Name: preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00
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Agradecemos a Trent Newman e Masuda Sharifi por comentários sobre o manuscrito e An Nguyen por ajudarem a otimizar métodos para espalhar e manchar cromossomos de meiocitos de zebrafish. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01 GM079115 concedido à S.M.B.

Todos os métodos envolvendo zebrafish foram realizados utilizando padrões éticos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UC Davis.
1. Procedimento de propagação de cromossomo
NOTA: O protocolo a seguir foi projetado para criar slides 4-6, com centenas de núcleos meioéticos espalhados por slide. O número de testículos utilizados dependerá do tamanho do peixe. Espera-se utilizar 20 animais em ~60 dias após a fertilização (DPF) e...

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	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li><li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks,+synapsis,+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).</li><li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish.">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li><li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+recombination+in+human+males.">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li><li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+studies+of+human+meiosis:+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at,+or+prior+to,+establishment+of+double-strand+breaks.">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075 (2013).</li><li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes.">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442 (2014).</li><li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male.">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Saito, K., Siegfried, K. R., N&#252;sslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants.">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li><li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+by+breaking+and+repairing:+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination.">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li><li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females.">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li><li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes.">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).</li><li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+chiasmata+and+interference.">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li><li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies.">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li><li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene.">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).</li></ol>

Aqui descrevemos métodos para sondar a localização de telômeros e proteínas associadas ao cromossomo na superfície nuclear se espalha de espermatocitoses isolados de testículos de zebrafish. Esperamos que esses métodos sejam aplicáveis para análise de espermatocitocitos em outras espécies teleast com ajuste ao tamanho dos testículos.
Embora apenas alguns anticorpos tenham sido elevados para proteínas meioticas de zebrafish, tivemos sucesso usando os seguintes anticorpos levantados...

A reprodução sexual prossegue através da combinação de dois gametes haploides, cada um carregando metade do complemento cromossomo de uma célula somática. Meiosis é uma divisão de células especializadas que produz gametas haploides através de uma rodada de replicação de DNA e duas rodadas sucessivas de segregação de cromossomos. Na profase I, os cromossomos homônimos (homologs) devem passar por pareamento, recombinação e sinapse, sendo este último caracterizado pela formação do complexo sinaponômico que compreende dois eixos homolog a ponteados pelo filaverso transversal, Sycp1(Figura 1A,B). A não execução desses processos pode levar à produção de gametes aneuploides, que são uma das principais causas de abortos em humanos1. Nosso conhecimento da coordenação entre emparelhamento, recombinação e sinapse tem sido facilitado por estudos em uma ampla gama de organismos, como levedura, C. elegans,rato e Drosophila,entre outros2. Embora o processo geral de emparelhamento cromossomo homônimo seguido de segregação seja bem conservado, sua dependência da recombinação e sinopse e da ordem desses eventos varia.
A formação de quebra de fio duplo meiotic (DSB), que inicia a recombinação homóloga, ocorre perto de telômeros agrupados no buquê durante leptotene e a sinopse segue logo após3,4. Essa configuração de formação dsb e iniciação de sinapse também é uma característica da meiose masculina em humanos, mas não no rato5,6,7,8,sugerindo que os zebrafish podem servir de modelo para a spermatogênese humana. Há também várias vantagens práticas de estudar a meio-peixe-zebra. Machos e fêmeas passam por gametogênese durante toda a idade adulta, suas gônadas são facilmente acessíveis, e centenas de descendentes são gerados a partir de uma única cruz. Além disso, os embriões são transparentes e se desenvolvem externamente, o que facilita a detecção precoce de aberrações em desenvolvimento embrionário devido aos gametes aneuploides3,9. As desvantagens do uso de zebrafish são de que eles são lentos para atingir a maturidade sexual (~60 dias) e a quantidade de material necessário para propagações de superfície nuclear deve ser coletada de ~10-20 animais adultos, dependendo de seu tamanho.
Os preparativos de disseminação do cromossomo meioético são uma ferramenta vital para estudar dinâmicas cromossãs em todos os organismos modelo, uma vez que as principais assinaturas da dinâmica do cromossomo meioético podem ser sondadas. Em zebrafish, aspectos-chave da progressão do programa de meiotética e organização nuclear foram dissecados através da sondagem de superfícienuclear espalhadas, referidas aqui como spreads cromossomos, com anticorpos para detecção de proteínas e/ou ácidos nucleicos pelo PEIXE3,4,9,10,11. De fato, a localização polarizada de telômeros agrupados no buquê pode ser preservada na preparação de spread(Figura 1C). Recentemente, usamos cromossomo de espermatoósico de zebrafish, se espalha junto com métodos de detecção de fluorescência e microscopia de superresolução para elucidar a progressão detalhada da dinâmica do telômero de zebrafish, emparelhamento de cromossomo homólogo, localização de quebra de fio duplo e sinopse nas principais transições meioticas3. Aqui apresentamos métodos para preparar spreads cromossomos de espermatocitocitos dos testículos de zebrafish e, posteriormente, manchá-los com sondas de ácido nuclecítico de peptídeo fluorescente (PNA) a repetidas sequências de telômero e detecção de imunofluorescência de proteínas associadas ao cromossomo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde, methanol-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 mm glasscoverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>363696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bag</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Used to make plastic coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>203775-500uL</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-zfSycp1</td>
			<td>Generated by Burgess lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10014CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Two are required for dissecting the testes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89429-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11042</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-hDMC1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8973</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-3683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>230401V (Model 5420)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Model Classic C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimerbly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Used for the humidity chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hamsterSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hMLH1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550838</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hRPA</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>MABE285</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Alexa647</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1013</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Cy3</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRPA</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-244A</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150292</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRad51</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX100469</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercut Scissors, 30&#176; angle, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-822-353</td>
			<td>Can also use any pair of small scissors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9897184</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9253-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes

