Name: preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Vi takker Trent Newman og Masuda Sharifi for kommentarer til manuskriptet og An Nguyen for å bidra til å optimalisere metoder for spredning og flekker kromosomer fra sebrafisk meiocytes. Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 GM079115 tildelt S.M.B.

Alle metoder som involverte sebrafisk ble utført ved hjelp av etiske standarder godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved UC Davis.
1. Kromosom spredning prosedyre
MERK: Følgende protokoll er utformet for å lage 4-6 lysbilder, med hundrevis av spredte meiotiske kjerner per lysbilde. Antall testiklene som brukes vil avhenge av størrelsen på fisken. Forvent å bruke 20 dyr på ~ 60 dager etter befruktning (dpf) og 15 dyr på ~ 6 måneder etter bef...

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li><li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks,+synapsis,+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).</li><li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish.">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li><li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+recombination+in+human+males.">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li><li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+studies+of+human+meiosis:+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at,+or+prior+to,+establishment+of+double-strand+breaks.">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075 (2013).</li><li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes.">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442 (2014).</li><li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male.">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Saito, K., Siegfried, K. R., N&#252;sslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants.">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li><li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+by+breaking+and+repairing:+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination.">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li><li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females.">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li><li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes.">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).</li><li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+chiasmata+and+interference.">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li><li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies.">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li><li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene.">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).</li></ol>

Her beskriver vi metoder for å undersøke plasseringen av telomerer og kromosom-tilknyttede proteiner i kjernefysisk overflate sprer seg fra spermatocytter isolert fra sebrafisk testikler. Vi forventer at disse metodene vil være anvendelig for analyse av spermatocytter i andre teleostarter med justering av størrelsen på testis.
Mens bare noen få antistoffer har blitt hevet til sebrafisk meiotiske proteiner, har vi hatt suksess ved hjelp av følgende antistoffer hevet til menneskelige (h) ...

Seksuell reproduksjon fortsetter gjennom kombinasjonen av to haploid gametes, hver bærer halvparten av kromosomkomplement av en somatisk celle. Meiosis er en spesialisert celledivisjon som produserer haploid gametes gjennom en runde DNA-replikasjon og to påfølgende runder med kromosomsegregering. I profase I må homologe kromosomer (homologer) gjennomgå paring, rekombinasjon og synapsis, hvorav sistnevnte er preget av dannelsen av synaptonemal-komplekset som består av to homologakser brolagt av den tverrgående filamentet, Sycp1 (Figur 1A,B). Unnlatelse av å utføre disse prosessene kan føre til produksjon av aneuploid gametes, som er en ledende årsak til spontanaborter hos mennesker1. Vår kunnskap om koordinering mellom paring, rekombinasjon og synapsis har blitt tilrettelagt av studier i et bredt spekter av organismer, som gjær, C. elegans,mus og Drosophila, blant andre2. Mens den generelle prosessen med homologk kromosom paring etterfulgt av segregering er godt bevart, er avhengigheten av rekombinasjon og synapsis og rekkefølgen på disse hendelsene varierer.
Meiotisk dobbel-strand pause (DSB) formasjon, som initierer homolog rekombinasjon, oppstår nær telomeres klynget i buketten under leptoten og synapsis følger kort tid etter3,4. Denne konfigurasjonen av DSB dannelse og synapsis initiering er også et karakteristisk for mannlig meiosis hos mennesker, men ikke i mus5,6,7,8, noe som tyder på at sebrafisk kan tjene som en modell for menneskelig spermatogenese. Det er også flere praktiske fordeler ved å studere sebrafisk meiosis. Både menn og kvinner gjennomgår gametogenesis gjennom voksen alder, deres gonader er lett tilgjengelig, og hundrevis av avkom genereres fra et enkelt kors. I tillegg er embryoene gjennomsiktige og utvikler seg eksternt, noe som letter tidlig påvisning av avvik i embryonisk utvikling på grunn av aneuploid gametes3,9. Ulemper ved å bruke sebrafisk er at de er trege til å nå seksuell modenhet (~ 60 dager) og mengden materiale som trengs for kjernefysiske overflatespreader må samles inn fra ~ 10-20 voksne dyr, avhengig av deres størrelse.
Meiotiske kromosomspredningspreparater er et viktig verktøy for å studere kromosomdynamikk på tvers av alle modellorganismer, siden viktige signaturer av meiotisk kromosomdynamikk kan undersøkes. I sebrafisk har viktige aspekter ved utviklingen av meiotisk program og kjernefysisk organisasjon blitt dissekert gjennom sondering kjernefysiske overflatespreader, referert til her som kromosomspreader, med antistoffer for immunofluorescensdeteksjon av proteiner og/ eller nukleinsyrer av FISH3,4,9,10,11,12. Faktisk kan polarisert lokalisering av grupperte telomerer i buketten bevares i spredningspreparatet (Figur 1C). Nylig har vi brukt sebrafisk spermatocyte kromosom sprer seg sammen med fluorescens deteksjonsmetoder og superoppløsning mikroskopi for å belyse den detaljerte progresjonen av sebrafisk telomere dynamikk, homologkkromosom paring, dobbel-strand pause lokalisering, og synapsis på viktige meiotiske overganger3. Her presenterer vi metoder for å forberede kromosomsprer fra spermatocytter av sebrafisktestiklene og deretter flekker dem med fluorescerende peptid kjernesyre (PNA) sonder til gjentatte telomersekvenser og immunofluorescensdeteksjon av kromosom assosierte proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde, methanol-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 mm glasscoverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>363696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bag</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Used to make plastic coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>203775-500uL</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-zfSycp1</td>
			<td>Generated by Burgess lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10014CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Two are required for dissecting the testes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89429-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11042</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-hDMC1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8973</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-3683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>230401V (Model 5420)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Model Classic C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimerbly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Used for the humidity chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hamsterSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hMLH1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550838</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hRPA</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>MABE285</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Alexa647</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1013</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Cy3</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRPA</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-244A</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150292</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRad51</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX100469</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercut Scissors, 30&#176; angle, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-822-353</td>
			<td>Can also use any pair of small scissors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9897184</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9253-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes

