Name: characterizing exon skipping efficiency in dmd patient samples in clinical trials of antisense oligonucleotides
Uploaded: 2020-05-07T13:00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides at JoVE.com

Siamo grati al dottor Takashi Saito, al dottor Tetsuya Nagata, al dottor Satoshi Masuda e al dottor Eri Takeshita per la discussione scientifica.

<ol>
	<li>Bushby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+Duchenne+muscular+dystrophy,+part+2:+implementation+of+multidisciplinary+care.">Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care.</a> Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51 (6), 919-928 (1987).</li><li>Mendell, J. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+studies+in+newborn+males+with+Duchenne+muscular+dystrophy+detected+by+neonatal+screening.">Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening.</a> Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).</li><li>Forrest, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+of+gene+deletions+that+cause+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophies.">Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies.</a> Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).</li><li>Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+spectrum+of+DMD+mutations+in+dystrophinopathy+patients:+application+of+modern+diagnostic+techniques+to+a+large+cohort.">Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort.</a> Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).</li><li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-frame+dystrophin+following+exon+51-skipping+improves+muscle+pathology+and+function+in+the+exon+52-deficient+mdx+mouse.">In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse.</a> Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).</li><li>Lu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+amounts+of+dystrophin+produced+by+skipping+the+mutated+exon+in+the+mdx+dystrophic+mouse.">Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse.</a> Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).</li><li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+systemic+morpholino+exon-skipping+in+Duchenne+dystrophy+dogs.">Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs.</a> Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).</li><li>Kesselheim, A. S., Avorn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approving+a+Problematic+Muscular+Dystrophy+Drug:+Implications+for+FDA+Policy.">Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).</li><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eteplirsen+for+the+treatment+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).</li><li>Komaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+the+antisense+oligonucleotide+NS-065/NCNP-01+for+skipping+of+exon+53+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy.">Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).</li><li>Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Droplet+PCR+for+the+Absolute+Quantification+of+Exon+Skipping+Induced+by+Antisense+Oligonucleotides+in+(Pre-)Clinical+Development+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> PLoS One. 11 (9), e0162467 (2016).</li><li>Takizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Duchenne+muscular+dystrophy+in+MYOD1-converted+urine-derived+cells+treated+with+3-deazaneplanocin+A+hydrochloride.">Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3807 (2019).</li></ol>

Le sperimentazioni cliniche di DMD hanno prodotto successi e fallimenti negli ultimi anni. Sia RT-PCR che western blotting sono tecniche comuni per valutare l'efficienza di salto generata dai composti che saltano l'esodi somministrati ai pazienti. Tuttavia, RT-PCR è stato segnalato per sopravvalutare l'efficienza saltando rispetto al digitale PCR15. Anche se questo è dovuto a una serie di motivi, è principalmente causato dall'amplificazione più efficiente dei frammenti saltati più piccoli durante i cicli PCR. Sembra che la RT-PCR utilizzata in questo studio clinico ha generato anche efficienze di salto più elevate rispetto all'espressione proteica stimata dal gonfiore occidentale. Secondo la FDA, questo è un modo più affidabile per quantificare il ripristino della distrofina12. Pertanto, occorre prestare attenzione nell'interpretare i risultati di salto RT-PCR; tuttavia i campioni possono ancora essere confrontati. I campioni che mostrano efficienze di salto più elevate basate sui risultati di RT-PCR comunemente esano livelli di espressione proteica più elevati nelle analisi delle macchie occidentali.
Poiché tutti i pazienti negli studi clinici DMD non hanno lo stesso modello di deleghe, può essere difficile progettare primer e sonde che siano adeguatamente specifiche per eseguire operazioni digitali o qPCR su tutti i campioni. Quindi, RT-PCR è ancora una buona alternativa per una prima valutazione dell'efficienza di salto. Prima dell'inizio della sperimentazione clinica di NS-065/NCNP-01, era noioso valutare l'efficienza di salto per ogni paziente in vitro poiché una biopsia muscolare o cutanea era obbligatoria per generare mioblasti specifici per il paziente. Tuttavia, abbiamo recentemente pubblicato una nuova tecnica per generare cellule specifiche di MYOD1(UDC) convertite in origine dal paziente come un nuovo modello di cellule muscolari DMD16. Pertanto, solo l'urina raccolta dal paziente è necessaria per generare i mioblasti, e non è necessaria alcuna procedura invasiva. Crediamo che questo metodo possa essere utilizzato per lo screening di diversi AON in cellule specifiche del paziente. Inoltre, diversi primer e sonde possono essere testati prima che il paziente inizi qualsiasi studio clinico. Questo può facilitare l'uso di qPCR o PCR digitale per eso ignorare la misurazione negli studi clinici DMD in futuro.
Per l'esecuzione dell'analisi delle macchie occidentali in questo studio clinico, è stato utilizzato un singolo anticorpo contro la distrofina, e solo un controllo sano è stato utilizzato come campione di riferimento. Pertanto, la specificità dell'anticorpo non è stata convalidata in modo appropriato. Questo, insieme al fatto che l'anticorpo riconosce solo il dominio C-terminale della distrofina, è una limitazione del protocollo. In futuro sono consigliati controlli e anticorpi più sani diretti contro diversi domini della molecola distrofina.
Qui, abbiamo riassunto i protocolli che sono stati utilizzati nel recente processo esplorativo iniziato da investigatori, primo in-umano di NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 è potenzialmente applicabile al 10,1% dei pazienti con DMD.