A meiose é o processo celular-chave necessário para criar gametes haploides para reprodução sexual. Os organismos modelo têm sido fundamentais para entender os eventos cromossomos que ocorrem durante a profase do meioético, incluindo a combinação, a sinapse e eventos de recombinação que garantem a segregação adequada do cromossomo. Embora o mouse tenha sido um modelo importante para entender os mecanismos moleculares subjacentes a esses processos, nem todos os eventos meioticéticos neste sistema são análogos à meiose humana. Recentemente demonstramos o potencial excitante do zebrafish como um modelo de espermatogênese humana. Aqui descrevemos, em detalhes, nossos métodos para visualizar cromossomos meioóticos e proteínas associadas em preparações de propagação de cromossomos. Esses preparativos têm a vantagem de permitir a análise de alta resolução das estruturas cromossais. Primeiro, descrevemos o procedimento de dissecação de testículos de zebrafish adultos, seguido de dissociação celular, lise e disseminação dos cromossomos. Em seguida, descrevemos o procedimento para detectar a localização de proteínas cromossomos mestióticas, por detecção de imunofluorescência, e sequências de ácido nucleico, por fluorescência na hibridização situ (FISH). Essas técnicas compreendem um conjunto útil de ferramentas para a análise citológica da arquitetura de cromatina meiotic no sistema de zebrafish. Pesquisadores da comunidade de zebrafish devem ser capazes de dominar rapidamente essas técnicas e incorporá-las em suas análises padrão da função reprodutiva.

Traçamos um método para preparar a disseminação de espermatocitos de zebrafish. Quando realizado corretamente, nosso procedimento rende núcleos bem espalhados, não sobrepostos. Para recuperar tais núcleos, é importante ter a quantidade adequada de material inicial (ou seja, testículos), tratar testículos por tempo suficiente na trippsina e um número adequado de tratamentos de DNase I. Esses spreads podem então ser manchados para telômeros e proteínas mestióticas para estuda...

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Os spreads de superfície nuclear são uma ferramenta indispensável para estudar eventos cromossomos durante a meiose. Aqui demonstramos um método para preparar e visualizar cromossomos meioóticos durante a profase I de espermatotatocitos de zebrafish.

Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

O zebrafish está emergindo como um excelente modelo de vertebrado para estudar os eventos cromossômicos da meiose, incluindo pareamento de cromossomos homólogos, sinápsia e recombinação. Este protocolo de expansão da superfície nuclear nos permitiu visualizar características-chave da arquitetura cromossomo meiotic usando microscopia de super resolução. Os pesquisadores podem esperar centenas de núcleos bem espalhados por deslizamento com menos detritos do que outros protocolos de propagação de zebrafish.A parte mais desafiadora tecnicamente deste procedimento é a dissecação dos testículos de zebrafish, pois está próximo da pele e também está ligado a outros órgãos. Visualizar o procedimento de dissecção permitirá que os pesquisadores saibam o que esperar quando virem a gônada embutida no tecido do animal. Depois de eutanásia de zebrafish macho, decapitar um peixe de cada vez com uma tesoura pequena e, em seguida, usar micro tesouras para cortar ao longo da linha média ventral para expor a cavidade corporal.Coloque o peixe em uma placa de Petri revestida de silicone e cubra por uma piscina rasa de 1X PBS. Sob um microscópio a ampliação de 1,65X, disseco os testículos usando fórceps. Remova o máximo de gordura e tecido circundante possível dos testículos.A gônada aparecerá translúcida sob a luz do escopo de dissecção, enquanto a gordura circundante pode ter uma aparência ligeiramente mais escura. Alguma quantidade de gordura pode ser deixada na gôngasa sem impedir o procedimento. Adicione cada testículo dissecado diretamente em um tubo de cinco mililitros com dois mililitros de DMEM e mantenha no gelo.Para dissociar as células de testículos, adicione 200 microliters de solução de colagenase ao tubo de cinco mililitros com os testículos. Misture a solução invertendo-a várias vezes. Agite suavemente os testículos em um agitador de incubadora horizontalmente a 100 RPM a 32 graus Celsius.Inverta rapidamente o tubo a cada 10 minutos para facilitar a dissociação. Depois de uma hora, o DMEM fica nublado e os testículos estão em pequenos pedaços. Enquanto os testículos são incubados em colagenase, pré-aquecedor 100 microlitres de 0,1 solução de sacarose molar a 37 graus Celsius.Para lavar a colagemnase, adicione DMEM a um volume final de cinco mililitros e inverta o tubo algumas vezes. Pelota os testículos a 200 g por três minutos em temperatura ambiente. Remova três mililitros do supernatante para que apenas dois mililitros permaneçam.Repita a lavagem do DMEM duas vezes adicionais. Após a última lavagem do DMEM, remova quatro mililitros do supernatante e adicione um mililitro de DMEM, 200 microliters de solução de trippsina e 20 microliters de solução DNase I. Inverta o tubo algumas vezes para misturar a solução.Agite horizontalmente o tubo a 32 graus Celsius a 100 RPM. Inverta rapidamente o tubo a cada cinco minutos para facilitar a dissociação. Após cinco a 15 minutos, a solução DMEM contém apenas alguns aglomerados.Adicione 500 microliters da solução inibidora de trippsina e 50 microliters de solução DNase I. Inverta o tubo algumas vezes para misturar e, em seguida, gire brevemente a 200 g por três minutos à temperatura ambiente para remover líquidos ou aglomerados que possam aderir à tampa do tubo ou ao lado do tubo. Coloque o tubo no gelo e resuspenja a suspensão da célula, encanar repetidamente para cima e para baixo com uma pipeta de transferência de plástico por dois minutos para facilitar a dissociação de quaisquer aglomerados restantes.Certifique-se de que a suspensão da célula não vá para a lâmpada da pipeta de transferência. Em seguida, pré-molhar um coador de células de 100 mícrons com DMEM e colocá-lo em cima de um tubo de 50 mililitros no gelo. Transfira a suspensão da célula através do coador uma gota de cada vez usando uma pipeta de transferência de plástico.Transfira o filtrado usando uma pipeta de transferência de plástico para um novo tubo de cinco mililitros. Certifique-se de coletar as células agrupadas presas na parte inferior do filtro. Adicione DMEM no tubo a um volume final de cinco mililitros.Pelota as células a 200 g por cinco minutos em temperatura ambiente. Remova o máximo de supernascer possível sem perturbar a pelota e adicione cinco microliters de solução DNase I diretamente na pelota. Em seguida, misture a pelota com a solução DNase I raspando suavemente o fundo externo do tubo quatro a cinco vezes ao longo de um rack vazio de tubo de microcentrifuuge.Adicione o DMEM a um volume final de cinco mililitros e misture a solução invertendo o tubo várias vezes. Pelotar a suspensão do celular a 200 