Name: characterizing exon skipping efficiency in dmd patient samples in clinical trials of antisense oligonucleotides
Uploaded: 2020-05-07T13:00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides at JoVE.com

אנו אסירי תודה לד"ר טקאשי סאיטו, ד"ר טצויה נאגאטה, מר סאטושי מסודה, וד"ר ארי טקשיטה לדיון מדעי.

<ol>
	<li>Bushby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+Duchenne+muscular+dystrophy,+part+2:+implementation+of+multidisciplinary+care.">Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care.</a> Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51 (6), 919-928 (1987).</li><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li><li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Greenberg, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+studies+in+newborn+males+with+Duchenne+muscular+dystrophy+detected+by+neonatal+screening.">Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening.</a> Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).</li><li>Forrest, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+of+gene+deletions+that+cause+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophies.">Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies.</a> Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).</li><li>Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+explanation+for+the+phenotypic+differences+between+patients+bearing+partial+deletions+of+the+DMD+locus.">An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus.</a> Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).</li><li>Flanigan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+spectrum+of+DMD+mutations+in+dystrophinopathy+patients:+application+of+modern+diagnostic+techniques+to+a+large+cohort.">Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort.</a> Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).</li><li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-frame+dystrophin+following+exon+51-skipping+improves+muscle+pathology+and+function+in+the+exon+52-deficient+mdx+mouse.">In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse.</a> Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).</li><li>Lu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+amounts+of+dystrophin+produced+by+skipping+the+mutated+exon+in+the+mdx+dystrophic+mouse.">Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse.</a> Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).</li><li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+systemic+morpholino+exon-skipping+in+Duchenne+dystrophy+dogs.">Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs.</a> Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).</li><li>Kesselheim, A. S., Avorn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approving+a+Problematic+Muscular+Dystrophy+Drug:+Implications+for+FDA+Policy.">Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).</li><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eteplirsen+for+the+treatment+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).</li><li>Komaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+the+antisense+oligonucleotide+NS-065/NCNP-01+for+skipping+of+exon+53+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy.">Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).</li><li>Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Droplet+PCR+for+the+Absolute+Quantification+of+Exon+Skipping+Induced+by+Antisense+Oligonucleotides+in+(Pre-)Clinical+Development+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> PLoS One. 11 (9), e0162467 (2016).</li><li>Takizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Duchenne+muscular+dystrophy+in+MYOD1-converted+urine-derived+cells+treated+with+3-deazaneplanocin+A+hydrochloride.">Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3807 (2019).</li></ol>

אף לא אחד .

ניסויים קליניים של DMD יצרו גם הצלחות וכישלונות בשנים האחרונות. הן RT-PCR והן כתמים מערביים הם טכניקות נפוצות כדי להעריך את יעילות דילוג שנוצר על ידי exon-דילוג תרכובות הניתנות לחולים. עם זאת, RT-PCR דווח להעריך יתר על המידה את יעילות דילוג לעומת PCRדיגיטלי 15. למרות שזה בגלל מספר סיבות, זה נגרם בעיקר על ידי ההגדלה יעילה יותר של שברים קטנים מדלג במהלך מחזורי PCR. נראה כי RT-PCR בשימוש בניסוי קליני זה גם יצר יעילות דילוג גבוהה יותר בהשוואה לביטוי החלבון המוערך על ידי כתמים מערביים. על פי ה-FDA, זוהי דרך אמינה יותר לכמת שיקום דיסטרופין12. לפיכך, יש לנקוט זהירות בעת פענוח תוצאות דילוג RT-PCR; עם זאת, עדיין ניתן להשוות את הדגימות. דוגמאות המציגות יעילות דילוג גבוהות יותר בהתבסס על תוצאות RT-PCR בדרך כלל מופקעות רמות גבוהות יותר של ביטוי חלבון בניתוחי כתם מערבי.
מאז כל החולים בניסויים קליניים DMD אין את אותו דפוס מחיקה, זה יכול להיות קשה לעצב פריימרים ובדיקות כי הם ספציפיים במידה מספקת כדי לבצע דיגיטלי או qPCR על כל הדגימות. לפיכך, RT-PCR היא עדיין אלטרנטיבה טובה להערכה ראשונה של יעילות דילוג. לפני הניסוי הקליני של NS-065/NCNP-01 החל, זה היה מייגע להעריך דילוג יעילות עבור כל מטופל במבחנה מאז או שריר או ביופסיה בעור היה חובה כדי ליצור myoblasts ספציפי למטופל. עם זאת, פרסמנו לאחרונה טכניקה חדשנית כדי ליצור MYOD1 ספציפי למטופל מומר, נגזר שתן תאים (UDCs) כמו מודל תא שריר DMDרומן 16. לפיכך, רק שתן שנאסף מהמטופל נדרש כדי ליצור את myoblasts, ואין צורך בהליך פולשני. אנו מאמינים כי שיטה זו יכולה לשמש כדי לסנן AONs שונים בתאים ספציפיים למטופל. יתר על כן, פריימרים שונים ובדיקות ניתן לבדוק לפני המטופל מתחיל כל ניסוי קליני. זה יכול להקל על השימוש qPCR או PCR דיגיטלי עבור exon דילוג מדידה בניסויים קליניים DMD בעתיד.
לביצוע ניתוח כתם מערבי בניסוי קליני זה, נעשה שימוש בנוגדן יחיד נגד דיסטרופין, ורק בקרה בריאה אחת שימשה ודגימת התייחסות. לפיכך, הספציפיות של הנוגדן לא אומתה כראוי. זה, יחד עם העובדה כי הנוגדן מכיר רק את התחום C-מסוף של דיסטרופין, היא מגבלה של הפרוטוקול. בקרות בריאות יותר ונוגדנים מכוונים נגד תחומים שונים של מולקולת דיסטרופין מומלצים בעתיד.
כאן, סיכם את הפרוטוקולים ששימשו בניסוי הראשון של החוקרים ביוזמת החוקר, הראשון בבני אדם של NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 עשוי להיות ישים ל-10.1% מהחולים עם DMD.