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia muscolare degenerativa che causa una progressiva perdita di massa muscolare, insufficienza respiratoria e cardiomiopatia, e porta alla morte prematura1. La malattia è causata dalla mancanza della grande proteina muscolare strutturale distrofina2. Le mutazioni nel gene DMD sul cromosoma X sono recessive e la malattia colpisce 1 su 3500-5000 maschiappena nati 3,4,5. Le mutazioni sono spesso grandi delezioni in una regione hotspot tra gli esoni 44 e 55 che portano ad un quadro di lettura distorto e a codoni di arresto prematuro, causando decadimento mediato da sciocchezze e una quasi totale mancanza di proteina distrofina6,7,8. Il telaio di lettura può essere corretto utilizzando oligonucleotidi antisenso (AON) che inducono l'esone saltando e ripristinando il telaio di lettura, ripristinando parzialmente l'espressione della distrofina e ritardando la progressione della malattia9,10,11. Il morpholino AON eteplirsen, che è stato recentemente approvato dalla Federal Drug Agency (FDA), induce saltando l'esone 51 e può ripristinare il telaio di lettura in pazienti con esone 52delezioni 12,13. Tuttavia, exon 53 saltando ripristina il telaio di lettura per i pazienti con esone 52 delezioni, e può potenzialmente trattare circa il 10% dei pazienti dmD14. Il farmaco morpholino AON NS-065/NCNP-01 ha dimostrato di indurre l'esone 53 saltando nelle cellule umane, e abbiamo recentemente somministrato NS-065/NCNP-01 a pazienti affetti da DMD in uno studio clinico di escalation della dose open-label di fase 1 (qui di seguito, indicato come "lo studio") (registrato come UMIN: 000010964 e ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. Lo studio ha mostrato un aumento dipendente dalla dose di esone 53 saltando sulla base di RT-PCR e livelli di proteine distrofina sulla base di gonfiore occidentale, e non sono stati osservati gravi eventi di farmaci avversio abbandoni 14.
In tutti gli studi clinici, l'analisi dei risultati è di fondamentale importanza. Per gli studi clinici DMD, è ancora in corso un dibattito sul metodo migliore per mostrare un beneficio terapeutico. I test clinici come il test di 6 minuti a piedi hanno alcuni inconvenienti. La caratterizzazione molecolare dell'espressione della distrofina può essere eseguita utilizzando diversi metodi, come RT-PCR, qPCR, digital-PCR, blotting occidentale e immunohistochimica. Tuttavia, l'entità del ripristino dell'espressione proteica necessaria per impartire un beneficio clinico rimane poco chiara. In questo articolo di metodi, descriviamo in dettaglio i metodi RT-PCR e western blotting utilizzati per determinare i livelli di salto e proteina esone, rispettivamente, nella fase 1 prova del farmaco AON saltando il farmaco NS-065/NCNP-0114.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Takara</td>
			<td>3407A</td>
			<td>marker solution for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35436-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>21418-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15-2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#215; Loading Buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose ME</td>
			<td>Iwai chemical</td>
			<td>50013R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A41046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>05808-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centri-Sep 96-Well Plates</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Blocking Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>2922498000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Automated Electrophoresis Station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007010</td>
			<td>Microchip electrophoresis system A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007107JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Priming Station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Vortex Station II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Thick Blot Filter Paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EzBlot</td>
			<td>Atto</td>
			<td>AE-1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vial</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>1880 SV20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>17045-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histofine Simple Stain MAX PO</td>
			<td>Nichirei</td>
			<td>424151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Clear Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>mlp9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus)</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>NCL-DYS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>NCL-SPEC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EA03785BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LA0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oriole Fluorescent Gel Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physcotron Handy micro-homogenizer</td>
			<td>MICROTEC</td>
			<td>NS-310E3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>556463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN OneStep RT-PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>210212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31606-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-dry transfer machine</td>
			<td>Bio Craft</td>
			<td>41-1293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td>for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35430-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth Gum</td>
			<td>Wako</td>
			<td>200-02245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA Buffer</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>316-90025</td>
			<td>for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35907-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing exon skipping efficiency in dmd patient samples in clinical trials of antisense oligonucleotides

