Name: characterizing exon skipping efficiency in dmd patient samples in clinical trials of antisense oligonucleotides
Uploaded: 2020-05-07T13:00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides at JoVE.com

Nous sommes reconnaissants au Dr Takashi Saito, au Dr Tetsuya Nagata, à M. Satoshi Masuda et au Dr Eri Takeshita pour discussion scientifique.

<ol>
	<li>Bushby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+Duchenne+muscular+dystrophy,+part+2:+implementation+of+multidisciplinary+care.">Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care.</a> Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51 (6), 919-928 (1987).</li><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li><li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Greenberg, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+studies+in+newborn+males+with+Duchenne+muscular+dystrophy+detected+by+neonatal+screening.">Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening.</a> Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).</li><li>Forrest, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+of+gene+deletions+that+cause+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophies.">Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies.</a> Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).</li><li>Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+explanation+for+the+phenotypic+differences+between+patients+bearing+partial+deletions+of+the+DMD+locus.">An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus.</a> Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).</li><li>Flanigan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+spectrum+of+DMD+mutations+in+dystrophinopathy+patients:+application+of+modern+diagnostic+techniques+to+a+large+cohort.">Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort.</a> Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).</li><li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-frame+dystrophin+following+exon+51-skipping+improves+muscle+pathology+and+function+in+the+exon+52-deficient+mdx+mouse.">In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse.</a> Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).</li><li>Lu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+amounts+of+dystrophin+produced+by+skipping+the+mutated+exon+in+the+mdx+dystrophic+mouse.">Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse.</a> Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).</li><li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+systemic+morpholino+exon-skipping+in+Duchenne+dystrophy+dogs.">Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs.</a> Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).</li><li>Kesselheim, A. S., Avorn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approving+a+Problematic+Muscular+Dystrophy+Drug:+Implications+for+FDA+Policy.">Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).</li><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eteplirsen+for+the+treatment+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).</li><li>Komaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+the+antisense+oligonucleotide+NS-065/NCNP-01+for+skipping+of+exon+53+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy.">Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).</li><li>Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Droplet+PCR+for+the+Absolute+Quantification+of+Exon+Skipping+Induced+by+Antisense+Oligonucleotides+in+(Pre-)Clinical+Development+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> PLoS One. 11 (9), e0162467 (2016).</li><li>Takizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Duchenne+muscular+dystrophy+in+MYOD1-converted+urine-derived+cells+treated+with+3-deazaneplanocin+A+hydrochloride.">Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3807 (2019).</li></ol>

Les essais cliniques de DMD ont produit à la fois des succès et des échecs au cours des dernières années. Le RT-PCR et le blotting occidental sont des techniques communes pour évaluer l’efficacité de saut générée par les composés exon-saut administrés aux patients. Cependant, RT-PCR a été signalé à surestimer l’efficacité de saut par rapport à PCR numérique15. Bien que cela soit dû à un certain nombre de raisons, il est principalement causé par l’amplification plus efficace des petits fragments sautés pendant les cycles PCR. Il semble que RT-PCR utilisé dans cet essai clinique a également généré des gains d’efficacité plus élevés sauter par rapport à l’expression de protéine estimée par l’ouest blotting. Selon la FDA, il s’agit d’un moyen plus fiable de quantifier la restauration de la dystrophine12. Par conséquent, il faut faire preuve de prudence lors de l’interprétation des résultats de saut RT-PCR; toutefois, les échantillons peuvent encore être comparés. Les échantillons montrant des gains d’efficacité plus élevés en sautant basés sur les résultats de RT-PCR exhbitent généralement des niveaux plus élevés d’expression de protéine dans les analyses occidentales de tache.
Puisque tous les patients dans les essais cliniques de DMD n’ont pas le même modèle de suppression, il peut être difficile de concevoir des amorces et des sondes qui sont adéquatement spécifiques pour exécuter numérique ou qPCR sur tous les échantillons. Par conséquent, RT-PCR est toujours une bonne alternative pour une première évaluation de l’efficacité de saut. Avant le début de l’essai clinique de NS-065/NCNP-01, il était fastidieux d’évaluer l’efficacité du saut pour chaque patient in vitro puisqu’une biopsie musculaire ou cutanée était obligatoire pour générer des myoblastes spécifiques au patient. Cependant, nous avons récemment publié une nouvelle technique pour générer des cellules spécifiques à l’urine (UDC) converties par le patient myod1 comme nouveau modèle de cellules musculaires DMD16. Ainsi, seule l’urine recueillie auprès du patient est nécessaire pour générer les myoblastes, et aucune procédure invasive n’est nécessaire. Nous croyons que cette méthode peut être utilisée pour dépister différents AON dans les cellules spécifiques au patient. En outre, différentes amorces et sondes peuvent être testées avant que le patient commence n’importe quel essai clinique. Cela peut faciliter l’utilisation de qPCR ou PCR numérique pour la mesure exon sauter dans les essais cliniques DMD à l’avenir.
