Name: preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Мы благодарим Трента Ньюмана и Масуду Шарифи за комментарии к рукописи и An Nguyen за помощь в оптимизации методов распространения и окрашивания хромосом от зебры миоцитов. Эта работа была поддержана NIH R01 GM079115, присужденной S.M.B.

Все методы, связанные с зебрафиш были выполнены с использованием этических стандартов, утвержденных Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Калифорнийском университете в Дэвисе.
1. Процедура распространения хромосомы
ПРИМЕЧАН...

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li><li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks,+synapsis,+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).</li><li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish.">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li><li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+recombination+in+human+males.">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li><li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+studies+of+human+meiosis:+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at,+or+prior+to,+establishment+of+double-strand+breaks.">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075 (2013).</li><li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes.">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442 (2014).</li><li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male.">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Saito, K., Siegfried, K. R., N&#252;sslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants.">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li><li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+by+breaking+and+repairing:+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination.">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li><li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females.">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li><li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes.">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).</li><li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+chiasmata+and+interference.">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li><li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies.">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li><li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene.">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).</li></ol>

Здесь мы описываем методы зондирования расположения теломер и хромосо-связанных белков в ядерной поверхности распространяется из сперматоцитов, изолированных от яичек зебры. Мы ожидаем, что эти методы будут применимы для анализа сперматоцитов у других видов телеост с корректировкой ...

Сексуальное размножение происходит через сочетание двух гаплоидных гамет, каждый из которых несет половину хромосомного дополнения соматической клетки. Meiosis является специализированным делением клеток, который производит гаплоидные гаметы через один раунд репликации ДНК и два последовательных раунда сегрегации хромосомы. В профазе I гомологичные хромосомы (омологи) должны пройти спаривание, рекомбинацию и синапсис, последний из которых характеризуется образованием синаптонемного комплекса, состоящего из двух омологовых осей, мостовых поперечной нитью, Sycp1(Рисунок 1A, B). Неспособность должным образом выполнить эти процессы может привести к производству анеуплоидных гамет, которые являются основной причиной выкидышей у людей1. Наши знания о координации между сопряжением, рекомбинации и синапсиса было облегчено исследований в широком диапазоне организмов, таких как дрожжи, C. elegans, мышь, и Drosophila, среди других2. В то время как общий процесс гомологичных хромосомных спаривания с последующим сегрегацией хорошо сохраняется, его зависимость от рекомбинации и синапсиса и порядок этих событий варьируется.
Мейотическое двухструное разрыв (DSB) образование, которое инициирует гомологичную рекомбинацию, происходит вблизи теломер, сгруппированных в букете во время лептотена и синапсиса вытекает вскоре после3,4. Эта конфигурация формирования DSB и синапсис инициации также является характеристикой мужского мейоза у людей, но не в мыши5,6,7,8, предполагая, что зебрафиш может служить моделью для человеческого сперматогенеза. Есть также несколько практических преимуществ изучения зебрафиш мейоз. Как мужчины, так и самки проходят гейттогенез на протяжении всей взрослой жизни, их гонады легко доступны, и сотни потомства генерируются из одного креста. Кроме того, эмбрионы прозрачны и развиваются внешне, что облегчает раннее выявление аберраций в эмбриональном развитии из-за анеуплоидных гамет3,9. Недостатки использования зебры в том, что они медленно достигают половой зрелости (60 дней), а количество материала, необходимого для ядерных поверхностных спредов, должно быть собрано у взрослых животных в зависимости от их размера.
Препараты мейотической хромосомы являются жизненно важным инструментом для изучения динамики хромосом во всех модельных организмах, так как ключевые признаки динамики мейотической хромосомы могут быть исследованы. В зебрафиш, ключевые аспекты прогрессирования мейотической программы и ядерной организации были расчленены путем зондирования ядерных поверхностных спредов, упомянутых здесь как хромосомные спреды, с антителами для иммунофлюоресценции обнаружения белков и / или нуклеиновых кислот FISH3,4,9,10,11,12. Действительно, поляризованная локализация кластерных теломер в букете может быть сохранена в спред-препарате(рисунок 1С). В последнее время мы использовали зебра фишка сперматозоидов хромосомы распространяется вместе с методами обнаружения флуоресценции и супер-разрешение микроскопии, чтобы выяснить детальное прогрессирование динамики теломер зебры, гомологические хромосомы сопряжения, двойной нитны перерыв локализации, и синапс и синапсис на ключевых мейотических переходов3. Здесь мы представляем методы подготовки хромосомных спредов из сперматозитов яичек зебры, а затем окрашиваем их флуоресцентными пептидными нуклеиновыми кислотами (ПНА) зондами для повторных последовательностей теломер и иммунофуфрезесценции, связанных с белками.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde, methanol-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 mm glasscoverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>363696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bag</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Used to make plastic coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>203775-500uL</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-zfSycp1</td>
			<td>Generated by Burgess lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10014CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Two are required for dissecting the testes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89429-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11042</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-hDMC1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8973</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-3683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>230401V (Model 5420)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Model Classic C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimerbly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Used for the humidity chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hamsterSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hMLH1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550838</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hRPA</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>MABE285</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Alexa647</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1013</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Cy3</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRPA</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-244A</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150292</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRad51</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX100469</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercut Scissors, 30&#176; angle, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-822-353</td>
			<td>Can also use any pair of small scissors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9897184</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9253-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes

Meiosis является ключевым клеточным процессом, необходимым для создания гаплоидных гамет для полового размножения. Модельорганизмов сыграли важную роль в понимании хромосомных событий, которые происходят во время мейотической профазы, включая спаривание, синапсис и рекомбинации событий, которые обеспечивают надлежащую сегрегацию хромосомы. Хотя мышь была важной моделью для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе этих процессов, не все мейотические события в этой системе аналогичны человеческому мейозу. Недавно мы продемонстрировали захватывающий потенциал зебры в качестве модели человеческого сперматогенеза. Здесь мы подробно описываем наши методы визуализации мейотических хромосом и связанных с ними белков в хромосомных препаратах. Преимущество этих препаратов позволяет проводить анализ хромосомных хромосомных структур с высоким разрешением. Во-первых, мы описываем процедуру вскрытия яичек от взрослых зебр, а затем диссоциации клеток, лиза и распространения хромосом. Далее мы описываем процедуру обнаружения локализации мейотических хромосомных белков путем обнаружения иммунофлуоресценции и последовательностей нуклеиновых кислот путем флуоресценции на месте гибридизации (FISH). Эти методы представляют собой полезный набор инструментов для цитологического анализа мейотического хроматина архитектуры в системе зебрафиш. Исследователи в сообществе зебры должны быть в состоянии быстро освоить эти методы и включить их в свой стандартный анализ репродуктивной функции.

Мы наметили метод для подготовки и визуализации зебрафиш сперматоцитов распространения препаратов. При правильном выполнении наша процедура дает хорошо спред, не перекрывающиеся ядра. Чтобы восстановить такие ядра, важно иметь соответствующее количество исходного ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Ядерные поверхностные спреды являются незаменимым инструментом для изучения хромосомных событий во время мейоза. Здесь мы демонстрируем метод подготовки и визуализации мейотических хромосом во время профазы I из сперматозитов зебры.