Meiosis er den viktigste cellulære prosessen som kreves for å lage haploid gametes for seksuell reproduksjon. Modellorganismer har vært medvirkende til å forstå kromosomhendelsene som finner sted under meiotisk profase, inkludert paring, synapsis og rekombinasjonshendelser som sikrer riktig kromosomsegregering. Mens musen har vært en viktig modell for å forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn for disse prosessene, er ikke alle meiotiske hendelser i dette systemet analoge med menneskelig meiose. Vi har nylig demonstrert det spennende potensialet til sebrafisken som en modell av human spermatogenese. Her beskriver vi i detalj våre metoder for å visualisere meiotiske kromosomer og tilhørende proteiner i kromosomspredningspreparater. Disse preparatene har fordelen av å tillate høyoppløselig analyse av kromosomstrukturer. For det første beskriver vi prosedyren for å dissekere testiklene fra voksen sebrafisk, etterfulgt av celledissosiasjon, lyse og spredning av kromosomene. Deretter beskriver vi prosedyren for å oppdage lokalisering av meiotiske kromosomproteiner, ved immunofluorescensdeteksjon og nukleinsyresekvenser, ved fluorescens i situ hybridisering (FISH). Disse teknikkene utgjør et nyttig sett med verktøy for cytologisk analyse av meiotisk kromatinarkitektur i sebrafisksystemet. Forskere i sebrafisk samfunnet bør være i stand til raskt å mestre disse teknikkene og innlemme dem i sine standard analyser av reproduktiv funksjon.

Vi har skissert en metode for å forberede og visualisere sebrafisk spermatocyte spredning preparater. Når den utføres riktig, gir vår prosedyre godt spredning, ikke-overlappende kjerner. For å gjenopprette slike kjerner er det viktig å ha riktig mengde startmateriale (dvs. testiklene), behandle testiklene i tilstrekkelig tid i trypsin og et tilstrekkelig antall DNase I-behandlinger. Disse spreadene kan deretter være farget for telomerer og meiotiske proteiner for å studere meiotis...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Kjernefysiske overflatespreader er et uunnværlig verktøy for å studere kromosomhendelser under meiosis. Her demonstrerer vi en metode for å forberede og visualisere meiotiske kromosomer under profase I fra sebrafiskspermatocytter.