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia muscolare degenerativa che causa una progressiva perdita di massa muscolare, che porta alla morte prematura. Le mutazioni spesso causano un telaio di lettura distorto e codoni prematuri, con conseguente quasi totale mancanza di proteine della distrofina. Il telaio di lettura può essere corretto utilizzando oligonucleotidi antisenso (AON) che inducono il salto esone. Il morpholino AON viltolarsen (nome in codice: NS-065/NCNP-01) ha dimostrato di indurre exon 53 saltando, ripristinando il telaio di lettura per i pazienti con esone 52 delezioni. Recentemente abbiamo somministrato NS-065/NCNP-01 per via endovenosa a pazienti affetti da DMD in uno studio esplorativo iniziato da uno sperimentatore di NS-065/NCNP-01. In questo articolo di metodi, presentiamo la caratterizzazione molecolare dell'espressione della distrofina usando il sequenziamento di Sanger, RT-PCR e il gonfiore occidentale nello studio clinico. La caratterizzazione dell'espressione della distrofina è stata fondamentale nello studio per mostrare l'efficacia poiché non sono stati eseguiti test di esito funzionale.

Per utilizzare RT-PCR per rilevare il salto exon, i primer su entrambi i lati dell'esone che verrà saltato sono stati progettati e valutati per produrre solo bande specifiche (vedere la Figura 2 per un diagramma schematico di salto e posizione primer). I primer dovrebbero generare prodotti che possono essere facilmente distinti per dimensioni su un sistema MCE o elettroforesi gel agarose normale se MCE non è disponibile. Figura 3a mostraun sistema MCE Immagini gel di reazioni RT-PCR e i risultati del sequenziamento della banda saltata dai pazienti NS-03 e NS-07 prima e dopo il trattamento con NS-065/NCNP-01 nello studio di fase 1 di dose-escalation. NS-03 e NS-07 porto eliminazioni che si estendono exons 45-52 e 48-52, rispettivamente. NS-03 ha ricevuto 5 mg/kg e NS-07 20 mg/kg di NS-065/NCNP-01 settimanale per 12 settimane. Come previsto prima del trattamento, entrambi i pazienti non hanno mostrato alcun salto, e solo una banda non saltata potrebbe essere visualizzata. Dopo 12 settimane di trattamento, una banda inferiore saltata è stata vista per NS-07. Tuttavia, era ancora difficile rilevare qualsiasi prodotto saltato per il paziente NS-03. I risultati del sequenziamento hanno mostrato una concatenazione di esoni 47 e 54 per NS-07, così come exons 44 e 54 per NS-03. Secondo la sequenza, questi potrebbero teoricamente produrre un isoforme distrofina funzionale ma accorciato. Per calcolare la percentuale di salto mostrata nella figura 3b, la concentrazione molare per la banda saltata è stata divisa per la banda saltata e non saltata. Per il paziente NS-07, la percentuale dopo il trattamento era del 72%, ed era del 3,4% per NS-03. I dati di western blot (in triplicate) dei pazienti NS-03, NS-07 e un controllo sano sono illustrati nella Figura 4a. Previsto, non è stata rilevata alcuna banda distrofina prima del trattamento. Dopo il trattamento è stata rilevata una banda del paziente NS-07 con un peso molecolare inferiore rispetto al controllo sano (la distrofina di tipo selvaggio ha un peso molecolare di 427 kDa e la distrofina NS-07 ha un peso molecolare di 389 kDa). A causa della cancellazione esone e saltare, l'isoforme distrofina dal paziente NS-07 mancava di diversi esoni, e ci si aspettava di avere un peso molecolare inferiore. Il paziente NS-03 non ha mostrato livelli rilevabili di distrofina dopo il trattamento. Nella Figura 4b, viene mostrata la quantità di distrofina rispetto a un controllo sano per il paziente NS-07. La posizione in cui sono state misurate le intensità del segnale per il calcolo del ripristino della distrofina è indicata con quadrati blu. Il rapporto di spettro della distrofina è stato utilizzato per calcolare la quantità di distrofina rispetto a quella del controllo sano. A questo scopo, il segnale dalla distrofina meno sfondo è stato diviso per la somma dei due isoformi spectrin (lungo e corto) meno sfondo (vedi passo 8.6.5). Il rapporto per il controllo sano è stato impostato al 100%. La quantità di distrofina rispetto al controllo sano nel paziente NS-07 dopo il