Приготовление Мейотических хромосомных спредов из сперматозоидов зебрафиш

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Зебрафиш становится отличной позвоночной моделью для изучения хромосомных событий мейоза, включая гомологичные хромосомные спаривания, синапсис и рекомбинацию. Этот протокол распространения ядерной поверхности позволил нам визуализировать ключевые особенности архитектуры мейотической хромосомы с помощью микроскопии супер разрешения. Исследователи могут ожидать сотни хорошо распространяемых ядер на слайд с меньшим количеством мусора, чем другие протоколы распространения зебры.Наиболее технически сложной частью этой процедуры является вскрытие яиц зебры, так как она находится в непосредственной близости от кожи, а также прилагается к другим органам. Визуализация процедуры вскрытия позволит исследователям знать, чего ожидать, когда они видят гонад, встроенный в ткани животного. После усыпляния самца зебры, обезглавить одну рыбу в то время, с маленькими ножницами, а затем использовать микро ножницы, чтобы сократить вдоль брюшной средней линии подвергать полости тела.Поместите рыбу в силиконовую чашку Петри и накройте мелководным бассейном 1X PBS. Под микроскопом при увеличении 1.65X, рассекают яички с помощью типсов. Удалите как можно больше жира и окружающих тканей из яитесов, как это возможно.Гонад будет казаться полупрозрачным под светом области вскрытия, в то время как окружающий жир может иметь немного более темный вид. Некоторое количество жира может быть оставлено на гонаде, не посягов процедуре. Добавляйте каждый вскрытый яички прямо в пятими миллилитровую трубку с двумя миллилитров DMEM и держите на льду.Чтобы разобщить клетки яиц, добавьте 200 микролитров раствора коллагеназы в пятими миллилитровую трубку с яичками. Смешайте раствор, инвертировать его несколько раз. Аккуратно встряхните яички в инкубаторе шейкер горизонтально при 100 об/мин при 32 градусах по Цельсию.Быстро инвертировать трубку каждые 10 минут, чтобы облегчить диссоциацию. Через час, DMEM облачно и яички в небольших кусках. В то время как яички инкубируется в коллагеназе, довоенные 100 микролитров раствора молярной сахарозы до 37 градусов по Цельсию.Чтобы вымыть коллагеназу, добавьте DMEM в окончательный объем в пять миллилитров и инвертировать трубку несколько раз. Пеллет яички на 200 г в течение трех минут при комнатной температуре. Удалите три миллилитров супернатанта, чтобы остались только два миллилитров.Повторите DMEM мыть два дополнительных раза. После последней стирки DMEM удалите четыре миллилитров супернатанта и добавьте один миллилитр DMEM, 200 микролитров трипсиного раствора и 20 микролитров раствора DNase I. Переверните трубку несколько раз, чтобы смешать раствор.Горизонтально встряхните трубку при 32 градусах цельсия при 100 об/мин. Быстро инвертировать трубку каждые пять минут, чтобы облегчить диссоциацию. Через 5-15 минут решение DMEM содержит лишь несколько комков.Добавьте 500 микролитров раствора ингибитора трипсина и 50 микролитров раствора DNase I. Инвертировать трубку несколько раз, чтобы смешать затем кратко спина вниз на 200 г в течение трех минут при комнатной температуре, чтобы удалить жидкость или сгустки, которые могут придерживаться трубки крышки или стороны трубки. Поместите трубку на лед и resuspend клеточной подвески, неоднократно трубопроводов вверх и вниз с пластиковой пипетки передачи в течение двух минут, чтобы облегчить диссоциацию любых оставшихся сгустков.Убедитесь, что подвеска ячейки не попадает в лампу переаттоки. Затем предварительно влажный 100 микрон-клеточный ситечко с DMEM и поместите его на вершине 50 миллилитров трубки на льду. Передача подвески клетки через ситечко по одной капле за один раз с помощью пластиковой трубы передачи.Перенесите фильтрат с помощью пластиковой трубы передачи в новую пятими миллилитровую трубку. Обязательно соберите соединенные ячейки, прикрепленные к нижней стороне фильтра. Добавьте DMEM в трубку до конечного объема в пять миллилитров.Пеллет клетки при 200 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулы и добавить пять микролитров раствора DNase I непосредственно в гранулы. Затем смешайте гранулы с раствором DNase I, аккуратно соскоб внешней нижней части трубки четыре-пять раз вдоль пустой стойки трубки микроцентрифуг.Добавьте DMEM к окончательному объему в пять миллилитров и смешайте раствор, инвертировать трубку несколько раз. Пеллет клеточной подвески при температуре 200 г в течение двух минут при комнатной температуре. Повторите лечение DNase дополнительно один-три раза, пока перерасход гранулы не слипаются при добавлении DMEM.