Fremstilling av meiotiske kromosomspreader fra sebrafisk spermatocytter

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Sebrafisk fremstår som en utmerket virveldyrmodell for å studere kromosomhendelsene av meiose, inkludert homolog kromosomparing, synapsis og rekombinasjon. Denne kjernefysiske overflatespredningsprotokollen har gjort oss i stand til å visualisere viktige funksjoner i meiotisk kromosomarkitektur ved hjelp av mikroskopi med super oppløsning. Forskere kan forvente hundrevis av godt spredte kjerner per lysbilde med mindre rusk enn andre sebrafisk spredning protokoller.Den mest teknisk utfordrende delen av denne prosedyren er disseksjon av sebrafisk testiklene som det er i nærheten av huden og er også festet til andre organer. Visualisering av disseksjonsprosedyren vil tillate forskere å vite hva de kan forvente når de ser gonad innebygd i dyrets vev. Etter euthanizing mannlig sebrafisk, halshugge en fisk om gangen med liten saks og deretter bruke mikro saks for å kutte langs ventral midtlinjen for å avsløre kroppshulen.Legg fisken i en silikonbelagt petriskål og dekk ved et grunt basseng med 1X PBS. Under et mikroskop ved 1,65 X forstørrelse, dissekere testiklene ved hjelp av tang. Fjern så mye som fett og omkringliggende vev fra testiklene som mulig.Gonad vil virke gjennomskinnelig under disseksjon omfang lys mens det omkringliggende fettet kan ha et litt mørkere utseende. En viss mengde fett kan stå på gonad uten å hindre prosedyren. Tilsett hver dissekert testiklene direkte i en fem milliliter rør med to milliliter DMEM og holde på isen.For å fjerne testiklene cellene, tilsett 200 mikroliter collagenase løsning til fem milliliter rør med testiklene. Bland løsningen ved å invertere den flere ganger. Rist testiklene forsiktig i en inkubator shaker horisontalt ved 100 RPM ved 32 grader Celsius.Raskt invertere røret hvert 10. Etter en time er DMEM overskyet og testiklene er i små biter. Mens testiklene inkuberes i kollagennase, prewarm 100 mikroliter på 0,1 molar sukrose løsning til 37 grader Celsius.For å vaske ut kollagenase, legg DMEM til et endelig volum på fem milliliter og inverter røret et par ganger. Pellet testiklene på 200 g i tre minutter ved romtemperatur. Fjern tre milliliter av supernatanten slik at bare to milliliter gjenstår.Gjenta DMEM-vasken to ekstra ganger. Etter den siste DMEM vask, fjerne fire milliliter av supernatant og legge til en milliliter DMEM, 200 mikroliter trypsin løsning, og 20 mikroliter DNase I løsning. Inverter røret et par ganger for å blande løsningen.Rist røret horisontalt ved 32 grader Celsius ved 100 o/min. Raskt invertere røret hvert femte minutt for å lette dissosiasjon. Etter fem til 15 minutter inneholder DMEM-løsningen bare noen få klumper.Tilsett 500 mikroliter av trypsinhemmerløsningen og 50 mikroliter DNase I-oppløsning. Inverter røret et par ganger for å blande deretter kort spinne ned på 200 g i tre minutter ved romtemperatur for å fjerne væske eller klumper som kan feste seg til rørhetten eller siden av røret. Plasser røret på isen og gjenoppliv cellefjæringen ved gjentatte ganger å pipetter opp og ned med en plastoverføringspipette i to minutter for å lette dissosiasjon av eventuelle gjenværende klumper.Kontroller at cellefjæringen ikke går inn i pæren på overføringspipetten. Før deretter en 100 mikron celle sil med DMEM og plassere den på toppen av en 50 milliliter rør på is. Overfør cellefjæringen gjennom silen en dråpe om gangen ved hjelp av en plastoverføringspipette.Overfør filtratet ved hjelp av en plastoverføringspipette til et nytt fem milliliter rør. Pass på å samle de samlede cellene festet til undersiden av filteret. Legg DMEM inn i røret til et endelig volum på fem milliliter.Pellet cellene ved 200 g i fem minutter ved romtemperatur. Fjern så mye supernatant som mulig uten å forstyrre pellet og tilsett fem mikroliter DNase I-løsning direkte inn i pelleten. Bland deretter pelleten med DNase I-løsningen ved å forsiktig skrape den utvendige bunnen av røret fire til fem ganger langs et tomt mikrocentrifugerørstativ.Tilsett DMEM i et endelig volum på fem milliliter og bland løsningen ved å invertere røret flere ganger. Pellet cellesuspensjonen ved 200 g i to minutter ved romtemperatur. Gjenta DNase-behandlingen ytterligere én til tre ganger til den resuspenderte pelleten ikke klumper seg ved tilsetning