ניוון שרירים Duchenne (DMD) היא מחלת שריר ניוונית הגורמת לאובדן הדרגתי של מסת שריר, כשל נשימתי, קרדיומיופתיה, וזה מוביללמוות בטרם עת 1. המחלה נגרמת על ידי חוסר דיסטרופין חלבון שריר מבני גדול2. מוטציות בגן DMD על כרומוזום X הם רצסיביים, והמחלה משפיעה 1 ב 3500-5000 זכרים שזהם נולד 3,,4,,5. המוטציות הן לעתים קרובות מחיקות גדולות באזור נקודה חמה בין exons 44 ו 55 שמובילים למסגרת קריאה מעוותת וקודונים עצירה מוקדמת, גרימת ריקבון בתיווך שטויות וחוסר כמעט מוחלט של חלבון דיסטרופין6,,7,8. ניתן לתקן את מסגרת הקריאה באמצעות אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (AONs) הגורם לאקסון דילוג ושחזור של מסגרת הקריאה, שחזור חלקי של ביטוי דיסטרופין ועיכוב התקדמותהמחלה 9,10,11. morpholino AON eteplirsen, אשר אושרה לאחרונה על ידי סוכנות התרופות הפדרלית (FDA), גורם דילוג של exon 51 והוא יכול לשחזר את מסגרת הקריאה בחולים עם exon 52מחיקות 12,13. עם זאת, exon 53 דילוג משחזר את מסגרת הקריאה עבור חולים עם exon 52 מחיקות, וזה יכול לטפל פוטנציאלית כ 10% של חולי DMD14. NS-065/NCNP-01 morpholino התרופה NS-065/NCNP-01 כבר הראה לגרום exon 53 דילוג בתאים אנושיים, ולאחרונה נתנו NS-065/NCNP-01 לחולים DMD בשלב 1 פתוח תווית מינון הסלמה ניסוי קליני (להלן, המכונה "המחקר") (רשום כUMIN: 000010964 ו ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. המחקר הראה עלייה תלויה במינון של exon 53 דילוג בהתבסס על RT-PCR ורמות חלבון דיסטרופין המבוסס על כתמים מערביים, ולא תופעות לוואי חמורות או נושריםנצפו 14.
בכל הניסויים הקליניים, הניתוח של התוצאות הוא בעל חשיבות עליונה. עבור ניסויים קליניים DMD, דיון הוא עדיין מתמשך לגבי השיטה הטובה ביותר כדי להראות יתרון טיפול. לבדיקות קליניות כגון בדיקת הליכה של 6 דקות יש חסרונות מסוימים. אפיון מולקולרי של ביטוי הדיסטרופין יכול להתבצע באמצעות מספר שיטות, כגון RT-PCR, qPCR, דיגיטלי-PCR, כתמים מערביים, וimmunohistoistoistry. עם זאת, היקף שיקום ביטוי החלבון הנדרש כדי להקנות תועלת קלינית נותר לא ברור. במאמר שיטות זה, אנו מתארים בפירוט את RT-PCR ושיטות ההתנפחות המערביות המשמשות לקביעת רמות האקסון ורמות החלבון, בהתאמה, בניסוי שלב 1 של AON דילוג על התרופה NS-065/NCNP-0114.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Takara</td>
			<td>3407A</td>
			<td>marker solution for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35436-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>21418-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15-2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#215; Loading Buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose ME</td>
			<td>Iwai chemical</td>
			<td>50013R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A41046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>05808-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centri-Sep 96-Well Plates</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Blocking Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>2922498000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Automated Electrophoresis Station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007010</td>
			<td>Microchip electrophoresis system A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007107JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Priming Station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Vortex Station II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Thick Blot Filter Paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EzBlot</td>
			<td>Atto</td>
			<td>AE-1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vial</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>1880 SV20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>17045-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histofine Simple Stain MAX PO</td>
			<td>Nichirei</td>
			<td>424151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Clear Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>mlp9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus)</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>NCL-DYS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>NCL-SPEC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EA03785BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LA0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oriole Fluorescent Gel Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physcotron Handy micro-homogenizer</td>
			<td>MICROTEC</td>
			<td>NS-310E3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>556463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN OneStep RT-PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>210212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31606-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-dry transfer machine</td>
			<td>Bio Craft</td>
			<td>41-1293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td>for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35430-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth Gum</td>
			<td>Wako</td>
			<td>200-02245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA Buffer</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>316-90025</td>
			<td>for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35907-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing exon skipping efficiency in dmd patient samples in clinical trials of antisense oligonucleotides