trattamento era del 9,1%. Tuttavia, la percentuale non poteva essere calcolata per il paziente NS-03 a causa di una banda distrofina debole, che simile a quelle ottenute per i campioni di trattamento precedenti per entrambi i pazienti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig1.jpg"> Figura 1: diagramma schematico dello stack di trasferimento per l'analisi delle macchie occidentali. Assemblaggio della pila di trasferimento della macchia occidentale con carta assorbente imbevuta di tampone A nella parte inferiore seguita da carta assorbente imbevuta di tampone B, membrana PVDF, il 3-8% Tris-Acetate Gel e sulla parte superiore 2 carte blotting imbevute di tampone blotting C è mostrato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig2.jpg"> Figura 2: Disegno schematico di exon saltando l'esone 53 in un paziente con esone 45-52 delezione nel gene DMD. Per esempio, paziente NS-03 nello studio clinico dose-escalation ha avuto questa delezione. Se l'esone 53 viene mantenuto, l'mRNA sarà fuori dal telaio poiché la giunzione exon-exon tra exon 44 e 53 interrompe il telaio di lettura, causando un codon stop in exon 53. Il telaio di lettura viene ripristinato quando l'esone 53 viene saltato e viene prodotta un isoforma più corta di distrofina. Per rilevare l'esone 53-skipping da RT-PCR, vengono utilizzati primer in exon 44 e 54 in modo che il prodotto PCR tra mRNA saltato e non saltato può essere facilmente rilevato. FWD: primer in avanti, REV: primer inverso, PMO: fosforodiamidate morpholino oligomer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig3.jpg"> Figura 3: Saltare l'efficienza per i pazienti NS-03 e NS-07 da campioni di biopsia muscolare anteriore tibialis. a) Immagine Gel generata dal sistema di elettroforesi A di campioni RT-PCR di campioni non trattati e trattati da pazienti NS-03 e NS-07. Il pannello superiore mostra NS-03 e il pannello inferiore NS-07 in triplicete. Per NS-03, la banda non saltata è 422 bp e la banda saltata è 212 bp. Per NS-07, le bande sono rispettivamente 836 bp e 624 bp. L'analisi della sequenza ha mostrato una concatenazione di exon 44 ed exon 54 per NS-03 ed exon 47 a exon 54 per NS-07. b) L'efficienza di salto prima e dopo il trattamento è indicata per i pazienti NS-03 e NS-07, calcolata in base alla concentrazione molare delle due bande fornite dal sistema A come banda saltata/(banda saltata e banda non saltata) x 100. L'efficienza di salto per NS-03 era molto bassa dopo il trattamento; per NS-07, l'efficienza di salto è stata di oltre il 70%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig4.jpg"> Figura 4: Quantificazione delle proteine delle isoformi della distrofina prima e dopo la terapia di salto eso. a) Quantificazione proteica delle isoformi della distrofina prima e dopo la terapia di salto dell'esone. Macchia occidentale di biopsia muscolare da tibialis anteriore da pazienti NS-03 e NS-07 prima e dopo il trattamento e dal controllo sano in triplicato. Dystrophin può essere visto a 427 kDa per il controllo sano e a 389 kDa per NS-07 dopo il trattamento. Nessun distrofina potrebbe essere rilevata per entrambi i pazienti prima del trattamento, o nessuno dei due potrebbe essere rilevato dopo il trattamento per il paziente NS-03. L'area nella casella nera è illustrata nella figura 4b. A sinistra in ogni macchia viene mostrato il marcatore. b) La quantità di distrofina ripristinata dopo il trattamento per il paziente NS-07. Il restauro della distrofina è stato calcolato in base all'intensità delle bande per la distrofina, lo sfondo e l'isoforma lunga e corta di spectrin secondo la formula: (distrofina - sfondo)/(spectrin L -background) - (spectrin S - background) dove il rapporto per il controllo sano è impostato al 100%. L'intensità di ogni banda è stata misurata all'interno delle caselle blu mostrate nella figura. Il ripristino della distrofina per NS-07 è stato del 9,1% dopo il trattamento. Il segnale della distrofina era troppo debole per essere misurata nei campioni non trattati. Le dimensioni dei marcatori sono mostrate in kilodaltons. Dismi: Distrofina, BG: sfondo, SL: Spectrin isoform lungo, SS: Spectrin breve isoform, Mio: Myosin tipo 1. Le dimensioni dei marcatori sono mostrate in kilodaltons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Soluzione</td>