Pour effectuer l’analyse occidentale de tache dans cet essai clinique, un anticorps simple contre la dystrophine a été employé, et un seul contrôle sain a été employé comme échantillon de référence. Par conséquent, la spécificité de l’anticorps n’a pas été validée de manière appropriée. Ceci, avec le fait que l’anticorps ne reconnaît que le domaine C-terminal de la dystrophine, est une limitation du protocole. Des contrôles et des anticorps plus sains dirigés contre différents domaines de la molécule de dystrophine sont conseillés à l’avenir.
Ici, nous avons résumé les protocoles qui ont été utilisés dans le récent essai exploratoire initié par l’enquêteur et le premier essai humain de NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 est potentiellement applicable à 10,1% des patients atteints de DMD.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie musculaire dégénérative causant la perte progressive de masse musculaire, l’insuffisance respiratoire, et la cardiomyopathie, et il conduit à la mort prématurée1. La maladie est causée par un manque de la grande dystrophine de protéine structurelle de muscle2. Les mutations dans le gène DMD sur le chromosome X sont récessives, et la maladie affecte 1 dans 3500-5000 mâles nouveau-nés3,4,5. Les mutations sont souvent de grandes suppressions dans une région de hotspot entre les exons 44 et 55 qui conduisent à un cadre de lecture déformé et codons d’arrêt prématuré, causant la décomposition absurde-médiée et un manque presque total de protéine de dystrophine6,7,8. Le cadre de lecture peut être corrigé à l’aide d’oligonucléotides antisens (AON) qui induisent exon sauter et restaurer le cadre de lecture, en restaurant partiellement l’expression de la dystrophine et en retardant la progression de la maladie9,10,11. Le morplono AON eteplirsen, qui a été récemment approuvé par l’Agence fédérale des médicaments (FDA), induit sauter de l’exon 51 et peut restaurer le cadre de lecture chez les patients atteints d’exon 52 suppressions12,13. Cependant, exon 53 sauter restaure le cadre de lecture pour les patients avec exon 52 suppressions, et il peut potentiellement traiter environ 10% des patients atteints de DMD14. Le médicament morploino AON NS-065/NCNP-01 a été montré pour induire l’exon 53 sauter dans les cellules humaines, et nous avons récemment administré NS-065/NCNP-01 aux patients atteints de DMD dans le cadre d’un essai clinique de phase 1 à forte dose-escalade (ci-après, appelé « 'étudi ») (enregistré sous le nom d’UMIN: 000010964 et ClinicalTrials.gov : NCT02081625)14. L’étude a montré une augmentation dose-dépendante de l’exon 53 sauter basé sur les niveaux de protéines de RT-PCR et de dystrophine basée sur le blotting occidental, et aucun événement indésirable grave ou abandon n’a été observé14.
