Name: preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

우리는 제브라피쉬 meiocytes에서 염색체를 확산하고 염색하는 방법을 최적화하는 데 도움 원고와 응우옌에 대한 의견에 대한 트렌트 뉴먼과 마스다 샤리피 에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH R01 GM079115에 의해 지원되었다 S.M.B에 수여.

제브라피시와 관련된 모든 방법은 UC 데이비스의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 윤리적 기준을 사용하여 수행되었습니다.
1. 염색체 확산 절차
참고: 다음 프로토콜은 슬라이드당 수백 개의 확산 된 meiotic 핵과 함께 4-6 슬라이드를 만들도록 설계되었습니다. 사용되는 고환의 수는 물고기의 크기에 따라 달라집니다. ~60일 후 수정 후(dpf) 및 15마리...

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	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li><li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks,+synapsis,+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).</li><li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish.">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li><li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+recombination+in+human+males.">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li><li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+studies+of+human+meiosis:+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at,+or+prior+to,+establishment+of+double-strand+breaks.">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075 (2013).</li><li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes.">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442 (2014).</li><li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male.">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Saito, K., Siegfried, K. R., N&#252;sslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants.">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li><li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+by+breaking+and+repairing:+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination.">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li><li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females.">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li><li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes.">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).</li><li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+chiasmata+and+interference.">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li><li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies.">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li><li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene.">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).</li></ol>

여기에서 우리는 제브라피시 고환에서 분리된 정자 세포에서 핵 표면에 있는 텔로미어 및 염색체 관련 단백질의 위치를 탐구하는 방법을 기술합니다. 우리는 이 방법이 고환의 크기에 조정을 가진 그밖 teleost 종에 있는 정액 세포의 분석을 위해 적용될 것이라는 점을 기대합니다.
소수의 항체만이 제브라피쉬 메오틱 단백질로 제기되었지만, 우리는 인간(h) 또는 마우스(m) 단?...

성적인 재생산은 두 개의 haploid gametes의 조합을 통해 진행, 각각 체세포세포의 염색체 보완의 절반을 들고. Meiosis는 DNA 복제의 1 개의 라운드 및 염색체 분리의 2개의 연속적인 라운드를 통해 haploid gametes를 생성하는 전문화한 세포 분열입니다. prophase I에서 상동 염색체 (homologs)는 페어링, 재조합 및 시냅시스를 거쳐야하며, 후자는 횡 필라멘트에 의해 브리지 된 두 개의 상동 축을 포함하는 시냅톤 복합체의 형성을 특징으로하는 Sycp1(그림 1A,B). 이러한 프로세스를 제대로 실행하지 못하면 인간1의유산의 주요 원인인 이수성 게임의 생산으로 이어질 수 있습니다. 페어링, 재조합 및 시냅시스 사이의 조정에 대한 우리의 지식은 효모, C. 예쁜꼬마선충,마우스 및 초파리와같은 광범위한 유기체에 대한 연구에 의해 촉진되었습니다2. 상동 염색체 쌍과 분리의 일반적인 과정은 잘 보존되는 동안, 재결합 및 시냅증에 대한 의존성과 이러한 이벤트의 순서는 다양합니다.
상동 재조합을 개시하는 Meiotic 이중 가닥 휴식 (DSB) 형성은 렙토텐 동안 꽃다발에 클러스터된 텔로미어 근처에서 발생하며 시냅스는3,4직후에 계속됩니다. 이러한 DSB 형성 및 시냅스 개시의 구성은 또한 마우스5,6,7,8에서남성 남성 남성 만기증의 특징이며, 제브라피쉬가 인간 정자 발생을 위한 모델로 작용할 수 있음을 시사한다. 또한 제브라피시 인자해를 연구하는 몇 가지 실용적인 이점이 있습니다. 남성과 여성 모두 성인기 동안 gametogenesis을 겪고, 그들의 생식선쉽게 접근 할 수 있으며, 자손의 수백은 하나의 십자가에서 생성됩니다. 부가적으로, 배아는 투명하고 외부적으로 개발되며, 이는 이수엽 게임테스3,9로인한 배아 발달에서 수차의 조기 발견을 용이하게 한다. 제브라피시를 사용하는 단점은 성숙도(~60일)에 도달하는 속도가 느리며 핵 표면 확산에 필요한 물질의 양은 크기에 따라 ~10-20마리의 성인 동물로부터 수집되어야 한다는 것입니다.
meiotic 염색체 퍼짐 준비는 meiotic 염색체 역학의 중요한 서명이 조사될 수 있기 때문에, 모든 모형 유기체에 걸쳐 염색체 역학을 공부하기 위한 중요한 공구입니다. 제브라피시에서, 메오피시 프로그램 및 핵 조직의 진행의 주요 측면은 핵 표면 스프레드를 조사하여 해부되었으며, 여기서 는 염색체 스프레드로 지칭되며, FISH3,4,9,10,11,12에의한 단백질 및/또는 핵산의 면역형광 검출을 위한 항체와 함께 있다. 실제로, 꽃다발내의 군집된 텔로미어의 편광 국소화는 스프레드 제제에서 보존될 수있다(도 1C). 최근에는 형광 검출 방법 및 초고해상도 현미경 검사법과 함께 제브라피쉬 정자 염색체 스프레드를 사용하여 제브라피쉬 텔로미어 역학, 상동성 염색체 페어링, 이중 가닥 파손 국소화 및 시냅스의 상세한 진행을 해명하여 주요 meiotic 전환에서3. 여기에서 우리는 제브라피쉬 고환의 정자 세포에서 염색체 스프레드를 준비하고 그 후에 염색체 관련 단백질의 반복된 텔로미어 서열 및 면역 형광 검출에 형광 펩티드 핵산 (PNA) 탐사기로 그(것)들을 얼룩하는 방법을 제시합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde, methanol-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 mm glasscoverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>363696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bag</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Used to make plastic coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>203775-500uL</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-zfSycp1</td>
			<td>Generated by Burgess lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10014CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Two are required for dissecting the testes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89429-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11042</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-hDMC1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8973</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-3683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>230401V (Model 5420)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Model Classic C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimerbly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Used for the humidity chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hamsterSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hMLH1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550838</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hRPA</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>MABE285</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Alexa647</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1013</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Cy3</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRPA</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-244A</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150292</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRad51</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX100469</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercut Scissors, 30&#176; angle, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-822-353</td>
			<td>Can also use any pair of small scissors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9897184</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9253-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes

Meiosis는 성적인 재생산을 위한 haploid gametes를 만드는 데 필요한 중요한 셀룰러 프로세스입니다. 모형 유기체는 적당한 염색체 분리를 지키는 페어링, 시냅스 및 재조합 사건을 포함하여 meiotic prophase 도중 일어나는 염색체 사건을 이해하는 중요한 역할을 했습니다. 마우스가 이 프로세스의 근본적인 분자 기계장치를 이해하기 위한 중요한 모형이 되는 동안, 이 시스템의 모든 meiotic 사건은 인간 적인 사람 막이오시스와 유사하지 않습니다. 우리는 최근에 인간 정자 발생의 모형으로 zebrafish의 흥미진진한 잠재력을 설명했습니다. 여기에서 우리는 염색체 퍼짐 준비에 있는 meiotic 염색체 그리고 관련있는 단백질을 구상하는 우리의 방법을, 상세히 기술합니다. 이러한 제제는 염색체 구조의 고분해능 분석을 허용하는 장점이 있다. 첫째, 우리는 성인 얼룩말에서 고환을 해부하는 절차를 설명하고, 그 다음에 세포 해리, 용해 및 염색체의 확산을 설명합니다. 다음으로, 우리는 마이오성 색소 단백질의 국소화, 면역 형광 검출 및 핵산 서열, 사이투 혼성화 (FISH)의 형광에 의해 국소화를 검출하는 절차를 설명합니다. 이러한 기술은 제브라피시 시스템에서 메오틱 크로마틴 아키텍처의 세포학적 분석을 위한 유용한 도구 세트를 포함한다. zebrafish 지역 사회에 있는 연구원은 이 기술을 빨리 마스터하고 생식 기능의 그들의 표준 분석에 통합할 수 있어야 합니다.

우리는 제브라피쉬 정자 세포 확산 제제를 준비하고 시각화하는 방법을 설명했습니다. 올바르게 수행하면, 우리의 절차는 잘 확산, 비 겹치는 핵을 산출한다. 이러한 핵을 회복하려면, 트립신에서 충분한 시간 동안 고환을 치료하고 적절한 수의 DNase I 처리를 개시 물질(즉, 고환)의 적절한 양을 가지는 것이 중요하다. 이러한 스프레드는 프로페이즈 I. 도 1</...

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

핵 표면 퍼짐은 만피증 도중 염색체 사건을 공부하기 위한 필수적인 공구입니다. 여기서 우리는 제브라피쉬 정자세포로부터 의한 1단계 진행 중에 메오성 염색체를 준비하고 시각화하는 방법을 시연한다.

