Name: preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Agradecemos a Trent Newman y Masuda Sharifi por sus comentarios sobre el manuscrito y An Nguyen por ayudar a optimizar los métodos para difundir y manchar cromosomas de meiocitos de peces cebra. Este trabajo fue apoyado por NIH R01 GM079115 otorgado a S.M.B.

Todos los métodos relacionados con el pez cebra se llevaron a cabo utilizando normas éticas aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UC Davis.
1. Procedimiento de propagación del cromosoma
NOTA: El siguiente protocolo está diseñado para crear 4-6 diapositivas, con cientos de núcleos meióticos extendidos por diapositiva. El número de testículos utilizados dependerá del tamaño del pez. Prepárese para utilizar 20 animales a los 6...

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li><li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks,+synapsis,+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).</li><li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish.">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li><li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+recombination+in+human+males.">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li><li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+studies+of+human+meiosis:+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at,+or+prior+to,+establishment+of+double-strand+breaks.">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075 (2013).</li><li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes.">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442 (2014).</li><li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male.">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Saito, K., Siegfried, K. R., N&#252;sslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants.">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li><li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+by+breaking+and+repairing:+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination.">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li><li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females.">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li><li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes.">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).</li><li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+chiasmata+and+interference.">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li><li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies.">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li><li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene.">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).</li></ol>

Aquí describimos métodos para sondear la ubicación de los telómeros y las proteínas asociadas al cromosoma en las propagaciones de superficies nucleares de espermatocitos aislados de los testículos de peces cebra. Esperamos que estos métodos sean aplicables para el análisis de espermacitos en otras especies de teleost con ajuste al tamaño de los testículos.
Mientras que sólo unos pocos anticuerpos han sido elevados a las proteínas meióticas de pez cebra, hemos tenido éxito utiliz...

La reproducción sexual procede a través de la combinación de dos gametos haploides, cada uno llevando la mitad del complemento cromosómico de una célula somática. La meiosis es una división celular especializada que produce gametos haploides a través de una ronda de replicación del ADN y dos rondas sucesivas de segregación cromosómica. En la profase I, los cromosomas homólogos (homólogos) deben someterse a emparejamiento, recombinación y sinapsis, el último de los cuales se caracteriza por la formación del complejo sinntántmal que comprende dos ejes homólogos puenteados por el filamento transversal, Sycp1(Figura 1A,B). La falta de ejecución adecuada de estos procesos puede conducir a la producción de gametos aneuploides, que son una causa principal de abortos espontáneos en los seres humanos1. Nuestro conocimiento de la coordinación entre emparejamiento, recombinación y sinapsis ha sido facilitado por estudios en una amplia gama de organismos, como levadura, C. elegans,ratón, y Drosophila,entre otros2. Si bien el proceso general de emparejamiento cromosómico homólogo seguido de segregación está bien conservado, su dependencia de la recombinación y la sinapsis y el orden de estos eventos varía.
La formación meiotica de rotura de doble cadena (DSB), que inicia una recombinación homóloga, se produce cerca de telómeros agrupados en el ramo durante el leptoteno y la sinapsis se produce poco después de3,4. Esta configuración de la formación DSB y la iniciación de la sinapsis es también una característica de la meiosis masculina en los seres humanos pero no en el ratón5,6,7,8, lo que sugiere que el pez cebra puede servir como modelo para la espermatogénesis humana. También hay varias ventajas prácticas de estudiar la meiosis de pez cebra. Tanto los machos como las hembras se someten a gametogénesis a lo largo de la edad adulta, sus gónadas son fácilmente accesibles, y cientos de crías se generan a partir de una sola cruz. Además, los embriones son transparentes y se desarrollan externamente, lo que facilita la detección precoz de aberraciones en el desarrollo embrionario debido a los gametos aneuploides3,9. Las desventajas de utilizar peces cebra son que son lentos para alcanzar la madurez sexual (60 días) y la cantidad de material necesario para las propagaciones de superficie nuclear debe recogerse de 10-20 animales adultos, dependiendo de su tamaño.
Las preparaciones de propagación cromosómica meiótica son una herramienta vital para estudiar la dinámica cromosómica en todos los organismos modelo, ya que se pueden sondear las firmas clave de la dinámica cromosómica meiótica. En el pez cebra, se han diseccionado aspectos clave de la progresión del programa meiótico y de la organización nuclear mediante sondeos de propagaciones superficiales nucleares, denominadas aquí diseminas cromosómicas, con anticuerpos para la detección de inmunofluorescencia de proteínas y/o ácidos nucleicos por FISH3,4,9,10,11,12. De hecho, la localización polarizada de telómeros agrupados en el ramo se puede conservar en la preparación de propagación(Figura 1C). Recientemente, hemos utilizado propagaciones cromosómicas de espermacitos de peces cebra junto con métodos de detección de fluorescencia y microscopía de superresolución para dilucidar la progresión detallada de la dinámica de los telómeros de pez cebra, el emparejamiento de cromosomas homólogos, la localización de roturas de doble cadena y la sinapsis en transiciones meióticas clave3. Aquí presentamos métodos para preparar las propagaciones cromosómicas de los espermismocitos de los testículos de peces cebra y posteriormente mancharlos con sondas de ácido nucleico péptido fluorescente (AnP) a secuencias repetidas de telómeros y detección de inmunofluorescencia de proteínas asociadas al cromosoma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde, methanol-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 mm glasscoverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>363696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bag</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Used to make plastic coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>203775-500uL</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-zfSycp1</td>
			<td>Generated by Burgess lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10014CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Two are required for dissecting the testes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89429-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11042</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-hDMC1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8973</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-3683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>230401V (Model 5420)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Model Classic C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimerbly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Used for the humidity chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hamsterSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hMLH1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550838</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hRPA</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>MABE285</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Alexa647</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1013</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Cy3</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRPA</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-244A</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150292</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRad51</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX100469</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercut Scissors, 30&#176; angle, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-822-353</td>
			<td>Can also use any pair of small scissors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9897184</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9253-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes

La meiosis es el proceso celular clave necesario para crear gametos haploides para la reproducción sexual. Los organismos modelo han sido fundamentales para comprender los eventos cromosómicos que tienen lugar durante la profase meiótica, incluidos los eventos de emparejamiento, sinapsis y recombinación que aseguran la segregación cromosómica adecuada. Mientras que el ratón ha sido un modelo importante para entender los mecanismos moleculares subyacentes a estos procesos, no todos los eventos meióticos en este sistema son análogos a la meiosis humana. Recientemente demostramos el emocionante potencial del pez cebra como modelo de espermatogénesis humana. Aquí describimos, en detalle, nuestros métodos para visualizar cromosomas meióticos y proteínas asociadas en preparaciones de propagación cromosómica. Estas preparaciones tienen la ventaja de permitir el análisis de alta resolución de las estructuras cromosómicas. En primer lugar, describimos el procedimiento para disección de testículos de peces cebra adultos, seguido de disociación celular, lisis y propagación de los cromosomas. A continuación, describimos el procedimiento para detectar la localización de proteínas cromosómicas meióticas, mediante la detección de inmunofluorescencia, y secuencias de ácido nucleico, mediante hibridación in situ por fluorescencia (FISH). Estas técnicas comprenden un conjunto útil de herramientas para el análisis citológico de la arquitectura de la cromatina meiótica en el sistema de peces cebra. Los investigadores de la comunidad de peces cebra deben ser capaces de dominar rápidamente estas técnicas e incorporarlas a sus análisis estándar de la función reproductiva.

Hemos descrito un método para preparar y visualizar las preparaciones de propagación de espermatocitos de peces cebra. Cuando se realiza correctamente, nuestro procedimiento produce núcleos bien diseminados y no superpuestos. Para recuperar estos núcleos, es importante tener la cantidad adecuada de material de partida (es decir, testículos), tratar los testículos durante un período de tiempo suficiente en trippsina y un número adecuado de tratamientos DNase I. Estos diseminados se...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Las propagaciones de superficies nucleares son una herramienta indispensable para estudiar los eventos cromosómicos durante la meiosis. Aquí demostramos un método para preparar y visualizar cromosomas meióticos durante la profase I a partir de espermacitos de peces brabra.