Dans tous les essais cliniques, l’analyse des résultats est d’une importance capitale. Pour les essais cliniques de DMD, un débat est toujours en cours concernant la meilleure méthode pour montrer un avantage de traitement. Les tests cliniques tels que le test de marche de 6 minutes présentent certains inconvénients. La caractérisation moléculaire de l’expression de la dystrophine peut être effectuée à l’aide de plusieurs méthodes, telles que RT-PCR, qPCR, digital-PCR, western blotting, et immunohistochemistry. Cependant, l’étendue de la restauration d’expression de protéine qui est exigée pour donner un avantage clinique demeure peu claire. Dans cet article de méthodes, nous décrivons en détail les méthodes de lottage RT-PCR et occidentales utilisées pour déterminer les niveaux d’exon et de protéines, respectivement, dans l’essai de phase 1 du médicament À SAUT AON NS-065/NCNP-0114.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Takara</td>
			<td>3407A</td>
			<td>marker solution for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35436-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>21418-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15-2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#215; Loading Buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose ME</td>
			<td>Iwai chemical</td>
			<td>50013R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A41046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>05808-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centri-Sep 96-Well Plates</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Blocking Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>2922498000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Automated Electrophoresis Station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007010</td>
			<td>Microchip electrophoresis system A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007107JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Priming Station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Vortex Station II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Thick Blot Filter Paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EzBlot</td>
			<td>Atto</td>
			<td>AE-1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vial</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>1880 SV20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>17045-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histofine Simple Stain MAX PO</td>
			<td>Nichirei</td>
			<td>424151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Clear Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>mlp9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus)</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>NCL-DYS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>NCL-SPEC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EA03785BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LA0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oriole Fluorescent Gel Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physcotron Handy micro-homogenizer</td>
			<td>MICROTEC</td>
			<td>NS-310E3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>556463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN OneStep RT-PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>210212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31606-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-dry transfer machine</td>
			<td>Bio Craft</td>
			<td>41-1293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td>for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35430-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth Gum</td>
			<td>Wako</td>
			<td>200-02245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA Buffer</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>316-90025</td>
			<td>for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35907-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing exon skipping efficiency in dmd patient samples in clinical trials of antisense oligonucleotides

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie musculaire dégénérative qui provoque une perte progressive de masse musculaire, conduisant à la mort prématurée. Les mutations provoquent souvent un cadre de lecture déformé et des codons d’arrêt prématurés, ayant pour résultat un manque presque total de protéine de dystrophine. Le cadre de lecture peut être corrigé à l’aide d’oligonucléotides antisens (AON) qui induisent l’exon sauter. Le morploino AON viltolarsen (nom de code: NS-065/NCNP-01) a été montré pour induire exon 53 sauter, la restauration du cadre de lecture pour les patients atteints de suppressions exon 52. Nous avons récemment administré ns-065/NCNP-01 par voie intraveineuse aux patients de DMD dans un essai exploratoire de investigateur-initié, premier-humain de NS-065/NCNP-01. Dans cet article de méthodes, nous présentons la caractérisation moléculaire de l’expression de dystrophine utilisant le séquençage de Sanger, RT-PCR, et le blotting occidental dans l’essai clinique. La caractérisation de l’expression de dystrophine était fondamentale dans l’étude pour montrer l’efficacité puisqu’aucun essai fonctionnel de résultat n’a été exécuté.