ניוון שרירים דושן (DMD) היא מחלת שריר ניוונית הגורמים לאובדן הדרגתי של מסת שריר, המוביל למוות בטרם עת. המוטציות גורמות לעתים קרובות למסגרת קריאה מעוותת ולפגן בקוביות עצירה מוקדמות, וכתוצאה מכך חוסר כמעט מוחלט בחלבון דיסטרופין. ניתן לתקן את מסגרת הקריאה באמצעות אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (AONs) הגורם לאקסון דילוג. morpholino AON viltolarsen (שם קוד: NS-065/NCNP-01) הוצג כדי לגרום exon 53 דילוג, שחזור מסגרת הקריאה עבור חולים עם exon 52 מחיקות. לאחרונה נתנו NS-065/NCNP-01 דרך וירדות לחולים DMD ב חוקר ביוזמת חוקר, ניסוי ראשון בבני אדם של NS-065/NCNP-01. במאמר שיטות זה, אנו מציגים את האפיון המולקולרי של ביטוי דיסטרופין באמצעות רצף סנגר, RT-PCR, וכתמים מערביים בניסוי הקליני. האפיון של ביטוי דיסטרופין היה בסיסי במחקר להצגת היעילות מאז לא בוצעו בדיקות תוצאה פונקציונלית.