Preparación de las propagaciones del cromosoma meiótico a partir de espermacitos de peces cebra

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

El pez cebra está emergiendo como un excelente modelo de vertebrados para estudiar los eventos cromosómicas de la meiosis, incluyendo el emparejamiento cromosómica homóloga, la sinapsis y la recombinación. Este protocolo de propagación de la superficie nuclear nos ha permitido visualizar las características clave de la arquitectura cromosómica meyótica utilizando una microscopía de super resolución. Los investigadores pueden esperar cientos de núcleos bien extendidos por diapositiva con menos escombros que otros protocolos de propagación de peces cebra.La parte técnicamente más difícil de este procedimiento es la disección de los testículos de pez cebra ya que está cerca de la piel y también se une a otros órganos. Visualizar el procedimiento de disección permitirá a los investigadores saber qué esperar cuando vean la gónada incrustada en el tejido del animal. Después de eutanasiar el pez cebra macho, decapitar un pez a la vez con tijeras pequeñas y luego utilizar micro tijeras para cortar a lo largo de la línea media ventral para exponer la cavidad del cuerpo.Coloque el pescado en un plato de Petri recubierto de silicona y cúbralo junto a una piscina poco profunda de 1X PBS. Bajo un microscopio con un aumento de 1,65X, diseccionar los testículos utilizando fórceps. Retire la mayor cantidad de grasa y tejido circundante de los testículos como sea posible.La gónada aparecerá translúcida bajo la luz del alcance de la disección, mientras que la grasa circundante puede tener un aspecto ligeramente más oscuro. Se puede dejar cierta cantidad de grasa en la gónada sin impedir el procedimiento. Agregue cada testículo diseccionado directamente en un tubo de cinco mililitros con dos mililitros de DMEM y manténgalos en hielo.Para disociar las células de los testículos, añadir 200 microlitros de solución de colagenasa al tubo de cinco mililitros con los testículos. Mezclar la solución inviriéndola varias veces. Agitar suavemente los testículos en una coctelera de incubadora horizontalmente a 100 RPM a 32 grados centígrados.Invierta rápidamente el tubo cada 10 minutos para facilitar la disociación. Después de una hora, el DMEM está nublado y los testículos están en pequeños trozos. Mientras que los testículos se incuban en colagenasa, precalienta 100 microlitros de 0.1 solución de sacarosa molar a 37 grados Celsius.Para lavar la colagenasa, añadir DMEM a un volumen final de cinco mililitros e invertir el tubo un par de veces. Pele el testículo a 200 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Retire tres mililitros del sobrenadante para que sólo queden dos mililitros.Repita el lavado DMEM dos veces adicionales. Después del último lavado DMEM, retire cuatro mililitros del sobrenadante y agregue un mililitro de DMEM, 200 microlitros de solución de trippsina y 20 microlitros de solución DNase I. Invierta el tubo unas cuantas veces para mezclar la solución.Agite el tubo horizontalmente a 32 grados centígrados a 100 RPM. Invierta rápidamente el tubo cada cinco minutos para facilitar la disociación. Después de cinco a 15 minutos, la solución DMEM contiene solo unos pocos grupos.Añadir 500 microlitros de la solución inhibidora de la trippsina y 50 microlitros de la solución DNase I. Invierta el tubo unas cuantas veces para mezclar y luego gire brevemente a 200 g durante tres minutos a temperatura ambiente para eliminar el líquido o los grumos que pueden adherirse a la tapa del tubo o al lado del tubo. Coloque el tubo sobre hielo y resusppend la suspensión celular pipeteando repetidamente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de transferencia de plástico durante dos minutos para facilitar la disociación de los grumos restantes.Asegúrese de que la suspensión celular no entre en la bombilla de la pipeta de transferencia. A continuación, pre-mojar un colador celular de 100 micras con DMEM y colóquelo encima de un tubo de 50 mililitros sobre hielo. Transfiera la suspensión celular a través del colador una gota a la vez utilizando una pipeta de transferencia de plástico.Transfiera el filtrado utilizando una pipeta de transferencia de plástico a un nuevo tubo de cinco mililitros. Asegúrese de recoger las celdas agrupadas conectadas a la parte inferior del filtro. Agregue DMEM en el tubo a un volumen final de cinco mililitros.Pele las células a 200 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire tanto sobrenadante como sea posible sin alterar el pellet y agregue cinco microlitros de la solución DNase I directamente en el pellet. A continuación, mezcle el pellet con la solución DNase I raspando suavemente el fondo exterior del tubo de cuatro a cinco veces a lo largo de un bastidor de tubo de microcentrífuga vacío.Añadir DMEM a un volumen final de cinco mililitros y mezclar la solución invirtiendo el tubo varias veces. Pele la suspensión celular a 200 g durante dos minutos a temperatura