Name: preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Biz zebrabalığı meiocytes kromozomlar yaymak ve boyama için yöntemleri optimize etmek için yardımcı olmak için el yazması ve An Nguyen hakkında yorum için Trent Newman ve Masuda Sharifi teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH R01 GM079115 tarafından Desteklenmiştir.

Zebra balıkları içeren tüm yöntemler UC Davis Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan etik standartlar kullanılarak yapılmıştır.
1. Kromozom yayma prosedürü
NOT: Aşağıdaki protokol, slayt başına yüzlerce yayılan meyotik çekirdekiçeren 4-6 slayt oluşturmak üzere tasarlanmıştır. Kullanılan testislerin sayısı balığın büyüklüğüne bağlıdır. ~60 gün sonrası döllenme (dpf) ve ~ 6 ay sonrası döllenme (mpf...

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li><li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks,+synapsis,+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).</li><li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish.">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li><li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+recombination+in+human+males.">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li><li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+studies+of+human+meiosis:+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at,+or+prior+to,+establishment+of+double-strand+breaks.">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075 (2013).</li><li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes.">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442 (2014).</li><li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male.">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Saito, K., Siegfried, K. R., N&#252;sslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants.">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li><li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+by+breaking+and+repairing:+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination.">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li><li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females.">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li><li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes.">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).</li><li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+chiasmata+and+interference.">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li><li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies.">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li><li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene.">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).</li></ol>

Burada, zebra balığı testislerinden izole edilen spermatositlerden yayılan nükleer yüzey deki telomerlerin ve kromozomla ilişkili proteinlerin yerini araştırma yöntemlerini açıklıyoruz. Bu yöntemlerin diğer teleost türlerindeki spermatositlerin analizinde testislerin büyüklüğüne göre ayarlanabilecek şekilde uygulanacağını düşünüyoruz.
Zebrabalığı meiotik proteinlere sadece birkaç antikor yükseltilmiş olsa da, insan (h) veya fare (m) proteinlerine yükseltilm...

