。解離を容易にするために、5分ごとにチューブを迅速に反転させます。5 分から 15 分経過すると、DMEM ソリューションには束がほんのわずかしか含み欠かねます。トリプシン阻害剤溶液500マイクロリットルとDNase I溶液50マイクロリットルを加えます。チューブを数回反転して混合し、室温で3分間200gで短時間スピンダウンし、チューブキャップまたはチューブの側面に付着する可能性のある液体または塊を取り除きます。チューブを氷の上に置き、残りの塊の解離を容易にするために、プラスチックトランスファーピペットで繰り返しピペットを上下に2分間繰り返して細胞懸濁液を再中断します。セル懸濁液が移管ピペットの球根に入らないようにします。その後、DMEMで100ミクロンのセルストレーナーを事前に湿らし、氷の上の50ミリリットルチューブの上に置きます。プラスチック転写ピペットを使用して、ストレーナーを1滴ずつセルサスペンションに移します。プラスチック転写ピペットを使用して、新しい5ミリリットルチューブに濾液を移します。フィルタの下側に接続されているプールされたセルを収集してください。DMEMをチューブに加え、最終体積5ミリリットルにします。細胞を室温で5分間200gでペレット化する。ペレットを邪魔することなくできるだけ多くの上清を取り除き、5マイクロリットルのDNase I溶液をペレットに直接加えます。その後、空のマイクロ遠心チューブラックに沿ってチューブの外側の底部を4〜5回静かに削ることによって、ペレットをDNase I溶液と混ぜます。5ミリリットルの最終体積にDMEMを加え、チューブを数回反転させることによって溶液を混ぜます。細胞懸濁液を200gで2分間室温でペレット化する。DMEMを添加しても再懸濁されたペレットが凝集しなくなるまで、DNase処理をさらに1~3回繰り返します。最後のスピンの後、ペレットを邪魔することなく、できるだけ上清を取り除く。次に、1X PBSの1ミリリットルを加え、空のチューブラックに沿ってチューブの外側の底部を静かに削り取ってペレットを再中断します。細胞懸濁液を200gで5分間ペレットし、ペレットを邪魔することなくできるだけ多くの上清を除去する。200マイクロリットルのピペットチップの端から3ミリメートルをカットし、開口部を広げます。カットピペットチップで、ペレットを0.1モルショ糖溶液の80マイクロリットルで上下にピペット処理して再懸濁します。細胞懸濁液を室温で3分間座らせます。次に、ピペットチップで、100マイクロリットルの1%ホルムアルデヒドを0.15%トリトンX-100でコーティングします。次に、スクロース細胞懸濁液の18マイクロリットルを、長いエッジに垂直な直線でスライドの中央に加えます。スライドを前後に傾けると、セルのサスペンションが全角に広がります。わずかに割れたオープン湿度室にスライドを平らに置き、ホルムアルデヒド溶液が乾燥するのを防ぎます。湿度室を一晩暗い引き出しに入れます。午前中は、湿度室から蓋を取り外し、スライドを完全に乾燥させます。コプリン瓶にスライドを置き、蒸留水でコプリン瓶を満たします。室温で穏やかな揺れで5分間インキュベートします。水を注ぎ、1〜250湿潤剤で瓶を満たします。室温で穏やかに揺れながら、それぞれ5分間2回洗います。スライドが完全に乾燥し、染色されるまでマイナス20度で保存します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ精子細胞の広がりを調製し、視覚化する方法を概説し、重なり合う核を十分に広げる。左のパネルは、重症の3つの段階、レプトテン、初期のジゴテン、パキテーンを示しています。テロメアは各段階に対して染色されたマゼンタであった。DNase Iの治療不足による品質の悪いスプレッドの例を以下に示します。SYCP3に染色された滑心染色体は、細胞がスライド上に適切に広がるのを防ぐ粘性スクロース細胞懸濁液による重なり合う核を示す。出発物質の正しい量から始め、トリプシンで適当な時間ゼブラフィッシュの精巣を治療し、必要な数のDNase I治療を失敗として行うことは、非常に少数の核または塊状核につながる可能性があるため、非常に重要です。ホルムアルデヒドを使用する場合は、常に適切なPPEを着用する必要があります。拡散手順に従って、染色体は、様々な染色体構造だけでなく、二本鎖の破断を可視化し、タイミング依存性と、meioticイベントの局在化を分析することができる。私たちの技術は、ゼブラフィッシュが染色体の特徴とテロメアブーケに基づいてマウスよりもヒトの精子形成のより良いモデルであるかもしれないことを示す道を開きました。

Research

JoVE Journal

Genetics

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

迅速な放射線 Biodosimetry を自動化された減数分裂の染色体の識別 (ADCI) と線量評価

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

プールされた shRNA MeCP2 再アクティブ化非アクティブ X 染色体上の画面

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

超低入力ヒトゲノム単一 Tardigrade の標本からのライブラリの準備

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

ハイスループット DNA の抽出およびフィン クリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

不活性 X 染色体上の Mecp2 の薬理学的再活性化のための非ランダムマウスモデル

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

定量染色体立体構造捕捉による胚体におけるエンハンサー・プロモーター接触の同定(4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

使用済み培地を用いたヒト着床前胚の染色体スクリーニング:サンプル採取と染色体倍数性解析

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

長さスケール全体で染色体コンフォメーションをキャプチャする

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...