כדי להשתמש ב- RT-PCR כדי לזהות דילוג על exon, פריימרים משני צדי האקסון שידלגו עליהם תוכננו והוערכו כדי להניב להקות ספציפיות בלבד (ראה איור 2 עבור דיאגרמה סכמטית של דילוג אקסון ומיקום פריימר). פריימרים צריך ליצור מוצרים שניתן להבחין בקלות לפי גודל על מערכת MCE או אלקטרופורזה ג'ל agarose נורמלי אם MCE אינו זמין. איור 3מראה מערכת MCE תמונות ג'ל של תגובות RT-PCR ואת תוצאות ה רצף של הלהקה דילג מחולים NS-03 ו NS-07 לפני ואחרי טיפול עם NS-065/NCNP-01 בניסוי שלב 1 של הסלמה במינון. מחיקות נמל NS-03 ו-NS-07 המשתרעות על פני 45-52 ו-48-52, בהתאמה. NS-03 קיבל 5 מ"ג/ק"ג ו-NS-07 20 מ"ג/ק"ג של NS-065/NCNP-01 שבועי במשך 12 שבועות. כצפוי לפני הטיפול, שני החולים לא הראו דילוגים, ורק להקה שלא דילגה עליה ניתן היה לדמיין. לאחר 12 שבועות של טיפול, להקה נמוכה מדלג ברור היה לדמיין עבור NS-07. עם זאת, זה עדיין היה קשה לזהות כל מוצר מדלג עבור חולה NS-03. תוצאות ההתלתה הראו שרשור של exons 47 ו-54 עבור NS-07, כמו גם exons 44 ו-54 עבור NS-03. על פי הרצף, אלה יכולים תיאורטית לייצר איזופורם דיסטרופין פונקציונלי אך מקוצר. כדי לחשב את אחוזי דילוג המוצג באיון 3b, ריכוז החתרנות הטוחנת עבור הלהקה שמדלגת חולקה על-ידי הרצועה שמדלגים עליה ובטלה דילגה עליה. עבור חולה NS-07, האחוז לאחר הטיפול היה 72%, וזה היה 3.4% עבור NS-03. נתוני כתם מערבי (בשלושה רישיות) מחולים NS-03, NS-07, ושליטה בריאה מוצגים איור 4a. כצפוי, לא זוהתה להקת דיסטרופין לפני הטיפול. לאחר הטיפול להקה ממטופל NS-07 זוהתה עם משקל מולקולרי נמוך יותר בהשוואה לבקרה בריאה (דיסטרופין סוג פראי יש משקל מולקולרי של 427 kDa, ו NS-07 dystrophin יש משקל מולקולרי של 389 kDa). בגלל המחיקה exon ודילוג, isoform דיסטרופין ממטופל NS-07 חסר כמה exons, וזה היה צפוי להיות משקל מולקולרי נמוך יותר. חולה NS-03 הראה שום רמות לגילוי של דיסטרופין לאחר הטיפול. באות 4b, כמות הdystrophin לעומת שליטה בריאה עבור חולה NS-07 מוצג. המיקום שבו נמדדו עוצמת האות לחישוב של שחזור דיסטרופין מצוינים עם ריבועים כחולים. יחס ספקטרין דיסטרופין שימש לחישוב כמות ה דיסטרופין בהשוואה לזה של השליטה הבריאה. כך, האות מהדיסטרופין פחות רקע חולק על ידי הסכום של שני isoforms ספקטרין (ארוך וקצר) פחות רקע (ראה שלב 8.6.5). היחס לשליטה בריאה נקבע ל-100%. כמות ה dystrophin לעומת השליטה הבריאה בחולה NS-07 לאחר הטיפול היה 9.1%. עם זאת, לא ניתן היה לחשב את האחוז עבור חולה NS-03 בשל להקה דיסטרופין חלשה, אשר דומה לאלה שהושגו עבור דגימות טיפול קודמות עבור שני החולים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig1.jpg"> איור 1: דיאגרמה סכמטית של מחסנית ההעברה עבור ניתוח כתם מערבי. הרכבה של מחסנית העברת כתם המערבי עם נייר סופג ספוג במאגר כתמים A בתחתית ואחריו נייר סופג ספוג מאגר סופג B, קרום PVDF, 3-8% Tris-אצטט ג'ל ועל גבי 2 ניירות סופגים ספוגים ב- C סופג סופג מוצג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig2.jpg"> איור 2: ציור סכמטי של אקסון דילוג של exon 53 בחולה עם מחיקה exon 45-52 בגן DMD. לדוגמה, חולה NS-03 בניסוי הקליני להסלמה במינון היה מחיקה זו. אם אקסון 53 יישמר, ה-MRNA יהיה מחוץ למסגרת מאז צומת exon-exon בין exon 44 ו 53 משבש את מסגרת הקריאה, גורם עצירה קודון ב exon 53. מסגרת הקריאה משוחזרת כאשר מדלגים על exon 53, ומופקת איזופורם קצר יותר של דיסטרופין. כדי