Eşeyli üreme, her biri somatik bir hücrenin kromozomunun yarısını taşıyan iki haploid gametin birleşimi ile devam eder. Meyozis DNA replikasyonu bir tur ve kromozom segregasyonu iki ardışık tur ile haploid gamet üreten özel bir hücre bölünmesidir. Profaz I'de homolog kromozomlar (homologlar) eşleştirme, rekombinasyon ve sinapstan geçmelidir, ikincisi enine filament, Sycp1(Şekil 1A,B)ile köprülenmiş iki homolog eksenden oluşan sinaptonal kompleksin oluşumu ile karakterizedir. Bu süreçlerin düzgün bir şekilde yürütülmemesi, insanlarda düşüklerin önde gelen nedenlerinden biri olan aneuploid gametlerin üretimine yol açabilir1. Eşleştirme arasındaki koordinasyon bilgimiz, rekombinasyon ve sinaps, maya, C. elegans,fare ve Drosophilagibi organizmaların geniş bir yelpazede çalışmalar la kolaylaştırılmıştır , diğerleri arasında2. Homolog kromozom eşleştirmesinin ve segregasyonun genel süreci iyi korunmuş olmakla birlikte, rekombinasyon ve sinapsa olan bağımlılığı ve bu olayların sırası farklılık gösterir.
Homolog rekombinasyon başlatan meyotik çift iplikçikli kopma (DSB) oluşumu, leptoten sırasında buket içinde kümelenmiş telomerlerin yakınında oluşur ve sinaps 3,4'tenkısa bir süresonraortaya çıkar. DSB oluşumu ve sinaps inisiyasyonu bu yapılandırma da insanlarda erkek mayoz bir özelliğidir ama fare5değil,6,7,8, zebra balığı insan spermatogenez için bir model olarak hizmet edebilir düşündüren. Zebra balığı meyozisi çalışmanın çeşitli pratik avantajları da vardır. Hem erkek hem de dişiler yetişkinlik boyunca gametogenez geçirirler, gonadlarına kolayca erişilebilir ler ve yüzlerce yavru tek bir haçtan üretilir. Ayrıca, embriyolar şeffaf ve dıştan geliştirmek, hangi aneuploid gametler nedeniyle embriyonik gelişim sapmalarının erken teşhisikolaylaştırır3,9. Zebra balığı kullanmanın dezavantajları, cinsel olgunluğa ulaşmada yavaş olmalarıdır (~60 gün) ve nükleer yüzey spreadleri için gerekli malzeme miktarı boyutlarına bağlı olarak ~10-20 yetişkin hayvanlardan toplanmalıdır.
Meyotik kromozom yayma preparatları, meyotik kromozom dinamiğinin temel imzaları incelenebildiği için, tüm model organizmalarda kromozom dinamiklerinin incelenmesi için hayati bir araçtır. Zebra balığında, meyotik program ve nükleer organizasyonun ilerlemesinin önemli yönleri, burada kromozom yayılımı olarak adlandırılan nükleer yüzey yayınımlarını delme yoluyla incelenmiştir, proteinlerin immünoresans tespiti için antikorlar ve/veya NÜkleik asitler FISHtarafından3,4,9,10,11,12. Nitekim, buket kümelenmiş telomerlerin polarize lokalizasyonu yayılma hazırlığında korunabilir (Şekil 1C). Son zamanlarda, zebrabalığı spermatosit kromozomu, floresan algılama yöntemleri ve süper çözünürlüklü mikroskopi ile birlikte zebrabalığı telomer dinamiği, homolog kromozom eşleştirme, çift iplikli break lokalizasyonu ve sinaps ilerlü anahtar meyatik geçişlerde ayrıntılı ilerlemesini açıklamak için kullandık3. Burada zebra balığı testislerinin spermatositlerinden kromozom spreadlerini hazırlamak ve daha sonra bunları floresan peptit nükleik asit (PNA) probları ile tekrarlanan telomer dizilerine ve kromozom ilişkili proteinlerin immünfloresans tespitine boyamak için yöntemler sarıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde, methanol-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 mm glasscoverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>363696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bag</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Used to make plastic coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>203775-500uL</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-zfSycp1</td>
			<td>Generated by Burgess lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10014CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Two are required for dissecting the testes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89429-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11042</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-hDMC1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8973</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-3683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>230401V (Model 5420)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Model Classic C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimerbly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Used for the humidity chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td>Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hamsterSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hMLH1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550838</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-hRPA</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>MABE285</td>
			<td>Does not work in our hands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Several commercial brands available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Alexa647</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1013</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA TelC-Cy3</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRPA</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-244A</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hSCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150292</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-hRad51</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX100469</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercut Scissors, 30&#176; angle, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-822-353</td>
			<td>Can also use any pair of small scissors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9897184</td>
			<td>Prepare as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9253-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from zebrafish spermatocytes

Meyozis, eşeyli üreme için haploid gametler oluşturmak için gerekli olan anahtar hücresel süreçtir. Model organizmalar, meyotik profaz sırasında meydana gelen kromozom olaylarının anlaşılmasında, eşleştirme, sinaps ve uygun kromozom ayrımını sağlayan rekombinasyon olayları da dahil olmak üzere etkili olmuştur. Fare bu süreçlerin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için önemli bir model olmakla birlikte, bu sistemdeki tüm meyotik olaylar insan mayoz bölünmesine benzemektedir. Yakın zamanda insan spermatogenezinin bir modeli olarak zebra balığının heyecan verici potansiyelini gösterdik. Burada, kromozom yayılımı preparatlarında meyotik kromozomları ve ilişkili proteinleri görselleştirme yöntemlerimizi ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu preparatlar kromozom yapılarının yüksek çözünürlüklü analizini sağlar. İlk olarak, testislerin yetişkin zebra balığından diseksiyon prosedürünü, ardından hücre ayrışması, lysis ve kromozomların yayılmasını tanımladık. Daha sonra, meyotik kromozom proteinlerinin lokalizasyonunu, immünororesans tespiti ve nükleik asit dizileri ile situ hibridizasyonda (FISH) floresan ile saptandırma prosedürünü tanımladık. Bu teknikler zebra balığı sisteminde ki meyotik kromatin mimarisinin sitolojik analizi için yararlı bir araç kümesi oluşturmaktadır. Zebra balığı topluluğundaki araştırmacılar bu tekniklerde hızlı bir şekilde ustalaşmalı ve bunları üreme fonksiyonlarının standart analizlerine dahil edebilmelidir.