Pour utiliser RT-PCR pour détecter le saut exon, les amorces de chaque côté de l’exon qui seront ignorés ont été conçues et évaluées pour ne produire que des bandes spécifiques (voir la figure 2 pour un diagramme schématique de l’exon sauter et de la position d’amorce). Les amorces devraient générer des produits qui peuvent facilement être distingués par la taille sur un système MCE ou l’électrophorèse normale de gel d’agarose si MCE n’est pas disponible. La figure 3a montredes images de gel du système MCE A des réactions de RT-PCR et des résultats de séquençage de la bande sautée des patients NS-03 et NS-07 avant et après le traitement avec NS-065/NCNP-01 dans l’essai de phase 1 dose-escalade. NS-03 et NS-07 port suppressions qui couvrent exons 45-52 et 48-52, respectivement. NS-03 a reçu 5 mg/kg et NS-07 20 mg/kg de NS-065/NCNP-01 par semaine pendant 12 semaines. Comme prévu avant le traitement, les deux patients n’ont montré aucun saut, et seulement une bande non-sautée a pu être visualisée. Après 12 semaines de traitement, une bande inférieure claire sautée a été visualisée pour NS-07. Cependant, il était encore difficile de détecter n’importe quel produit sauté pour le patient NS-03. Les résultats du séquençage ont montré une concaténation des exons 47 et 54 pour NS-07, ainsi que des exons 44 et 54 pour NS-03. Selon la séquence, ceux-ci pourraient théoriquement produire un isoforme fonctionnel mais raccourci de dystrophine. Pour calculer le pourcentage de saut indiqué à la figure 3b, la concentration molaire de la bande sautée a été divisée par la bande sautée et non sautée. Pour le patient NS-07, le pourcentage après traitement était de 72%, et il était de 3,4% pour NS-03. Les données occidentales de tache (en triple licence) des patients NS-03, NS-07, et un contrôle sain sont indiquées dans la figure 4a. On s’attendait à ce qu’aucune bande de dystrophine n’ait été détectée avant traitement. Après traitement une bande du patient NS-07 a été détectée avec un poids moléculaire inférieur comparé au contrôle sain (la dystrophine de type sauvage a un poids moléculaire de 427 kDa, et la dystrophine de NS-07 a un poids moléculaire de 389 kDa). En raison de la suppression d’exon et du saut, l’isoforme de dystrophine du patient NS-07 a manqué plusieurs exons, et on s’attendait à ce qu’il ait un poids moléculaire inférieur. Le patient NS-03 n’a montré aucun niveaux détectables de dystrophine après traitement. Dans la figure 4b, la quantité de dystrophine comparée à un contrôle sain pour le patient NS-07 est montrée. L’emplacement où les intensités de signal ont été mesurées pour le calcul de la restauration de dystrophine sont indiqués avec des carrés bleus. Le rapport de spectron de dystrophine a été employé pour calculer la quantité de dystrophine comparée à celle du contrôle sain. À cette fin, le signal de la dystrophine moins fond a été divisé par la somme des deux isoformes de spectron (long et court) moins arrière-plan (voir étape 8.6.5). Le ratio pour un contrôle sain a été fixé à 100%. La quantité de dystrophine comparée au contrôle sain dans le patient NS-07 après traitement était 9.1%. Cependant, le pourcentage n’a pas pu être calculé pour le patient NS-03 en raison d’une bande de dystrophine faible, qui semblable à ceux obtenus pour des échantillons de traitement antérieurs pour les deux patients.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig1.jpg"> Figure 1 : Diagramme schématique de la pile de transfert pour l’analyse des taches occidentales. Assemblage de la pile de transfert de taches occidentales avec du papier blotting trempé dans le tampon A blotting dans le fond suivi par le papier blotting trempé dans le tampon B, membrane PVDF, le gel de Tris-Acetate 3-8% et sur le dessus 2 papiers blotting trempés dans le tampon de blotting C est montré. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig2.jpg"> Figure 2 : Dessin schématique de saut d’exon de l’exon 53 dans un patient avec la suppression d’exon 45-52 dans le gène DMD. Par exemple, le patient NS-03 dans l’essai clinique dose-escalade a eu cette suppression. Si l’exon 53 est conservé, l’ARNm sera hors cadre puisque la jonction exon-exon entre l’exon 44 et 53 perturbe le cadre de lecture, provoquant un codon d’arrêt dans l’exon 53. Le cadre de lecture est restauré lorsque l’exon 53 est ignoré, et un isoforme plus court de la dystrophine est produit. Pour détecter l’exon 53-saut par RT-PCR, les amorces dans exon 44 et 54 sont utilisées de sorte que le produit PCR entre sauté et non-sauté ARNm peut facilement être détecté. FWD: amorce avant, REV: amorce inversée, PMO: phosphorodiamidate morpholino oligomer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig3.jpg"> Figure 3 : Ignorer l’efficacité pour les patients NS-03 et NS-07 à partir d’échantillons de biopsie musculaire antérieure tibialis. a) Image de gel générée par le système d’électrophorèse A d’échantillons RT-PCR d’échantillons non traités et traités des patients NS-03 et NS-07. Le panneau supérieur montre NS-03 et le panneau inférieur NS-07 en triple. Pour NS-03, la bande non sautée est de 422 pb, et la bande sautée est de 212 pb. Pour NS-07, les bandes sont respectivement de 836 pb et de 624 pb. L’analyse de séquence a montré une concaténation de l’exon 44 et de l’exon 54 pour NS-03 et de l’exon 47 à l’exon 54 pour NS-07. b) L’efficacité de saut avant et après le traitement est montrée pour les patients NS-03 et NS-07, calculée à partir de la concentration molaire des deux bandes fournies par le système A en tant que bande sautée/(bande sautée + bande non sautée) x 100. L’efficacité de saut pour NS-03 était très faible après le traitement; pour NS-07, l’efficacité de saut était de plus de 70%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig4.jpg"> Figure 4 : Quantification protéique des isoformes de dystrophine avant et après la thérapie de saut d’exon. a) Quantification protéique des isoformes de