			<td>Volume/Reazione (l)</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua senza RNase (fornita)</td>
			<td>Variabile</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>5x Buffer QIAGEN OneStep RT-PCR</td>
			<td>5.0</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP Mix (contenente 10 mM per ogni dNTP)</td>
			<td>1.0</td>
			<td>400 M di ogni dNTP</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer in avanti (10 M)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0,6 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer inverso (10 M)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0,6 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix</td>
			<td>1.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inibitore RNase (opzionale)</td>
			<td>Variabile</td>
			<td>5-10 unità/reazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>Modello RNA</td>
			<td>50 ng</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Totale</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: reagenti RT-PCR. I composti necessari per una reazione del RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer</td>
			<td>Sequenza</td>
		</tr>
<tr>
<td>44F</td>
			<td>5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>46F</td>
			<td>5'-AACCTGGAAAAGAGCAGCAA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>48F</td>
			<td>5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG'3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54/55R</td>
			<td>5'-TCTCCCTCACTCACCCTTTT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54R</td>
			<td>5'-GTGGACTTTTTTTTTATCAT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Elenco primer. Sequenze per i primer utilizzati in questo studio. F: Avanti, R: Inverti.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 ciclo</td>
			<td>Trascrizione inversa</td>
			<td>30 min</td>
			<td>50 gradi centigradi</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ciclo</td>
			<td>Fase di attivazione PCR iniziale</td>
			<td>15 min</td>
			<td>95 gradi centigradi</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">35 cicli</td>
			<td>Denaturazione</td>
			<td>1 min</td>
			<td>94 gradi centigradi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ricottura</td>
			<td>1 min</td>
			<td>60 gradi centigradi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Estensione</td>
			<td>1 min</td>
			<td>72 gradi centigradi</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ciclo</td>
			<td>Estensione finale</td>
			<td>7 min</td>
			<td>72 gradi centigradi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tenere</td>
			<td></td>
			<td>∞</td>
			<td>4 gradi centigradi</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: PCR condizionato. Mostra le condizioni PCR per la reazione RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Soluzione</td>
			<td>Volume/Reazione (l)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua senza RNase</td>
			<td>Variabile</td>
		</tr>
<tr>
<td>BigDye Terminator 3.1 Pronto Reazione Mix</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer in avanti/invertitore (3,2 M)</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Modello RNA</td>
			<td>20 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totale</td>
			<td>20</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4: Reagenti necessari per la reazione di sequenziamento. Utilizzare Forward o Reverse primer nella configurazione, non entrambi contemporaneamente.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 ciclo</td>
			<td>1 min</td>
			<td>96 gradi centigradi</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">25 cicli</td>
			<td>10 s</td>
			<td>96 gradi centigradi</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 s</td>
			<td>50 gradi centigradi</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 min</td>
			<td>60 gradi centigradi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tenere</td>
			<td>∞</td>
			<td>4 gradi centigradi</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 5: condizioni PCR per il sequenziamento Diger.