Zebrabalığı spermatosit yayma preparatlarını hazırlamak ve görselleştirmek için bir yöntem belirledik. Doğru yapıldığında, prosedürümüz iyi yayılmış, üst üste binmeyen çekirdekleri verir. Bu tür çekirdekleri kurtarmak için, uygun miktarda başlangıç materyaline (yani testislere), testisleri yeterli süre için tripsin'de tedavi etmek ve yeterli sayıda DNase I tedavisine sahip olmak önemlidir. Bu spreadler daha sonra telomerler ve meyotik proteinler için pro...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes at JoVE.com

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Nükleer yüzey spreadleri, kekozis sırasında kromozom olaylarını incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Burada zebrabalığı spermatositlerinden profaz I sırasında meyotik kromozomları hazırlamak ve görselleştirmek için bir yöntem göstermek.

Zebrabalığı Spermatositlerinden Meiotik Kromozom Spreadlerinin Hazırlanması

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Zebra balığı homolog kromozom eşleştirme, sinaps ve rekombinasyon dahil olmak üzere meyozbölünme kromozom olayları incelemek için mükemmel bir omurgalı modeli olarak ortaya çıkmaktadır. Bu nükleer yüzey yayma protokolü süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak meyotik kromozom mimarisinin temel özelliklerini görselleştirmemizi sağladı. Araştırmacılar diğer zebra balığı yayma protokollerine göre daha az enkaz ile slayt başına iyi yayılmış çekirdekleri yüzlerce bekleyebilirsiniz.Bu prosedürün teknik olarak en zorlu kısmı, deriye yakın olduğu ve diğer organlara bağlı olduğu için zebra balığı testislerinin diseksiyonudur. Diseksiyon prosedürünü görselleştirmek, araştırmacıların hayvanın dokusuna gömülü gonad'ı gördüklerinde ne beklemeleri gerektiğini bilmelerini sağlayacaktır. Erkek zebra balığı ötenazi sonra, küçük makas ile bir seferde bir balık decapitate ve sonra vücut boşluğu ortaya çıkarmak için ventral orta hat boyunca kesmek için mikro makas kullanın.Bir silikon kaplı Petri kabına balık yerleştirin ve 1X PBS sığ bir havuz tarafından kapağı. 1.65X büyütme de bir mikroskop altında, forceps kullanarak testisler incelemek. Testislerden mümkün olduğunca çok yağ ve çevre dokuyu çıkarın.Gonad, diseksiyon kapsamı ışığı altında yarı saydam görünürken, çevredeki yağ biraz daha koyu bir görünüme sahip olabilir. İşlemi engellemeden bir miktar yağ bırakılabilir. Her parçalanmış testisleri doğrudan beş mililitrelik bir tüp içine dMEM iki mililitre ile ekleyin ve buz üzerinde tutmak.Testis hücrelerini ayrıştırmak için, testisler ile beş mililitrelik tüp kollajenaz çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin. Çözeltiyi birkaç kez ters çevirerek karıştırın. 