Name: preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Vi tackar Trent Newman och Masuda Sharifi för kommentarer om manuskriptet och An Nguyen för att hjälpa till att optimera metoder för spridning och färgning kromosomer från zebrafisk meiocyter. Detta arbete stöddes av NIH R01 GM079115 som tilldelats S.M.B.

Alla metoder som omfattade zebrafiskar utfördes med hjälp av etiska standarder som godkänts av institutionalanimal care and use committee vid UC Davis.
1. Kromosom spridningsförfarande
OBS: Följande protokoll är utformat för att skapa 4-6 bilder, med hundratals spridda meiotic kärnor per bild. Antalet testiklar som används beror på fiskens storlek. Räkna med att använda 20 djur på ~ 60 dagar efter befruktning (dpf) och 15 djur på ~ 6 månader efter befru...

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li><li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks,+synapsis,+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).</li><li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish.">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li><li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+recombination+in+human+males.">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li><li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+studies+of+human+meiosis:+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at,+or+prior+to,+establishment+of+double-strand+breaks.">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075 (2013).</li><li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes.">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442 (2014).</li><li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male.">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Saito, K., Siegfried, K. R., N&#252;sslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants.">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li><li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+by+breaking+and+repairing:+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination.">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li><li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females.">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li><li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes.">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).</li><li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+chiasmata+and+interference.">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li><li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies.">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li><li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene.">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).</li></ol>

Här beskriver vi metoder för att undersöka platsen för telomerer och kromosom-associerade proteiner i nukleära ytbehandlar sprider från spermatocyter isolerade från zebrafisk testiklar. Vi förväntar oss att dessa metoder kommer att tillämpas för analys av spermatocyter i andra teleostarter med justering till testisens storlek.
Medan endast ett fåtal antikroppar har höjts till zebrafisk meiotiska proteiner, har vi haft framgång med hjälp av följande antikroppar upp till mänskli...

Sexuell reproduktion fortsätter genom kombinationen av två haploid gametes, var och en bär hälften av kromosom komplement av en somatisk cell. Meios is a specialized cell division that producerar haploid gametes through one round of DNA replication and two successive rounds of kromosome segregation. I profas I måste homologa kromosomer (homologs) genomgå parning, rekombination och synaps, varav den senare kännetecknas av bildandet av synaptonemal-komplexet som består av två homologa axlar som överbryggas av tvärgående glödtråd, Sycp1(figur 1A,B). Underlåtenhet att korrekt utföra dessa processer kan leda till produktion av aneuploid gametes, som är en ledande orsak till missfall hos människor1. Vår kunskap om samordningen mellan parning, rekombination och synaps har underlättats av studier i ett brett spektrum av organismer, såsom jäst, C. elegans,mus och Drosophila, bland annat2. Medan den allmänna processen för homologk kromosompar följt av segregation är väl bevarad, dess beroende av rekombination och synaps och ordningen på dessa händelser varierar.
Meiotic dubbel-strand break (DSB) formation, som initierar homolog rekombination, sker nära telomerer klustrade i buketten under leptoten och synaps is följer strax efter3,4. Denna konfiguration av DSB bildning och synapsis inledande är också ett kännetecken för manlig meiosis hos människor men inte i mus5,6,7,8, vilket tyder på att zebrafisk kan fungera som en modell för mänskliga spermatogenes. Det finns också flera praktiska fördelar med att studera zebrafisk meiosis. Både män och kvinnor genomgår gametogenesis under hela vuxenålder, deras gonads är lättillgängliga, och hundratals avkommor genereras från ett enda kors. Dessutom är embryona transparenta och utvecklas externt, vilket underlättar tidig upptäckt av avvikelser i embryonal utveckling på grund av aneuploid gametes3,9. Nackdelar med att använda zebrafisk är att de är långsamma med att nå sexuell mognad (~ 60 dagar) och mängden material som behövs för nukleära ytspridningar måste samlas in från ~ 10-20 vuxna djur, beroende på deras storlek.
Meiotic kromosom spridning preparat är ett viktigt verktyg för att studera kromosom dynamik över alla modell organismer, eftersom viktiga signaturer av meiotic kromosom dynamik kan undersökas. I zebrafisk, viktiga aspekter av utvecklingen av meiotic programmet och nukleära organisationen har dissekerats genom sondering nukleära ytspridningar, som här kallas kromosom sprider sig, med antikroppar för immunfluorescens detektion av proteiner och / eller nukleinsyror av FISH3,4,9,10,11,12. I själva verket kan den polariserade lokaliseringen av klustrade telomerer i buketten bevaras i spridningsberedningen (figur 1C). Nyligen har vi använt zebrafisk spermatocyte kromosom sprider sig tillsammans med fluorescens detekteringsmetoder och super-upplösning mikroskopi för att belysa den detaljerade utvecklingen av zebrafisk telomerdynamik, homolog kromosom ihopkoppling, dubbel-strand break lokalisering, och synaps vid viktiga meiotic övergångar3. Här presenterar vi metoder för att förbereda kromosom sprider sig från spermatocyter av zebrafisk testiklar och därefter fläcka dem med fluorescerande peptid nukleinsyra (PNA) sonder till upprepade telomersekvenser och immunfluorescens detektering av kromosom associerade proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde, methanol-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 mm glasscoverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>363696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bag</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Used to make plastic coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>203775-500uL</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-zfSycp1</td>
			<td>Generated by Burgess lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10014CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Two are required for dissecting the testes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89429-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11042</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-hDMC1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8973</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-3683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>230401V (Model 5420)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Model Classic C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimerbly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Used for the humidity chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hamsterSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hMLH1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550838</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hRPA</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>MABE285</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Alexa647</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1013</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Cy3</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRPA</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-244A</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150292</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRad51</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX100469</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercut Scissors, 30&#176; angle, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-822-353</td>
			<td>Can also use any pair of small scissors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9897184</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9253-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes

Meios is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Modell organismer har varit avgörande för att förstå kromosom händelser som äger rum under meiotiska prophase, inklusive parning, synaps och rekombination händelser som säkerställer korrekt kromosom segregation. Medan musen har varit en viktig modell för att förstå de molekylära mekanismer som ligger till grund för dessa processer, är inte alla meiotiska händelser i detta system analoga med mänsklig meios. Vi visade nyligen zebrafiskens spännande potential som en modell av mänskliga spermatogenes. Här beskriver vi, i detalj, våra metoder för att visualisera meiotiska kromosomer och tillhörande proteiner i kromosom spridning preparat. Dessa preparat har fördelen av att tillåta högupplöst analys av kromosomstrukturer. Först beskriver vi förfarandet för dissekera testiklar från vuxna zebrafiskar, följt av celldissociation, lys och spridning av kromosomerna. Därefter beskriver vi förfarandet för att upptäcka lokalisering av meiotiska kromosomproteiner, genom immunfluorescensdetektion, och nukleinsyra sekvenser, genom fluorescens in situ hybridisering (FISH). Dessa tekniker utgör en användbar uppsättning verktyg för cytologisk analys av meiotisk kromatin arkitektur i zebrafisk systemet. Forskare i zebrafisk samhället bör kunna snabbt behärska dessa tekniker och införliva dem i sina standardanalyser av reproduktiv funktion.

Vi har skisserat en metod för att förbereda och visualisera zebrafiskar spermatocyte sprida preparat. När det utförs korrekt, ger vårt förfarande väl spridning, icke-överlappande kärnor. För att återvinna en sådan kärnor är det viktigt att ha lämplig mängd utgångsmaterial (dvs. testiklar), behandla testiklar na under en tillräckligt lång tid i trypsin och ett tillräckligt antal DNase I-behandlingar. Dessa sprider kan sedan färgas för telomerer och meiotiska proteiner...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Kärnytan sprider sig är ett oumbärligt verktyg för att studera kromosom händelser under meios. Här demonstrerar vi en metod för att förbereda och visualisera meiotiska kromosomer under profas I från zebrafiskar spermatocyter.