После последнего спина, удалить столько, сколько супернатант, как это возможно, не нарушая гранулы. Затем добавьте один миллилитр 1X PBS и повторно посовещайте гранулы, аккуратно соскаблив внешнюю нижнюю часть трубки вдоль пустой трубчатой стойки. Пеллет клеточной подвески на 200 г в течение пяти минут, а затем удалить как можно больше супернатантов, как это возможно, не нарушая гранулы.Вырезать три миллиметра от конца 200 микролитров пипетки кончик расширить диафрагму. С разрезом наконечник пипетки, повторно гранулы в 80 микролитров 0,1 молярной сахарозы раствора путем трубопроводов вверх и вниз. Пусть подвеска клетки сидеть при комнатной температуре в течение трех минут.Далее, с наконечником пипетки, пальто один слайд со 100 микролитров 1%формальдегида с 0,15%Triton X-100. Затем добавьте 18 микролитров подвески клетки сахарозы на центр слайда по прямой линии перпендикулярно длинной кромке. Наклоните слайд вперед и назад, чтобы облегчить распространение подвески ячейки на все углы.Поместите горки плоскими вниз в слегка трещины открытой камеры влажности, чтобы предотвратить формальдегид раствор от высыхания. Поместите камеру влажности в темный ящик на ночь. Утром снимите крышку с камеры влажности и дайте слайдам полностью высохнуть.Поместите слайды в банку coplin, а затем заполнить копин банку с дистиллированной водой. Инкубировать в течение пяти минут с нежной тряской при комнатной температуре. Вылейте воду и заполнить банку с 1 до 250 смачивания агента.Вымойте два раза в течение пяти минут каждый с нежной тряски при комнатной температуре. Разрешить слайды полностью высохнуть и хранить при температуре минус 20 градусов по Цельсию, пока они не окрашены. В этом протоколе изложен метод подготовки и визуализации распространения сперматозоидов-зебрафиш, который дает хорошо распространяющиеся некрывающиеся ядра.Панели слева показывают три стадии мейотической профазы, лептотена, раннего зиготена и пахитена. Теломеры были окрашены пурпурный для каждого этапа. Пример низкого качества распространяется из-за недостаточного лечения DNase I показаны здесь.Мейотические хромосомы, окрашенные для SYCP3, указывают на перекрывающиеся ядра из-за вязкой подвески клеток сахарозы, которая предотвращает правильное распространение клеток на слайде. Очень важно начать с правильного количества исходного материала, лечить тесты зебры в течение соответствующего количества времени в трипсине, и выполнять необходимое количество DNase I лечения, как неспособность сделать это может привести к очень мало ядер или слипшиеся ядра. Правильный СИЗ всегда следует носить при работе с формальдегидом.После процедуры распространения хромосомы могут быть окрашены для визуализации различных хромосомных структур, а также двухтяговые разрывы для анализа зависимости от времени и локализации мейотических событий. Наша техника проложила путь для того, чтобы показать, что зебрафиш может быть лучшей моделью человеческого сперматогенеза, чем мышь на основе особенностей хромосомы и букета теломер.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Пробоподготовки и анализа данных на основе RNASeq ген выражение данио рерио

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Ускоренной излучения Биодозиметрические, автоматизированной идентификации Dicentric хромосомы (ADCI) и оценки дозы

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Обобщённые индуцируемый экран для повторной активации MeCP2 на неактивных Х-хромосома

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Сверхнизкое ввода геном последовательность подготовки библиотеки от Tardigrade единичная

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Экстракции ДНК высокой пропускной способностью и генотипирования 3dpf личинки у рыбок данио путем отсечения Fin

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Модель неслучайной мыши для фармакологической активации Mecp2 на неактивной х-хромосоме

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Идентификация контактов Enhancer-Promoter в эмбриоидных телах по количественному захвату конформации хромосомы (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

Хромосомный скрининг преимплантационных эмбрионов человека с использованием отработанной питательной среды: забор образцов и анализ хромосомной плоидности

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Захват конформации хромосом по длинным шкалам

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...