Name: characterizing exon skipping efficiency in dmd patient samples in clinical trials of antisense oligonucleotides
Uploaded: 2020-05-07T13:00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides at JoVE.com

先生、永田哲也博士、増田聡氏、武下隆博士の科学的な議論に感謝しています。

<ol>
	<li>Bushby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+Duchenne+muscular+dystrophy,+part+2:+implementation+of+multidisciplinary+care.">Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care.</a> Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51 (6), 919-928 (1987).</li><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li><li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Greenberg, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+studies+in+newborn+males+with+Duchenne+muscular+dystrophy+detected+by+neonatal+screening.">Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening.</a> Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).</li><li>Forrest, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+of+gene+deletions+that+cause+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophies.">Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies.</a> Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).</li><li>Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+explanation+for+the+phenotypic+differences+between+patients+bearing+partial+deletions+of+the+DMD+locus.">An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus.</a> Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).</li><li>Flanigan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+spectrum+of+DMD+mutations+in+dystrophinopathy+patients:+application+of+modern+diagnostic+techniques+to+a+large+cohort.">Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort.</a> Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).</li><li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-frame+dystrophin+following+exon+51-skipping+improves+muscle+pathology+and+function+in+the+exon+52-deficient+mdx+mouse.">In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse.</a> Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).</li><li>Lu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+amounts+of+dystrophin+produced+by+skipping+the+mutated+exon+in+the+mdx+dystrophic+mouse.">Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse.</a> Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).</li><li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+systemic+morpholino+exon-skipping+in+Duchenne+dystrophy+dogs.">Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs.</a> Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).</li><li>Kesselheim, A. S., Avorn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approving+a+Problematic+Muscular+Dystrophy+Drug:+Implications+for+FDA+Policy.">Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).</li><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eteplirsen+for+the+treatment+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).</li><li>Komaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+the+antisense+oligonucleotide+NS-065/NCNP-01+for+skipping+of+exon+53+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy.">Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).</li><li>Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Droplet+PCR+for+the+Absolute+Quantification+of+Exon+Skipping+Induced+by+Antisense+Oligonucleotides+in+(Pre-)Clinical+Development+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> PLoS One. 11 (9), e0162467 (2016).</li><li>Takizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Duchenne+muscular+dystrophy+in+MYOD1-converted+urine-derived+cells+treated+with+3-deazaneplanocin+A+hydrochloride.">Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3807 (2019).</li></ol>