לזהות exon 53-דילוג על-ידי RT-PCR, פריימרים ב exon 44 ו 54 משמשים כך PCR-מוצר בין מדלג ו- mRNA לא מדלג יכול בקלות להתגלות. FWD: פריימר קדימה, REV: פריימר הפוך, PMO: פוספורודיאמידט מורפולינו אוליגומר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig3.jpg"> איור 3: דילוג על יעילות עבור חולים NS-03 ו NS-07 מדגימות ביופסיה שריר קדמי השוקיאלי. a) תמונת ג'ל שנוצרה על ידי מערכת אלקטרופורזה A של דגימות RT-PCR של דגימות לא מטופלות ומטופלות מחולים NS-03 ו-NS-07. הלוח העליון מציג את NS-03 ואת הלוח התחתון NS-07 בשלושה רישיות. עבור NS-03, הלהקה שלא מדלגים עליה היא 422 bp, והלהקה מדלגת היא 212 bp. עבור NS-07, הלהקות הן 836 bp ו 624 bp, בהתאמה. ניתוח רצף הראה שרשור של exon 44 ו exon 54 עבור NS-03 ואקסון 47 כדי exon 54 עבור NS-07. ב)דילוג על יעילות לפני ואחרי הטיפול מוצג עבור חולים NS-03 ו NS-07, מחושב מתוך ריכוז הטוחנתן של שתי הלהקות המסופקות על ידי מערכת A כמו להקה מדלג / (מדלג הלהקה + הלהקה לא דילג) x 100. יעילות דילוג עבור NS-03 היה נמוך מאוד לאחר הטיפול; עבור NS-07, יעילות דילוג היה מעל 70%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig4.jpg"> איור 4: כימות חלבון של isoforms דיסטרופין לפני ואחרי exon דילוג על טיפול. a) כימות חלבון של isoforms דיסטרופין לפני ואחרי exon דילוג על טיפול. כתם מערבי של ביופסיה שרירים מן השוקיאליים הקדמי מחולים NS-03 ו NS-07 לפני ואחרי הטיפול ומשליטה בריאה בשלושה אנשים. Dystrophin ניתן לראות ב 427 kDa עבור שליטה בריאה ב 389 kDa עבור NS-07 לאחר הטיפול. לא ניתן היה לזהות דיסטרופין עבור אף אחד מהמטופלים לפני הטיפול, או שלא ניתן היה לזהות אף אחד מהם לאחר טיפול בחולה NS-03. האזור בקופסה השחורה מוצג באות 4b. משמאל בכל כתם מוצג הסמן. ב)כמות ההתרררות ששוחזרה לאחר הטיפול בחולה NS-07. שחזור Dystrophin חושב בהתבסס על העוצמות של הלהקות עבור דיסטרופין, רקע, ואת isoform ארוך וקצר של ספקטרין על פי הנוסחה: (dystrophin - רקע)/(ספקטרין L -רקע) + (ספקטרין S - רקע) שבו היחס לבקרה בריאה מוגדר ל 100%. העוצמה של כל להקה נמדדה בתוך הקופסאות הכחולות המוצגות בדמות. שיקום ה דיסטרופין עבור NS-07 היה 9.1% לאחר הטיפול. אות ה דיסטרופין היה חלש מדי מכדי למדוד את הדגימות הלא מטופלות. גדלי מרקר מוצגים בקילו-דלטון. Dys: Dystrophin, BG: רקע, SL: ספקטרין ארוך isoform, SS: ספקטרין קצר isoform, שלי: מיויסין סוג 1. גדלי מרקר מוצגים בקילו-דלטון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פתרון (פתרון</td>
			<td>נפח / תגובה (μl)</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>מים ללא תחנה (מסופקים)</td>
			<td>משתנה (משתנה</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>5X QIAGEN OneStep RT-PCR מאגר</td>
			<td>5.0</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP Mix (המכיל 10 מיליון מ"מ של כל dNTP)</td>
			<td>1.0</td>
			<td>400 μM של כל dNTP</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר קדמי (10 μM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.6 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר הפוך (10 μM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.6 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>QIAGEN צעד אחד RT-PCR אנזים לערבב</td>
			<td>1.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>מעכב RNase (אופציונלי)</td>