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Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

Qui, presentiamo la caratterizzazione molecolare dell'espressione distrofina 38 usando il sequenziamento Sanger, RT-PCR e il gonfiore occidentale nello studio clinico.

Caratterizzare l'efficienza di salto di esone nei campioni di pazienti DMD negli studi clinici sugli oligonucleotidi antisenso

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Questo protocollo fornisce una metodologia standardizzata per la preparazione e la gestione del tessuto muscolare in contesti precli clinici e studi clinici, che è importante per ottenere risultati affidabili all'interno del campo DMD. Le tecniche sono rilevanti per i provini di salto esonero per DMD. E il vantaggio principale è che, sono ben consolidati e riproducibili se eseguiti collettivamente.Queste tecniche si concentrano principalmente sul salto dell'esone in DMD, ma con un cambio di primer, le stesse tecniche possono essere applicate ad altre malattie trattate con terapie di splicing. Questi metodi possono essere utilizzati per ottenere l'efficienza di esone saltando sia l'RNA che le proteine. Per preparare un campione per l'analisi, mescolare prima volumi uguali di gomma tragacante e acqua fino a quando la gomma diventa morbida e appiccicosa.Caricare questa miscela in siringhe da 25 millilitri e distribuire da 0,5 a un centimetro di gomma su singoli dischi di sughero. Etichettare i dischi sul lato opposto e posizionare un contenitore di isopentane in azoto liquido fino a quando parte del liquido non si congela. Posizionare ogni campione nella gomma tragacante sui dischi con un asse longitudinale di ciascun muscolo perpendicolare al sughero.Posizionare la gomma intorno al fondo di ogni muscolo per aiutare a tenere il muscolo in posizione e utilizzare una pinzetta per congelare gli esemplari nell'isopentane freddo. Spostare i campioni continuamente per un minuto o fino a completa congelamento prima di posizionarli temporaneamente sul ghiaccio secco. Quindi, posizionare gli esemplari in fiale di vetro per una conservazione di 80 gradi Celsius.Per sessare il tessuto muscolare congelato per l'analisi, impostare un criostato su una temperatura di lavoro di 25 gradi Celsius e montare il blocco muscolare sul supporto. Tagliare il blocco tissutale fino a ottenere sezioni piatte. Per l'analisi reverse transcriptase PCR e Western blot, ottenere fette spesse 10 micrometri.Per l'analisi immunoistochimica, ottenere fette spesse da sei a otto micrometri e, per la colorazione dell'ematossilina e dell'eosina, ottenere fette spesse da 10 a 12 micrometri. Dopo la loro acquisizione, posizionare le sezioni affettate in due tubi millilitro. Conservare i campioni per PCR e western blotting a 80 gradi Celsius.Qui vengono mostrati il sistema di elettroforesi a microchip, un gel immagini di reazioni PCR in transcriptasi inversa e i risultati di sequenziamento della banda saltata da due pazienti prima e dopo il trattamento con un oligonucleotide antisense in uno studio di fase uno di escalation della dose. Entrambi i pazienti ospitano derelezioni. Come previsto, prima del trattamento, entrambi i pazienti non hanno mostrato alcun salto e solo una banda non saltata poteva essere visualizzato.Dopo 12 settimane di trattamento, è stata visualizzata una chiara fascia inferiore saltata per il secondo paziente, tuttavia, era ancora difficile rilevare qualsiasi prodotto saltato per il primo paziente. I risultati del sequenziamento hanno mostrato una concatenazione di esoni 47 e 54 per il secondo paziente, ed esoni, 44 e 54 per il primo paziente. Per calcolare la percentuale saltata, la concentrazione molare per la banda saltata è stata divisa dalle bande saltate e non saltate.Come previsto, nessuna banda di distrofica è stata rilevata dalla macchia occidentale prima del trattamento. Dopo il trattamento, è stata rilevata una banda dal secondo paziente con un peso molecolare inferiore rispetto a quella osservata nel controllo sano. Il primo paziente, tuttavia, non ha mostrato livelli rilevabili di distrofia dopo il trattamento.È fondamentale gestire correttamente il tessuto muscolare e posizionare ogni campione sulla gomma tragacante in modo coerente. Le sezioni tissutali possono essere analizzate in diversi modi, tra cui da artificiale a PCR, PCR digitale, western blot, immunoistochimica e con diversi tipi di omica. Queste tecniche possono essere accelerate, lo sviluppo, ulteriori farmaci che saltano l'esone prendendo di mira diversi esoni e possono essere applicate allo sviluppo di base virale e di nuovo nell'editing per DMD.

Research

JoVE Journal

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