제브라피쉬 정자세포에서 메오틱 염색체 스프레드 의 준비

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Zebrafish는 동종 염색체 페어링, 시냅시스 및 재결합을 포함한 메이오증의 염색체 이벤트를 연구하기위한 우수한 척추 동물 모델로 부상하고 있습니다. 이 핵 표면 확산 프로토콜은 우리가 슈퍼 해상도 현미경 을 사용하여 메이오틱 염색체 아키텍처의 주요 기능을 시각화 할 수있게했습니다. 연구원은 다른 제브라피시 퍼짐 프로토콜보다는 적은 파편으로 슬라이드 당 잘 퍼진 핵의 수백을 기대할 수 있습니다.이 절차의 가장 기술적으로 도전적인 부분은 피부에 근접하고 또한 다른 장기에 부착되기 때문에 제브라피시 고환의 해부입니다. 해부 절차를 시각화하면 연구원들이 동물의 조직에 내장 된 gonad를 볼 때 무엇을 기대해야하는지 알 수 있습니다. 수컷 얼룩말물고기를 안락사한 후, 작은 가위로 한 번에 한 마리의 물고기를 참수한 다음 마이크로 가위를 사용하여 복부 중간선을 따라 절단하여 신체 구멍을 노출시합니다.실리콘 코팅 페트리 접시에 생선을 놓고 1X PBS의 얕은 풀로 덮습니다. 1.65X 배율의 현미경하에서 집게를 사용하여 고환을 해부합니다. 가능한 한 고환에서 지방과 주변 조직을 제거합니다.gonad는 해부 범위 빛 아래 반투명 으로 표시되며 주변 지방은 약간 어두운 모양을 가질 수 있습니다. 지방의 일부 금액은 절차를 방해하지 않고 gonad에 남아있을 수 있습니다. 해부된 각 고환을 DMEM 2밀리리터가 있는 5밀리리터 튜브에 직접 넣고 얼음을 유지합니다.고환 세포를 해리하려면 고환이 있는 5개의 밀리리터 튜브에 콜라게나제 용액 200마이크로리터를 추가합니다. 용액을 여러 번 반전시켜 혼합합니다. 섭씨 32도에서 100 RPM에서 인큐베이터 셰이커에서 고환을 수평으로 흔들어 부드럽게 흔들어 줍니다.10분마다 튜브를 빠르게 반전하여 해리를 용이하게 합니다. 한 시간 후, DMEM은 흐리고 고환은 작은 덩어리에 있습니다. 고환은 콜라게나아제에서 배양되는 동안, 섭씨 37도에 0.1 어금니 자당 용액의 100 마이크로리터를 미리 떼어.콜라게나아제를 씻어내려면 DMEM을 5밀리리터의 최종 볼륨에 추가하고 튜브를 몇 번 반전시면 됩니다. 실온에서 3 분 동안 200g에서 고환을 펠렛. 2 밀리리터만 남을 수 있도록 상퍼의 밀리리터 3밀리리터를 제거합니다.DMEM 세척을 두 번 더 반복합니다. 마지막 DMEM 세척 후, 슈퍼 나티미터의 4 밀리리터를 제거하고 DMEM의 1 밀리리터, 트립신 용액 200 마이크로 리터, DNase I 솔루션의 20 마이크로 리터를 추가합니다. 튜브를 몇 번 반전하여 용액을 혼합합니다.100 RPM에서 32도에서 튜브를 수평으로 흔들어 줍니다. 5분마다 튜브를 빠르게 반전하여 해리를 용이하게 합니다. 5~15분 후에 DMEM 솔루션에는 몇 덩어리만 포함되어 있습니다.트립신 억제제 용액 500 마이크로리터와 DNase I 용액 50 마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 몇 번 섞은 다음 실온에서 3 분 동안 200g에서 잠시 회전하여 튜브 캡 또는 튜브의 측면에 부착 할 수있는 액체 또는 덩어리를 제거하십시오. 튜브를 얼음 위에 놓고 남은 덩어리의 해리를 용이하게하기 위해 플라스틱 이송 파이펫으로 2 분 동안 반복적으로 피펫을 사용하여 셀 서스펜션을 다시 중단하십시오.셀 서스펜션이 이송 파이펫의 전구로 들어가지 않도록 합니다. 그런 다음 DMEM으로 100 미크론 세포 스트레이너를 미리 적시고 얼음 위에 50 밀리리터 튜브 위에 놓습니다. 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 한 번에 한 방울의 스트레이너를 통해 셀 서스펜션을 전송합니다.플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 새로운 5밀리리터 튜브로 여과물을 옮김합니다. 필터 의 밑면에 부착 된 풀이 있는 세포를 수집해야합니다. 튜브에 DMEM을 추가하여 5밀리리터의 최종 볼륨에 추가합니다.실온에서 5 분 동안 200g의 세포를 펠렛. 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상체를 제거하고 5 개의 DNase I 용액을 펠릿에 직접 추가하십시오. 그런 다음 빈 마이크로 센심 분리기 튜브 랙을 따라 튜브의 외부 바닥을 4 ~ 5 번 부드럽게 긁어 내어 DNase I 용액과 펠릿을 섞는다.DMEM을 5밀리리터의 최종 볼륨에 추가하고 튜브를 여러 번 반전시켜 용액을 혼합합니다. 