av DMEM.Etter siste spinn, fjern så mye så overnaturlig som mulig uten å forstyrre pellet. Deretter legger du til en milliliter 1X PBS og bruker pelleten forsiktig ved å skrape utsiden av røret langs et tomt rørstativ. Pellet cellesuspensjonen ved 200 g i fem minutter og fjern deretter så mye supernatant som mulig uten å forstyrre pelleten.Skjær tre millimeter fra enden av en 200 mikroliter pipettespiss for å utvide blenderåpningen. Med den kuttede pipettespissen, resuspend pellet i 80 mikroliter på 0,1 molar sukrose løsning ved å pipettere opp og ned. La cellefjæringen sitte ved romtemperatur i tre minutter.Deretter, med en pipettespiss, belegg ett lysbilde med 100 mikroliter på 1% formaldehyd med 0,15% Triton X-100. Tilsett deretter 18 mikroliter av sukrosecelleopphenget på midten av lysbildet i en rett linje vinkelrett på langsiden. Vipp lysbildet frem og tilbake for å lette spredningen av cellefjæringen til alle hjørner.Plasser lysbildene flatt ned i et litt sprukket åpent fuktighetskammer for å hindre at formaldehydløsningen tørker. Plasser fuktighetskammeret i en mørk skuff over natten. Om morgenen, fjern lokket fra fuktighetskammeret og la lysbildene tørke helt.Plasser skliene i en coplin krukke og fyll deretter coplin krukken med destillert vann. Inkuber i fem minutter med mild risting ved romtemperatur. Hell ut vannet og fyll krukken med en til 250 fuktemiddel.Vask to ganger i fem minutter hver med mild risting ved romtemperatur. La lysbildene tørke helt og oppbevares ved minus 20 grader Celsius til de er farget. Denne protokollen skisserte en metode for å forberede og visualisere sebrafisk spermatocytt spredning som gir godt spredt ikke-overlappende kjerner.Panelene til venstre viser tre stadier av meiotisk prophase, leptotene, tidlig zygotene og pachytene. Telomerer var farget magenta for hvert trinn. Et eksempel på dårlig kvalitet sprer seg på grunn av utilstrekkelig DNase I behandlinger er vist her.Meiotiske kromosomer farget for SYCP3 indikerer overlappende kjerner på grunn av en viskøs sukrose celle suspensjon som hindrer celler fra å spre seg riktig på lysbildet. Det er svært viktig å starte med riktig mengde startmateriale, behandle sebrafisk testiklene for riktig tid i trypsin, og utføre det nødvendige antall DNase I behandlinger som unnlatelse av å gjøre det kan føre til svært få kjerner eller klumpete kjerner. Riktig PPE bør alltid brukes når du arbeider med formaldehyd.Etter spredningsprosedyren kan kromosomer farges for å visualisere ulike kromosomale strukturer samt dobbelttrådbrudd for å analysere tidsavhengigheten og lokaliseringen av meiotiske hendelser. Vår teknikk har banet vei for å vise at sebrafisk kan være en bedre modell av menneskelig spermatogenese enn mus basert på kromosomfunksjonene og telomerbuketten.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Eksempel forberedelse og analyse av RNASeq-baserte genuttrykk Data fra sebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Rask stråling Biodosimetry automatisert for Dicentric kromosom identifikasjon (ADCI) og Dose estimering

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Grupperte shRNA skjermen for aktivering av MeCP2 på inaktive X-kromosomet

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow inngang genomet sekvensering biblioteket forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøven

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Høy gjennomstrømming DNA utvinning og genotyperingteknologi av 3dpf sebrafisk larver av Fin klipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høy gjennomstrømming identifikasjon av regulatoriske gensekvenser med neste generasjons sekvensering av runde kromosom konformasjon fange (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

En ikke-tilfeldig Mouse modell for farmakologisk reaktivering av Mecp2 på inaktiv X-kromosom

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identifikasjon av enhancer-promoter kontakter i embryoid organer av kvantitative kromosom conformation capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

Kromosomscreening av humane preimplantasjonsembryoer ved bruk av brukt kulturmedium: prøveinnsamling og kromosomal ploidianalyse

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Fange kromosomkonformasjon på tvers av lengdeskalaer

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...