			<td>משתנה (משתנה</td>
			<td>5-10 יחידות/תגובה</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNA של תבנית</td>
			<td>50 ng</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>סה"כ</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: ריאגנטים RT-PCR. התרכובות הדרושות לתגובה אחת של RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פריימר (פרימר)</td>
			<td>רצף (20</td>
		</tr>
<tr>
<td>ת"א 44 00:00</td>
			<td>1.75 ק"מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>ת"א 35</td>
			<td>17.5.05, 1.75 מ', 3, 000 00:00:00,000 --&10:00,00</td>
		</tr>
<tr>
<td>48 אף 00:00:</td>
			<td>1.75 מ', ג'ורג'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54/55R</td>
			<td>5'-TCTCTCTCACTCACCCTT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54R (100)</td>
			<td>5'-GTGGACTTTCTACTACTCAT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: רשימת פריימר. רצפים עבור פריימרים המשמשים במחקר זה. פ: קדימה, ר: הפוך.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מחזור אחד</td>
			<td>שעתוק הפוך</td>
			<td>30 דקות</td>
			<td>50°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>מחזור אחד</td>
			<td>שלב הפעלה ראשוני של PCR</td>
			<td>15 דקות</td>
			<td>100°C</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">35 מחזורים</td>
			<td>פירוק (פירוק)</td>
			<td>1 דקות</td>
			<td>94 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>אנאלית (119)</td>
			<td>1 דקות</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>השלוחה (השל</td>
			<td>1 דקות</td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>מחזור אחד</td>
			<td>הארכה סופית</td>
			<td>7 דקות</td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>המתן</td>
			<td></td>
			<td>∞</td>
			<td>4°C</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: PCR מותן בשימוש. הצג תנאי PCR עבור תגובת RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פתרון (פתרון</td>
			<td>נפח / תגובה (μl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>מים ללא תחבולות</td>
			<td>משתנה (משתנה</td>
		</tr>
<tr>
<td>BigDye שליחות קטלנית 3.1 תגובה מוכנה לערבב</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר קדמי/פריימר הפוך (3.2 μM)</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNA של תבנית</td>
			<td>20 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>סה"כ</td>
			<td>20</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 4: ריאגנטים הנחוצים לתגובת ההתפתלה. השתמש בפרימר קדימה או הפוך בהתקנה, לא בשניהם בו-זמנית.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מחזור אחד</td>
			<td>1 דקות</td>
			<td>96 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">25 מחזורים</td>
			<td>10 שניות</td>
			<td>96 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 שניות</td>
			<td>50°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 דקות</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>המתן</td>
			<td>∞</td>
			<td>4°C</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 5: תנאי PCR עבור רצף סנגר.