dystrophine avant et après la thérapie de saut d’exon. Tache occidentale de biopsie de muscle du tibialis antérieur des patients NS-03 et NS-07 avant et après traitement et de contrôle sain dans le triplement. La dystrophine peut être vue à 427 kDa pour le contrôle sain et à 389 kDa pour NS-07 après traitement. Aucune dystrophine n’a pu être détectée pour l’un ou l’autre patient avant le traitement, ou aucun n’a pu être détecté après traitement pour le patient NS-03. La zone de la boîte noire est indiquée à la figure 4b. À gauche dans chaque tache, le marqueur est affiché. b) La quantité de dystrophine rétablie après traitement pour le patient NS-07. La restauration de la dystrophine a été calculée en fonction de l’intensité des bandes pour la dystrophine, l’arrière-plan, et l’isoforme longue et courte de la spectrorine selon la formule : (dystrophine - arrière-plan)/(spectrin L -arrière-plan) + (spectron S - fond) où le rapport pour un contrôle sain est fixé à 100%. L’intensité de chaque bande a été mesurée à l’intérieur des boîtes bleues indiquées dans la figure. La restauration de dystrophine pour NS-07 était 9.1% après traitement. Le signal de dystrophine était trop faible pour mesurer dans les échantillons non traités. Les tailles de marqueur sont indiquées dans les kilodaltons. Dys: Dystrophine, BG: fond, SL: Spectrin isoforme longue, SS: Spectrin isoforme courte, My: Myosin type 1. Les tailles de marqueur sont indiquées dans les kilodaltons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Solution</td>
			<td>Volume/Réaction (μl)</td>
			<td>Concentration finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eau sans RNase (fournie)</td>
			<td>Variable</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>5x Tampon QIAGEN OneStep RT-PCR</td>
			<td>5.0</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>mix dNTP (contenant 10 mM de chaque dNTP)</td>
			<td>1.0</td>
			<td>400 μM de chaque dNTP</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amorce avant (10 μM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0,6 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amorce inversée (10 μM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0,6 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix</td>
			<td>1.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inhibiteur de RNase (facultatif)</td>
			<td>Variable</td>
			<td>5–10 unités/réaction</td>
		</tr>
<tr>
<td>ARN de modèle</td>
			<td>50 ng</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : réactifs RT-PCR. Les composés nécessaires pour une réaction de la RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Amorce</td>
			<td>Séquence</td>
		</tr>
<tr>
<td>44F</td>
			<td>5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>46F</td>
			<td>5'-AACCTGGAAAGAGAGCACAA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>48F</td>
			<td>5'-CCAAGAAGGACCATTTTGGACG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54/55R</td>
			<td>5'-TCTCGCCTACTCACCTTTTTT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54R</td>
			<td>5'-GTGGACTTTTUGGTATCAT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Liste d’amorces. Séquences pour les amorces utilisées dans cette étude. F: Avant, R: Revers.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 cycle</td>
			<td>Transcription inversée</td>
			<td>30 min</td>
			<td>50 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 cycle</td>
			<td>Étape initiale d’activation du PCR</td>
			<td>15 min</td>
			<td>95 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">35 cycles</td>
			<td>Dénaturation</td>
			<td>1 min</td>
			<td>94 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Recuit</td>
			<td>1 min</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extension</td>
			<td>1 min</td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 cycle</td>
			<td>Prolongation finale</td>
			<td>7 min</td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tenir</td>
			<td></td>
			<td>∞</td>
			<td>4 °C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : PCR conditionné utilisé. Afficher les conditions PCR pour la réaction RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Solution</td>
			<td>Volume/Réaction (μl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eau sans RNase</td>
			<td>Variable</td>
		</tr>
<tr>
<td>BigDye Terminator 3.1 Ready Reaction Mix</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amorce avant/amorce inversée (3,2 μM)</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>ARN de modèle</td>
			<td>20 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td>20</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 4 : Réactifs nécessaires à la réaction de séquençage. Utilisez l’amorce vers l’avant ou l’inversion dans la configuration, pas les deux en même temps.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 cycle</td>
			<td>1 min</td>
			<td>96 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">25 cycles</td>
			<td>10 s</td>
			<td>96 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 s</td>
			<td>50 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 min</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tenir</td>
			<td>∞</td>
			<td>4 °C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 5 : Conditions pcr pour le séquençage sanger.

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Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

Ici, nous présentons la caractérisation moléculaire de l’expression de dystrophine 38 utilisant le séquençage de Sanger, RT-PCR, et le blotting occidental dans l’essai clinique.