ambiente. Repita el tratamiento con DNase una a tres veces adicional hasta que el pellet resuspendido no se agrupe al adición de DMEM.Después del último giro, retire tanto como sobrenadante como sea posible sin alterar el pellet. A continuación, agregue un mililitro de 1X PBS y resuspender el pellet raspando suavemente la parte inferior exterior del tubo a lo largo de un bastidor de tubo vacío. Pele la suspensión celular a 200 g durante cinco minutos y luego retire tanto sobrenadante como sea posible sin alterar el pellet.Corte tres milímetros desde el final de una punta de pipeta de 200 microlitros para ampliar la abertura. Con la punta de la pipeta cortada, resuspender el pellet en 80 microlitros de solución de sacarosa molar 0.1 pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Deje reposar la suspensión celular a temperatura ambiente durante tres minutos.A continuación, con una punta de pipeta, cubra una diapositiva con 100 microlitros de 1% de formaldehído con 0,15%Tritón X-100. A continuación, agregue 18 microlitros de la suspensión de la celda de sacarosa en el centro de la diapositiva en una línea recta perpendicular al borde largo. Incline la corredera hacia adelante y hacia atrás para facilitar la propagación de la suspensión de la celda a todas las esquinas.Coloque los portaobjetos planos en una cámara de humedad abierta ligeramente agrietada para evitar que la solución de formaldehído se seque. Coloque la cámara de humedad en un cajón oscuro durante la noche. Por la mañana, retire la tapa de la cámara de humedad y deje que los portaobjetos se sequen por completo.Coloque los portaobjetos en un frasco de coplina y luego llene el frasco de coplina con agua destilada. Incubar durante cinco minutos con un suave temblor a temperatura ambiente. Vierta el agua y llene el frasco con uno a 250 agente humectante.Lavar dos veces durante cinco minutos cada uno con un suave temblor a temperatura ambiente. Deje que los portaobjetos se sequen completamente y guárdelos a menos 20 grados Centígrados hasta que estén manchados. Este protocolo delineó un método para preparar y visualizar la propagación de espermatozoides de peces cebras que produce núcleos no superpuestos bien extendidos.Los paneles de la izquierda muestran tres etapas de profase meótica, leptoteno, cigeno temprano y paquiteno. Los telómeros se tiñeron de magenta para cada etapa. Un ejemplo de spreads de mala calidad debido a tratamientos DNase I insuficientes se muestran aquí.Los cromosomas meyóticos manchados para SYCP3 indican núcleos superpuestos debido a una suspensión de células de sacarosa viscosa que impide que las células se propaguen correctamente en la diapositiva. Es muy importante comenzar con la cantidad correcta de material de partida, tratar los testículos de pez cebra durante el tiempo adecuado en tripina, y llevar a cabo el número necesario de tratamientos DNase I, ya que no hacerlo puede conducir a muy pocos núcleos o núcleos aglucuados. Siempre se debe usar un EPP adecuado cuando se trabaja con formaldehído.Después del procedimiento de propagación, los cromosomas se pueden teñir para visualizar varias estructuras cromosómicas, así como roturas de doble hebra para analizar la dependencia de tiempo y la localización de eventos meóticos. Nuestra técnica ha allanado el camino para mostrar que el pez cebra puede ser un mejor modelo de espermatozoides humanos que el ratón basado en las características cromosómicas y el ramo de telómeros.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Preparación de muestras y análisis de datos de expresión basada en RNASeq gen de pez cebra

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Investigación

Genética

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Radiación acelerada Biodosimetry automática por identificación del cromosoma dicéntrico (ADCI) y estimación de dosis

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

ShRNAs combinados pantalla para reactivación de MeCP2 en el cromosoma de X inactivo

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultra bajo entrada genoma secuencia biblioteca elaboración de un solo espécimen Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Extracción de ADN de alto rendimiento y genotipificación de 3dpf larvas de pez cebra por recorte de aleta

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Un modelo de ratón no aleatorio para la reactivación farmacológica de Mecp2 en el cromosoma X inactivo

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identificación de contactos potenciadores-promotores en cuerpos embrionarios por captura cuantitativa de conformación cromosómica (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

Cribado cromosómico de embriones humanos preimplantacionales mediante el uso de medios de cultivo gastados: recogida de muestras y análisis de ploidía cromosómica

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Captura de la conformación cromosómica a través de escalas de longitud

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...