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides at JoVE.com

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

כאן, אנו מציגים את האפיון המולקולרי של ביטוי דיסטרופין 38 באמצעות רצף סנגר, RT-PCR, וכתמים מערביים בניסוי הקליני.

אפיון Exon דילוג יעילות בדגימות החולה DMD בניסויים קליניים של אנטיסנס אוליגונוקליאוטידים

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה מתוקנת להכנת וטיפול ברקמת השריר בהגדרות פרה-קליניות ובניסויים קליניים, החשובה להשגת תוצאות אמינות בתחום ה-DMD. הטכניקות רלוונטיות עבור exon דילוג על נסיונות עבור DMD. והיתרון העיקרי הוא כי, הם מבוססים היטב לשחזור אם מתבצע באופן קולקטיבי.טכניקות אלה מתמקדות בעיקר דילוג exon ב DMD, אבל עם שינוי של פריימרים, אותן טכניקות ניתן ליישם על מחלות אחרות שטופלו עם טיפולים splicing. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי להשיג אקסון דילוג יעילות הן RNA וחלבון. כדי להכין מדגם לניתוח, ראשית לערבב כמויות שוות של מסטיק tragacanth ומים עד החניכיים הופך רך ודביק.טוענים תערובת זו לתוך 25 מזרקים מיליליטר ולוותר 0.5 עד סנטימטר אחד של מסטיק על דיסקי פקק בודדים. סמן את הדיסקים בצד הנגדי והצב מיכל איזופנטאן בחנקן נוזלי עד שחלק מהנוזל קופא. מניחים כל דגימה לתוך מסטיק tragacanth על הדיסקים עם ציר אורך של כל שריר בניצב לפקק.מניחים מסטיק סביב לתחתית של כל שריר כדי לעזור להחזיק את השריר במקום, ולהשתמש פינצטה להקפיא את הדגימות isopentane קר. מזיזים את הדגימות ברציפות למשך דקה אחת או עד להקפאה מוחלטת לפני הנחתן באופן זמני על קרח יבש. לאחר מכן, מניחים את הדגימות בבקבוקוני זכוכית לאחסון של 80 מעלות צלזיוס.כדי לקטע את רקמת השריר הקפואה לניתוח, הגדר קריוסטט לטמפרטורת עבודה של 25 מעלות צלזיוס, ולהעלות את בלוק השריר על המחזיק. לקצץ את בלוק הרקמה עד חלקים שטוחים מושגים. לקבלת PCR תעתיק הפוך וניתוח כתם מערבי, לקבל 10 פרוסות מיקרומטר עבה.לניתוח אימונוהיסטוכימי, השג שש עד שמונה פרוסות בעובי מיקרומטר, ולכתמת המטוקסילין ואאוסין, השג פרוסות בעובי 10 עד 12 מיקרומטר. לאחר הרכישה שלהם, למקם את החלקים פרוסים בשני צינורות מיליליטר. אחסן את הדגימות עבור PCR ורוקט מערבי ב 80 מעלות צלזיוס.כאן, מערכת אלקטרופורזה שבב, תמונות ג'ל של תגובות PCR תעתיק הפוך, ואת תוצאות רצף של הלהקה דילוג משני חולים לפני ואחרי הטיפול עם oligonucleotide antisense בניסוי שלב הסלמה מנה אחת מוצגים. שני המטופלים מטפחים מחיקות. כצפוי, לפני הטיפול, שני המטופלים לא הראו דילוג ורק להקה שלא דילגה יכולה להיות חזותית.לאחר 12 שבועות של טיפול, רצועה תחתונה ברורה דילגה היה חזותי עבור המטופל השני, עם זאת, זה עדיין היה קשה לזהות כל מוצר דילוג עבור המטופל הראשון. תוצאות רצף הראו שרשור של exons 47 ו 54 עבור החולה השני, ו exons, 44 ו 54 עבור החולה הראשון. כדי לחשב את אחוז הדילוגים, הריכוז הטוחן של הרצועה שדילגת עליה חולק על-ידי הרצועות שהמערכת דילגה עליהן והתהפך.כצפוי, לא זוהתה להקת דיסטרופין על ידי כתם מערבי לפני הטיפול. לאחר הטיפול זוהתה רצועה מהחולה השני עם משקל מולקולרי נמוך יותר בהשוואה לזה שנצפה בשליטה הבריאה. החולה הראשון, לעומת זאת, לא הראה רמות ניתנות לגילוי של דיסטרופין לאחר הטיפול.זה קריטי כדי לטפל ברקמת השריר כראוי, ולה מניח כל דגימה על מסטיק tragacanth באופן עקבי. ניתן לנתח את מקטעי הרקמה במספר דרכים שונות, כולל PCR מלאכותי, PCR דיגיטלי, כתם מערבי, אימונוהיסטוכימיה, ועם סוגים שונים של omics. טכניקות אלה ניתן להאיץ, הפיתוח, exon נוסף דילוג תרופות מיקוד exons שונים, והוא יכול להיות מיושם על הפיתוח של ויראלי מבוסס ושוב בעריכה עבור DMD.

Research

JoVE Journal

Medicine

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

משלוח שחרור איטי תרופות דרך Elvax 40W לרשתית העכברוש: ​​השלכות לטיפול במצבים כרוניים

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

ניתוח ביטוי מירנה ברקמות קליניות בסרטן הערמונית

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Multi-אקסון דילוג שימוש אנטיסנס קוקטייל של ניוון השרירים הצמוד X לכלבים

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

רצף עמוק משוחד של RNA וירוסי ממדגמים קליניים

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

אסטרטגיות דגימה ועיבוד של דגימות רקמה Biobank של מודלים ביו חזירי

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Collecting Hair Samples for Hair Cortisol Analysis in African Americans

איסוף דגימות שיער עבור בדיקת קורטיזול שיער אפריקאים אמריקאים

The hormone cortisol is typically assessed in saliva, serum, or urine samples. More recently, cortisol has been successfully extracted from hair, ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

הערכה של הכללה אקסון שנגזרות אחוי Oligonucleotides Antisense מיתוג ב SMA החולה Fibroblasts

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

כמותי [18F]-NAF-PET-MRI ניתוח להערכת מחזור עצם דינמי במטופל עם Facetogenic כאבי גב תחתון

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

גרימת ואפיון שלפוחית הזרע ב הבדיל תאים HepaRG

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

שימוש בביופסיה כימית להערכת איכות השתל

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...