Beredning av meiotiska kromosom sprider sig från Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Zebrafish växer fram som en utmärkt ryggradsdjur modell för att studera kromosom händelser av meios inklusive homolog kromosom ihopkoppling, synapsis och rekombination. Denna nukleära yta spridning protokoll har gjort det möjligt för oss att visualisera viktiga funktioner i meiotisk kromosom arkitektur med hjälp av super upplösning mikroskopi. Forskare kan förvänta sig hundratals välspillliga kärnor per bild med mindre skräp än andra zebrafiskar sprida protokoll.Den mest tekniskt utmanande delen av detta förfarande är dissekering av zebrafisktestes som det är i nära anslutning till huden och är också fäst vid andra organ. Visualisera dissekeringsförfarandet gör det möjligt för forskare att veta vad som väntar när de ser gonad inbäddade i vävnaden av djuret. Efter att avliva manliga zebrafiskar, halshugg en fisk i taget med små saxar och använd sedan mikrosax för att skära längs den ventrala mittlinjen för att exponera kroppshålan.Placera fisken i en silikonbelagd petriskål och täck över av en grund pool på 1X PBS. Under ett mikroskop vid 1,65X förstoring, dissekera testikorna med hjälp av tövövyper. Ta bort så mycket som fett och omgivande vävnad från testikorna som möjligt.Den gonad kommer att visas genomskinlig under dissektionen omfattning ljus medan det omgivande fettet kan ha en något mörkare utseende. Viss mängd fett kan lämnas på gonad utan att det innebär att förfarandet. Tillsätt varje dissekerade testiklar direkt i ett fem milliliter rör med två milliliter DMEM och hålla på is.För att dissocierera testikalcellerna, tillsätt 200 mikroliter av kollagenaslösning till fem milliliterröret med testikalerna. Blanda lösningen genom att invertera den flera gånger. Skaka försiktigt testikorna i en inkubatorskaktör horisontellt vid 100 RPM vid 32 grader Celsius.Snabbt invertera röret var 10:e minut för att underlätta dissociation. Efter en timme är DMEM grumlig och testikorna är i små bitar. Medan testikorna inkuberas i kollagenas, förkrigstiden 100 mikroliter av 0,1 molar sackaros lösning till 37 grader Celsius.För att tvätta ur kollagenasen, tillsätt DMEM till en slutlig volym på fem milliliter och invertera röret några gånger. Pellet testikorna vid 200 g i tre minuter vid rumstemperatur. Ta bort tre milliliter av supernatanten så att endast två milliliter återstår.Upprepa DMEM-tvätten ytterligare två gånger. Efter den sista DMEM tvätta, ta bort fyra milliliter av supernatanten och tillsätt en milliliter DMEM, 200 mikroliter trypsinlösning, och 20 mikroliter DNase I-lösning. Invertera röret några gånger för att blanda lösningen.Horisontellt skaka röret vid 32 grader Celsius vid 100 RPM. Snabbt invertera röret var femte minut för att underlätta dissociation. Efter fem till 15 minuter innehåller DMEM-lösningen endast några få klumpar.Tillsätt 500 mikroliter av trypsinhämmarlösningen och 50 mikroliter DNase I-lösning. Invertera röret några gånger för att blanda sedan kort snurra ner vid 200 g i tre minuter vid rumstemperatur för att ta bort vätska eller klumpar som kan hålla sig till rörlocket eller sidan av röret. Placera röret på is och resuspend cellen suspensionen genom upprepade pipett upp och ner med en plast överföring pipett i två minuter för att underlätta dissociation av eventuella kvarvarande klumpar.Se till att cellfjädringen inte går in i glödlampan på överföringspipetten. Sedan pre-wet en 100 mikron cell sil med DMEM och placera den på toppen av en 50 milliliter rör på is. Överför cellfjädringen genom silen en droppe i taget med hjälp av en plasttransferpipett.Överför filtratet med hjälp av en plasttransferpipett till ett nytt fem milliliterrör. Se till att samla ihop de poolade cellerna som är kopplade till undersidan av filtret. Lägg till DMEM i röret till en slutvolym på fem milliliter.Pellet cellerna på 200 g i fem minuter vid rumstemperatur. Ta bort så mycket supernatant som möjligt utan att störa pelleten och tillsätt fem mikroliter av DNase I-lösning direkt i pelleten. Blanda sedan pelleten med DNase I-lösningen genom att försiktigt skrapa utsidans botten av röret fyra till fem gånger längs ett tomt mikrocentrifugrörsställ.Lägg till DMEM till en slutvolym på fem milliliter och blanda lösningen genom att invertera röret flera gånger. Pellet cellupphängningen vid 200 g i två