g por dois minutos em temperatura ambiente. Repita o tratamento DNase uma a três vezes adicionais até que a pelota resuspended não se desprezou após a adição de DMEM.Após o último giro, remova o máximo possível de supernasceso possível sem perturbar a pelota. Em seguida, adicione um mililitro de 1X PBS e resuspenque a pelota raspando suavemente a parte inferior externa do tubo ao longo de um rack de tubo vazio. Pelotar a suspensão da célula a 200 g por cinco minutos e, em seguida, remover o máximo de supernante possível sem perturbar a pelota.Corte três milímetros do final de uma ponta de pipeta de 200 microliter para ampliar a abertura. Com a ponta de pipeta cortada, resuspenque a pelota em 80 microlitres de solução de sacarose molar 0,1 por pipetação para cima e para baixo. Deixe a suspensão do celular ficar em temperatura ambiente por três minutos.Em seguida, com uma ponta de pipeta, cubra um slide com 100 microliters de 1%formaldeído com 0,15% Triton X-100. Em seguida, adicione 18 microliters da suspensão da célula de sacarose no centro do slide em uma linha reta perpendicular à borda longa. Incline o slide para frente e para trás para facilitar a propagação da suspensão da célula para todos os cantos.Coloque os slides em uma câmara de umidade aberta ligeiramente rachada para evitar que a solução de formaldeído seque. Coloque a câmara de umidade em uma gaveta escura durante a noite. Pela manhã, retire a tampa da câmara de umidade e deixe os slides secarem completamente.Coloque os slides em um frasco de coplin e, em seguida, encha o frasco de coplin com água destilada. Incubar por cinco minutos com agitação suave à temperatura ambiente. Despeje a água e encha o frasco com um a 250 agentes de molhar.Lave duas vezes por cinco minutos cada um com agitação suave à temperatura ambiente. Deixe os slides secarem completamente e armazenem a menos 20 graus Celsius até que estejam manchados. Este protocolo esboçou um método para preparar e visualizar a propagação de espermatotocitos de zebrafish que produz núcleos não sobrepostos bem espalhados.Os painéis à esquerda mostram três estágios de prophase meiotic, leptoteno, zygotene precoce e pachytene. Telômeros foram manchados magenta para cada etapa. Um exemplo de spreads de baixa qualidade devido à insuficiência de tratamentos DNase I são mostrados aqui.Cromossomos meiotics manchados para SYCP3 indicam núcleos sobrepostos devido a uma suspensão viscosa de células de sacarose que impede que as células se espalhem adequadamente na lâmina. É muito importante começar com a quantidade correta de material inicial, tratar testículos de zebrafish pela quantidade adequada de tempo no trypsin, e realizar o número necessário de tratamentos DNase I como falha em fazê-lo pode levar a muito poucos núcleos ou núcleos agrupados. Epi adequado deve ser sempre usado ao trabalhar com formaldeído.Após o procedimento de disseminação, os cromossomos podem ser manchados para visualizar várias estruturas cromossômicas, bem como quebras de dois fios para analisar a dependência de tempo e localização de eventos meioticos. Nossa técnica abriu caminho para mostrar que o zebrafish pode ser um modelo melhor de espermatogênese humana do que o rato baseado nas características do cromossomo e no buquê de telômero.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Genética

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Biodosimetry de radiação acelerada por automatizado identificação Dicentric cromossomo (ADCI) e estimativa de Dose

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Em pool shRNA tela para reativação de MeCP2 no cromossomo X inativo

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow genoma entrada biblioteca preparação de um único espécime Tardigrade de sequenciamento

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Extração de DNA do elevado-throughput e genotipagem de larvas de Zebrafish 3dpf por Fin recorte

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Um modelo de camundongo não aleatório para reativação farmacológica de Mecp2 no cromossomo X inativo

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identificação de contatos intensificadores-promotores em corpos embrionários por captura quantitativa de conformação de cromossomo (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

Triagem Cromossômica de Embriões Humanos Pré-implantacionais Utilizando Meio de Cultura Usado: Coleta de Amostras e Análise de Ploidia Cromossômica

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Capturando a Conformação Cromossômica Através de Escalas de Comprimento

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...