실온에서 2 분 동안 200g의 셀 서스펜션을 펠렛하십시오. DNase 처리를 DMEM의 추가 시 재중단 된 펠릿이 뭉크하지 않을 때까지 1 ~ 3 번 추가로 반복하십시오.마지막 스핀 후 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상체를 제거하십시오. 다음으로, 1X PBS의 밀리리터 1개를 추가하고 빈 튜브 랙을 따라 튜브의 바깥쪽 바닥을 부드럽게 긁어내어 펠릿을 다시 놓습니다. 5 분 동안 200 g에서 세포 현탁액을 펠릿한 다음 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 슈퍼 나탄을 제거하십시오.조리개를 넓게 하기 위해 200 마이크로리터 파이펫 팁의 끝에서 3밀리미터를 자른다. 컷 파이펫 팁으로 0.1 어금니 자당 용액80 마이크로리터로 펠릿을 위아래로 피펫팅하여 재보페팅합니다. 셀 서스펜션이 실온에서 3분간 앉게 하십시오.다음으로 파이펫 팁으로 100 마이크로리터100마이크로리터로 0.15%트리톤 X-100으로 코팅합니다. 그런 다음 자당 세포 서스펜션의 18 마이크로리터를 긴 가장자리에 수직으로 직선으로 슬라이드의 중앙에 추가합니다. 모든 모서리에 셀 서스펜션의 확산을 용이하게하기 위해 앞뒤로 슬라이드를 기울이십시오.포름알데히드 용액이 건조되는 것을 방지하기 위해 약간 금이 간 열린 습도 챔버에 슬라이드를 평평하게 놓습니다. 밤새 어두운 서랍에 습도 챔버를 놓습니다. 아침에는 습도 챔버에서 뚜껑을 제거하고 슬라이드가 완전히 건조할 수 있도록 합니다.슬라이드를 코플린 항아리에 넣고 코플린 항아리를 증류수로 채웁니다. 실온에서 부드러운 흔들림으로 5분간 배양하세요. 물을 붓고 항아리를 1~250개의 습윤 제로 채웁니다.실온에서 부드럽게 흔들리며 각각 5분간 2회 씻으시면 됩니다. 슬라이드가 완전히 건조하고 얼룩될 때까지 영하 20도에 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜은 잘 퍼진 비 겹치는 핵을 산출하는 제브라피시 정자 세포 확산을 준비하고 시각화하는 방법을 설명했습니다.왼쪽패널에는 메이오틱 프로페이즈, 렙토텐, 초기 지고틴, 파시텐의 3단계가 있습니다. 텔로미어는 각 단계에 대해 마젠타를 염색했다. 부족한 DNase I 처리로 인한 품질 스프레드의 예가 여기에 표시됩니다.SYCP3에 염색된 메이오성 염색체는 세포가 슬라이드에 제대로 퍼지는 것을 방지하는 점성 자당 세포 현탁액때문에 중첩된 핵을 나타낸다. 정확한 양의 시동 재료로 시작하여 트립신에서 적절한 시간 동안 제브라피시 고환을 치료하고, 필요한 수의 DNase I 치료를 수행하지 못하면 핵이나 덩어리핵이 거의 발생할 수 있다. 적절한 PPE는 포름알데히드로 작업 할 때 항상 착용해야합니다.확산 절차에 따라 염색체는 다양한 염색체 구조뿐만 아니라 이중 가닥 브레이크를 시각화하여 메이오틱 이벤트의 타이밍 의존성 및 국소화를 분석할 수 있습니다. 우리의 기술은 얼룩말 물고기 염색체 기능 및 텔로미어 꽃다발에 따라 마우스 보다는 인간 적인 정자 발생의 더 나은 모형일 지도 모르다는 것을 보여주는 길을 포장했습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

연구

유전학

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

신속한 방사선 Biodosimetry로 자동 Dicentric 염색체 식별 (ADCI) 및 복용량 추정

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

풀링된 shRNA MeCP2 재 활성화 비활성화 X 염색체에 대 한 화면

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

비활성 X 염색체에 대 한 Mecp2의 약리학 적 재 활성화를 위한 비 랜덤 마우스 모델

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

정량적 염색체 형성(4C)에 의한 배아체에서 증강-프로모터 접촉 식별

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

사용된 배양 배지를 사용한 인간 착상 전 배아의 염색체 스크리닝: 샘플 수집 및 염색체 배합 분석

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

길이 척도에 걸친 염색체 형태 포착

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...