minuter i rumstemperatur. Upprepa DNase-behandlingen ytterligare en till tre gånger tills den återanvända pelleten inte klumpar ihop sig vid tillsats av DMEM.Efter det sista snurret, ta bort så mycket supernatant som möjligt utan att pelleten störs. Lägg därefter till en milliliter av 1X PBS och resuspend pelleten genom att försiktigt skrapa utsidan botten av röret längs en tom tub rack. Pellet cellupphängningen vid 200 g i fem minuter och ta sedan bort så mycket supernatant som möjligt utan att störa pelleten.Skär tre millimeter från slutet av en 200 mikroliter pipett spets för att vida bländaren. Med den skurna pipettspetsen, resuspend pelleten i 80 mikroliter av 0,1 molar sackaroslösning genom pipettering upp och ner. Låt cellupphängningen sitta i rumstemperatur i tre minuter.Nästa, med en pipett spets, päls en bild med 100 mikroliter av 1%formaldehyd med 0,15%Triton X-100. Lägg sedan till 18 mikroliter av sackaroscellupphängningen på mitten av bilden i en rak linje vinkelrätt mot långsidan. Luta glidningen fram och tillbaka för att underlätta spridning av cellupphängningen till alla hörn.Placera objektglasen platt ner i en något sprucken öppen fuktighetskammare för att förhindra att formaldehydlösningen torkar. Placera fuktighetskammaren i en mörk låda över natten. På morgonen tar du bort locket från fuktighetskammaren och låter objektglasen torka helt.Placera diabilderna i en coplin burk och fyll sedan coplin burken med destillerat vatten. Inkubera i fem minuter med varsam skakning i rumstemperatur. Häll ut vattnet och fyll burken med ett till 250 vätmedel.Tvätta två gånger i fem minuter vardera med varsam skakning i rumstemperatur. Låt objektglasen torka helt och förvara på minus 20 grader Celsius tills de är färgade. Detta protokoll beskrivs en metod för att förbereda och visualisera zebrafisk spermatocyte spridning som ger väl sprids icke-överlappande kärnor.Panelerna till vänster visar tre stadier av meiotisk prophase, leptotene, tidig zygoten och pachytene. Telomerer var färgade magenta för varje steg. Ett exempel på dålig kvalitet sprider sig på grund av otillräcklig DNase I behandlingar visas här.Meiotiska kromosomer som färgats för SYCP3 indikerar överlappande kärnor på grund av en viskös sackaroscellupphängning som förhindrar att celler sprids ordentligt på objektglaset. Det är mycket viktigt att börja med rätt mängd utgångsmaterial, behandla zebrafisktestes för lämplig tidsmängd i trypsin, och utföra det nödvändiga antalet DNase I behandlingar som underlåtenhet att göra det kan leda till mycket få kärnor eller hopklumpade kärnor. Korrekt PPE bör alltid bäras när man arbetar med formaldehyd.Efter spridningsproceduren kan kromosomer färgas för att visualisera olika kromosomala strukturer samt dubbelsträngsbrytningar för att analysera tidsinställningsberoende och lokalisering av meiotiska händelser. Vår teknik har banat väg för att visa att zebrafiskar kan vara en bättre modell av mänsklig spermatogenes än mus baserat på kromosomfunktionerna och telomerbukten.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Provberedning och analys av RNASeq-baserade gen uttryck Data från zebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Skyndsam strålning Biodosimetry automatiserade av disentrisk kromosom identifiering (ADCI) och dos uppskattning

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Poolade shRNA skärm för reaktivering av MeCP2 på inaktiva X-kromosomen

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralåga ingående Genome Sequencing bibliotek förberedelse från enda Tardigrade prov

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Hög genomströmning DNA-extraktion och genotypning av 3dpf zebrafiskar larver av Fin klippning

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

En icke-slumpmässig mus modell för farmakologisk Reaktive ring av Mecp2 på inaktiva X-kromosomen

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identifiering av förstärkare-promotor kontakter i embryoid organ av kvantitativa kromosom konformation Capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

Kromosomscreening av humana preimplantatoriska embryon med hjälp av använt odlingsmedium: provsamling och kromosomal ploidyanalys

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Fånga kromosomkonformation över längdskalor

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...