Caractérisation de l’efficacité de saut d’Exon dans les échantillons de patients de DMD dans les essais cliniques d’oligonucléotides d’Antisense

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Ce protocole fournit une méthodologie normalisée pour la préparation et la manipulation des tissus musculaires dans les milieux précliniques et les essais cliniques, ce qui est important pour obtenir des résultats fiables dans le domaine de la DMD. Les techniques sont pertinentes pour les essais de saut d’exon pour DMD. Et le principal avantage est que, ils sont bien établis et reproductibles s’ils sont réalisés collectivement.Ces techniques sont principalement axées sur le saut d’exon dans DMD, mais avec un changement d’amorce, les mêmes techniques peuvent être appliquées à d’autres maladies traitées avec des thérapies d’épissage. Ces méthodes peuvent être utilisées pour atteindre l’efficacité de saut d’exon à la fois et l’ARN et les protéines. Pour préparer un échantillon aux fins d’analyse, mélangez d’abord des volumes égaux de gomme de tragacanth et d’eau jusqu’à ce que la gomme devienne molle et collante.Chargez ce mélange en seringues de 25 millilitres et distribuez de 0,5 à un centimètre de gomme sur des disques de liège individuels. Étiquetez les disques de l’autre côté et placez un contenant d’isopentane dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’une partie du liquide gèle. Placez chaque spécimen dans la gomme de tragacanth sur les disques avec un axe longitudinal de chaque muscle perpendiculaire au liège.Placez la gomme au fond de chaque muscle pour aider à maintenir le muscle en place, et utilisez des pinces à épiler pour congeler les spécimens dans l’isopentane froid. Déplacez les spécimens en continu pendant une minute ou jusqu’à ce qu’ils soient complètement congelés avant de les placer temporairement sur de la glace sèche. Ensuite, placez les spécimens dans des flacons de verre pour un stockage de 80 degrés Celsius.Pour sectioner le tissu musculaire gelé pour analyse, réglez un cryostat à une température de travail de 25 degrés Celsius, et pour monter le bloc musculaire sur le support. Couper le bloc tissulaire jusqu’à ce que les sections plates soient atteintes. Pour l’analyse inverse de transcriptase PCR et de tache occidentale, obtenez 10 tranches épaisses de micromètre.Pour l’analyse immunohistochimique, obtenir six à huit tranches micromètres d’épaisseur, et pour l’hématoxyline et la coloration de l’éosine, obtenir 10 à 12 tranches d’épaisseur micromètre. Après leur acquisition, placer les sections tranchées dans deux tubes millilitres. Stockez les échantillons pour le PCR et le ballonnement occidental à 80 degrés Celsius.Ici, le système d’électrophoresis de micropuce, les images de gel des réactions inverses de PCR de transcriptase, et les résultats de séquençage de la bande sautée de deux patients avant et après traitement avec un oligonucleotide antisens dans un essai de phase d’escalade de dose un sont montrés. Les deux patients hébergent des suppressions. Comme prévu, avant le traitement, les deux patients n’ont montré aucun saut et seulement une bande non sautée pourrait être visualisée.Après 12 semaines de traitement, une bande inférieure sautée claire a été visualisée pour le deuxième patient, cependant, il était toujours difficile de détecter n’importe quel produit sauté pour le premier patient. Les résultats de séquençage ont montré une concatenation des exons 47 et 54 pour le deuxième patient, et des exons, 44 et 54 pour le premier patient. Pour calculer le pourcentage sauté, la concentration molaire de la bande sautée a été divisée par les bandes sautées et non sirotées.Comme prévu, aucune bande de dystrophine n’a été détectée par la tache occidentale avant traitement. Après traitement, une bande a été détectée du deuxième patient avec un poids moléculaire inférieur comparé à celui observé dans le contrôle sain. Le premier patient, cependant, n’a montré aucun niveau détectable de dystrophine après traitement.Il est essentiel de manipuler correctement le tissu musculaire et de placer chaque spécimen sur la gencive tragacanth de manière cohérente. Les sections tissulaires peuvent être analysées de différentes façons, y compris artificielle à PCR, PCR numérique, tache occidentale, immunohistochimie, et avec différents types d’omiques. Ces techniques peuvent être accélérer, le développement, exon supplémentaires sauter des médicaments ciblant différents exons, et peut être appliquée au développement de base virale et à nouveau dans l’édition pour DMD.

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