32 santigrat derecede 100 RPM'de bir kuvöz çalkalayıcıda testisleri yavaşça sallayın.Ayrışmayı kolaylaştırmak için tüpü her 10 dakikada bir hızla ters çevirin. Bir saat sonra, DMEM bulutlu ve testisler küçük parçalar halinde. Testisler kollajenaz içinde kuluçkaya yatarken, 100 mikrolitre 0.1 molar sakaroz çözeltisi 37 santigrat dereceye kadar ısıtılır.Kollajenazyıkamak için, beş mililitre son bir hacim dmem ekleyin ve tüp birkaç kez ters. Pelet oda sıcaklığında üç dakika boyunca 200 g testisleri. Sadece iki mililitre kalması için süpernatantın üç mililitresini çıkarın.DMEM yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Son DMEM yıkamadan sonra, dört mililitre süpernatant çıkarın ve bir mililitre DMEM, 200 mikrolitre tripsin çözeltisi ve 20 mikrolitre DNase I çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin.100 RPM'de tüpü 32 derecede yatay olarak sallayın. Ayrışmayı kolaylaştırmak için tüpü her beş dakikada bir hızla ters çevirin. Beş ila 15 dakika sonra, DMEM çözümü yalnızca birkaç küme içerir.Tripsin inhibitörü çözeltisinin 500 mikrolitresini ve 50 mikrolitre DNase I çözeltisini ekleyin. Tüpü karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin sonra kısa bir süre 200 g oda sıcaklığında üç dakika boyunca aşağı spin sıvı veya tüp kapağı veya tüp tarafına yapışabilir kümeleri kaldırmak için. Tüpü buza yerleştirin ve kalan kümelerin ayrışmasını kolaylaştırmak için tekrar tekrar plastik bir transfer pipetiyle iki dakika boyunca yukarı ve aşağı boru lar atarak hücre süspansiyonunu yeniden askıya alın.Hücre süspansiyonunun transfer pipetinin ampulüne girmediğinden emin olun. Daha sonra DMEM ile 100 mikron hücreli bir süzgeç önceden ıslayın ve buz üzerinde 50 mililitrelik bir tüp üstüne yerleştirin. Plastik transfer pipeti kullanarak bir seferde bir damla süzgeç yoluyla hücre süspansiyon aktarın.Yeni bir beş mililitrelik tüp için plastik transfer pipet kullanarak filtrat aktarın. Filtrenin alt tarafına bağlı havuzlu hücreleri topladığızdan emin olun. Beş mililitrelik son bir hacme tüpiçine DMEM ekleyin.Hücreyi 200 g'da oda sıcaklığında beş dakika peletleyin. Peletrahatsız etmeden mümkün olduğunca çok supernatant çıkarın ve doğrudan pelet içine DNase I çözeltisi beş mikrolitre ekleyin. Daha sonra boş bir mikrosantrifüj tüp raf boyunca tüpün dış altını 4-5 kez hafifçe kazıyarak Pelet'i DNase I çözeltisi ile karıştırın.DMEM'i son beş mililitrelik bir hacme ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek çözeltiyi karıştırın. Hücre süspansiyonuna 200 g'da oda sıcaklığında iki dakika pelet. DNase tedavisini, yeniden askıda olan pelet DMEM ilavesi üzerine kümelenmeden bir ila üç kez daha tekrarlayın.Son spinsonra, pelet rahatsız etmeden mümkün olduğunca supernatant olarak kaldırın. Daha sonra, bir mililitre 1X PBS ekleyin ve boş bir tüp rafı boyunca tüpün dış altını hafifçe kazıyarak peleti yeniden askıya alın. Pelet hücre süspansiyon 200 g beş dakika ve sonra pelet rahatsız etmeden mümkün olduğunca çok supernatant çıkarın.Diyafram genişletmek için 200 mikrolitrelik pipet ucu ucundan üç milimetre kesin. Kesme pipet ucu ile, yukarı ve aşağı borulama tarafından 0,1 molar sakaroz çözeltisi 80 mikrolitre pelet resuspend. Hücre süspansiyonu üç dakika oda sıcaklığında oturun.Sonra, bir pipet ucu ile, 0,15% Triton X-100 ile% 1 formaldehit 100 mikrolitre ile bir slayt kat. Daha sonra sakaroz hücre süspansiyonunun 18 mikrolitresini uzun kenarına dik düz bir çizgide kaydırakın ortasına ekleyin. Hücre süspansiyonunun tüm köşelere yayılmasını kolaylaştırmak için kaydırağı ileri geri yatırın.Formaldehit çözeltisinin kurumasını önlemek için slaytları hafifçe çatlamış açık nem odasına düz bir şekilde yerleştirin. Nem odasını bir gecede karanlık bir çekmeceye yerleştirin. Sabahları, kapağı nem odasından çıkarın ve slaytların tamamen kurumasını bekleyin.Bir coplin kavanoza slaytlar yerleştirin ve sonra distile su ile coplin kavanoz doldurun. Oda sıcaklığında hafifçe sallayarak beş dakika kuluçka. Suyu dökün ve 1-250 ıslatma maddesi ile kavanozu doldurun.Oda sıcaklığında hafifçe sallayarak beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Slaytların tamamen kurumasını ve lekeli olana kadar eksi 20 derecede saklamasına izin verin. Bu protokol, zebra balığı spermatosit yayılımı nın hazırlanması ve görselleştirilmesi için bir yöntem ortaya konmuş ve bu yöntem üst üste yayılmaz çekirdekleri ortaya attırılmıştır.Soldaki paneller meiyotik profaz, leptoten, erken zigot ve pachytene üç aşamada göstermektedir. Telomerler her aşama için lekeli macenta idi. Yetersiz DNase I tedavileri nedeniyle düşük kaliteli yayılır bir örnek burada gösterilmiştir.SYCP3 için boyanmış meyotik kromozomlar, hücrelerin slaytta düzgün bir şekilde yayılmasını engelleyen viskoz bir sakaroz hücre süspansiyonuna bağlı olarak örtüşen çekirdekleri gösterir. Doğru miktarda başlangıç materyali ile başlamak, zebra balığı testislerini tripsin'de uygun süre için tedavi etmek ve bunu yapmamak çok az çekirdek veya kümelenmiş çekirdeklere yol açabileceğinden gerekli sayıda DNase I tedavisini gerçekleştirmek çok önemlidir. Formaldehit ile çalışırken uygun PPE her zaman giyilmelidir.Yayma işlemini takiben, kromozomlar çeşitli kromozom yapıları görselleştirmek için lekeli yanı sıra çift iplikçikli tatili zamanlaması bağımlılık ve meiyotik olayların lokalizasyonu analiz etmek için. Tekniğimiz, zebra balığının kromozom özelliklerine ve telomer buketine dayanarak fareden daha iyi bir insan spermatogenez modeli olabileceğini göstermenin yolunu açmıştır.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Hızlandırılmış radyasyon Biodosimetry tarafından otomatik Disentrik kromozom tanımlama (ADCI) ve doz tahmini

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Havuza alınan shRNA MeCP2 reaktivasyonu üzerinde etkin olmayan X kromozomu için ekran

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow giriş genom Kütüphane hazırlık bir tek Tardigrade örnekten sıralama

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Pasif X kromozom üzerinde Mecp2 farmakolojik yeniden aktivasyonu için rasgele olmayan bir fare modeli

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Kantitatif Kromozom Konformasyon Yakalama (4C) ile Embriyoid Cisimlerde Arttırıcı-Organizatör Kontalarının Belirlenmesi

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

İnsan Preimplantasyon Embriyolarının Harcanan Kültür Ortamı Kullanılarak Kromozom Taraması: Örnek Toplama ve Kromozomal Ploidi Analizi

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Uzunluk Ölçekleri Arasında Kromozom Konformasyonunu Yakalama

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...