DMDの臨床試験は、ここ数年で成功と失敗の両方を生み出しました。RT-PCRおよびウェスタンブロッティングは、患者に投与されたエキソンスキップ化合物によって生成されるスキップ効率を評価するための一般的な技術である。しかし、RT-PCRは、デジタルPCR15と比較してスキップ効率を過大評価することが報告されている。これはいくつかの理由によるものですが、主にPCRサイクル中にスキップされる小さな断片のより効率的な増幅によって引き起こされます。この臨床試験で使用されたRT-PCRはまた、ウェスタンブロッティングによって推定されるタンパク質発現と比較して、より高いスキップ効率を生み出したようです。FDAによると、これはジストロフィンの修復12を定量化するためのより信頼性の高い方法です。したがって、RT-PCR スキップ結果を解釈する際には注意が必要です。ただし、サンプルは引き続き比較できます。RT-PCR 結果に基づいてより高いスキップ効率を示すサンプルは、一般的にウェスタンブロット分析でより高いタンパク質発現レベルを高くします。
DMD臨床試験のすべての患者は同じ欠失パターンを有していないので、すべてのサンプルに対してデジタルまたはqPCRを行うために適切に特異的なプライマーおよびプローブを設計することは困難である可能性がある。したがって、RT-PCR は、スキップ効率の最初の評価にはまだ良い代替手段です。NS-065/NCNP-01の臨床試験が開始される前は、筋肉または皮膚生検のいずれかが患者固有の筋芽細胞を生成することが必須であったため、インビトロの各患者のスキップ効率を評価するのは面倒でした。しかし、最近では、患者特異的なMYOD1変換された尿由来細胞(UDC)を新規DMD筋細胞モデル16として生成する新しい技術を発表した。したがって、患者から採取された尿のみが筋芽細胞を生成するために必要であり、侵襲的処置は必要ない。この方法は、患者固有の細胞内の異なるAnANをスクリーニングするために使用できると考えています。さらに、患者が臨床試験を開始する前に、異なるプライマーおよびプローブをテストすることができます。これにより、将来のDMD臨床試験でのエキソンスキップ測定にqPCRまたはデジタルPCRの使用を容易にすることができます。
この臨床試験でウェスタンブロット分析を行う場合、ジストロフィンに対する抗体を1つ使用し、健常な対照を1つだけ基準試料として使用した。したがって、抗体の特異性は適切に検証されなかった。これは、抗体がジストロフィンのC末端ドメインのみを認識するという事実と共に、プロトコルの限界である。ジストロフィン分子の異なるドメインに対して向けられたより健康的なコントロールおよび抗体は、将来的に推奨される。
ここでは、NS-065/NCNP-01の最近の探索的調査員開始、初めてのヒト試験で使用されたプロトコルを要約した。NS-065/NCNP-01は、DMD患者の10.1%に適用される可能性があります。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、筋肉量の進行性喪失、呼吸不全、心筋症を引き起こす変性筋疾患であり、早期死亡につながる1。この疾患は、大きな構造筋タンパク質ジストロフィン2の不足によって引き起こされる。X染色体上のDMD遺伝子の変異は劣性であり、この疾患は3500-5000人の新生男性33、4、54,5の1に影響を及ぼす。突然変異は、しばしば、歪んだ読み取りフレームと早期停止コドンにつながるエキソン44と55の間のホットスポット領域で大きな欠失であり、ナンセンス媒介性崩壊およびジストロフィンタンパク質66、7、87,8のほぼ全量欠乏を引き起こす。この読み取り枠は、エキソンスキップを誘導し、リーディングフレームを復元するアンチセンスオリゴヌクレオチド(AnONs)を用いて補正することができ、ジストロフィン発現を部分的に復元し、疾患進行を遅延させる9、10、11。10,11最近連邦医薬品庁(FDA)によって承認されたモルフォリノAONエテプリルセンは、エキソン51のスキップを誘発し、エキソン52欠失12、13,13を有する患者における読み取りフレームを復元することができる。しかしながら、exon 53スキップは、エクソン52欠失を有する患者に対する読み取りフレームを復元し、DMD患者14の約10%を治療できる可能性がある。モルフォリノAON薬NS-065/NCNP-01は、ヒト細胞におけるエキソン53スキップを誘導することが示されている、 そして最近、第1相オープンラベル用量エスカレーション臨床試験(以下「研究」と呼ばれる)でDMD患者にNS-065/NCNP-01を投与した(以下、"研究"と呼ばれる)(UMIN:000010964とClinicalTrials.govとして登録:NCT02081625)14。14この研究は、ウェスタンブロッティングに基づくRT-PCRおよびジストロフィンタンパク質レベルに基づくエキソン53スキップの用量依存的増加を示し、重篤な有害薬物事象または中退は14であった。
すべての臨床試験において、結果の分析は最も重要です。DMD臨床試験では、治療上の利点を示す最良の方法に関する議論がまだ進行中です。6分間の歩行テストなどの臨床検査には一定の欠点があります。ジストロフィン発現の分子特性は、RT-PCR、qPCR、デジタルPCR、ウェスタンブロッティング、免疫検査などのいくつかの方法を用いて行うことができる。しかしながら、臨床的利益を与えるために必要なタンパク質発現回復の程度は不明のままである。本方法の記事では、エキソンスキップおよびタンパク質レベルをそれぞれ決定するために用いられるRT-PCRおよびウェスタンブロッティング法について、AONスキップ薬NS-065/NCNP-0114の第1相試験で詳細に説明する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Takara</td>
			<td>3407A</td>
			<td>marker solution for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35436-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>21418-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15-2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#215; Loading Buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose ME</td>
			<td>Iwai chemical</td>
			<td>50013R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A41046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>05808-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centri-Sep 96-Well Plates</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Blocking Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>2922498000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Automated Electrophoresis Station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007010</td>
			<td>Microchip electrophoresis system A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007107JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Priming Station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Vortex Station II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Thick Blot Filter Paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EzBlot</td>
			<td>Atto</td>
			<td>AE-1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vial</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>1880 SV20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>17045-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histofine Simple Stain MAX PO</td>
			<td>Nichirei</td>
			<td>424151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Clear Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>mlp9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus)</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>NCL-DYS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>NCL-SPEC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EA03785BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LA0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oriole Fluorescent Gel Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physcotron Handy micro-homogenizer</td>
			<td>MICROTEC</td>
			<td>NS-310E3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>556463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN OneStep RT-PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>210212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31606-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-dry transfer machine</td>
			<td>Bio Craft</td>
			<td>41-1293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td>for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35430-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth Gum</td>
			<td>Wako</td>
			<td>200-02245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA Buffer</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>316-90025</td>
			<td>for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35907-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing exon skipping efficiency in dmd patient samples in clinical trials of antisense oligonucleotides

デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、筋肉量の進行性喪失を引き起こす変性筋疾患であり、早期死亡につながる。突然変異はしばしば歪んだ読書フレームおよび早期停止コドンを引き起こし、その結果、ジストロフィンタンパク質のほぼ完全な欠如をもたらす。リーディングフレームは、エキソンスキップを誘発するアンチセンスオリゴヌクレオチド(AnONs)を使用して補正することができる。モルフォリノAONビラルセン(コード名:NS-065/NCNP-01)は、エキソン52欠失患者の読み取りフレームを復元し、エキソン53スキップを誘発することが示されている。我々は最近、探索的研究者開始、NS-065/NCNP-01の最初のヒト試験でDMD患者にNS-065/NCNP-01を静脈内投与した。本方法の記事では、サンガーシーケンシング、RT-PCR、ウェスタンブロッティングを用いたジストロフィン発現の分子特性を臨床試験で紹介する。ジストロフィン発現の特徴付けは、機能性結果試験が行われなかったので有効性を示す研究において基本的なものであった。

RT-PCR を使用してエキソンスキップを検出するには、スキップされるエキソンの両側のプライマーが設計され、特定のバンドのみが得られるように評価されました (エキサのスキップとプライマー位置の概略図については図 2を参照)。プライマーは、MCEシステム上のサイズまたは通常のアガロースゲル電気泳動で容易に識別できる製品を生成する必要があります。図3は、用量エスカレーションフェーズ1試験におけるNS-065/NCNP-01による治療前後の患者NS-03およびNS-07からのスキップされたバンドのRT-PCR反応およびスキップされたバンドのシーケンシング結果のMCE系Aゲル画像を示す。NS-03およびNS-07の港の削除は、それぞれ45-52および48-52に及ぶ。NS-03は5mg /kgとNS-07 20 mg/kgを毎週12週間受け取りました。治療前に予想されるように、両方の患者はスキップを示さなかったし、唯一のスキップされていないバンドを視覚化することができた。12週間の治療の後、明確にスキップされた下のバンドをNS-07のために視覚化した。しかし、患者NS-03のスキップされた製品を検出することは依然として困難でした。シーケンシングの結果は、NS-07のエキソン47と54、NS-03のエキソン44と54の連結を示した。配列によると、これらは理論的には機能的であるが短縮されたジストロフィンアイソフォームを生成することができる。図 3bに示すスキップ率を計算するために、スキップされたバンドのモル濃度をスキップバンドとスキップ解除されたバンドで割った値です。患者NS-07の場合、治療後の割合は72%、NS-03では3.4%であった。患者NS-03、NS-07、および健康なコントロールからのウェスタンブロットデータ(三重化)を図4に示します。予想通り、治療前にジストロフィンバンドは検出されなかった。治療後、患者NS-07からのバンドは、健康なコントロールと比較して低分子量で検出された(野生型ジストロフィンは427kDaの分子量を有し、NS-07ジストロフィンは389kDaの分子量を有する)。エキサ欠失とスキップのため、患者NS-07からのジストロフィンアイソフォームにはエキソンがいくつか欠け、分子量が低いと予想された。患者NS-03は治療後にジストロフィンの検出可能なレベルを示さなかった。図4bbでは、患者NS-07に対する健常制御と比較したジストロフィンの量が示されている。ジストロフィン復元の計算のために信号強度を測定した場所は、青い四角形で示されています。ジストロフィンスペクトリン比を用いて、健常コントロールのそれと比較してジストロフィンの量を計算した。この点を、ジストロフィンから背景を引いた信号を、2つのスペクトルアイソフォーム(長い、短い)から背景を引いたものの和で割った(ステップ8.6.5を参照)。健康コントロールの比率は100%に設定した。治療後の患者NS-07における健康なコントロールと比較したジストロフィンの量は9.1%であった。しかし、両患者の前治療サンプルで得られたものと同様の弱いジストロフィンバンドのために患者NS-03の割合を計算することができなかった。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig1.jpg"> 図1:ウェスタンブロット解析用の転送スタックの概略図 下にブロッティングバッファーAに浸したブロッティング紙を用いたウェスタンブロット転写スタックの組み立て、続いてブロッティングバッファB、PVDF膜に浸したブロッティング紙、3-8%トリス酢酸ゲル及び上の2のブロッティングペーパーをブロッティングバッファCに浸した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig2.jpg"> 図 2:DMD 遺伝子におけるエキソン45-52欠失を有する患者におけるエキソン53のエキソンスキップの模式図。 例えば、用量エスカレーション臨床試験における患者NS-03は、この欠失を持っていた。エキソン53が保持されている場合、エキソン44と53の間のエキソン-エキソン接合が読み取りフレームを破壊し、エキソン53でコドンを停止させるので、mRNAはフレームから外れる。この読み取り枠は、エキソン53がスキップされると復元され、ジストロフィンの短いアイソフォームが生成される。RT-PCRによるエキソン53スキップを検出するために、スキップされたmRNAとスキップされていないmRNAの間のPCR産物を容易に検出できるように、エキソン44および54のプライマーが使用される。FWD: フォワードプライマー, REV: リバースプライマー, PMO: ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig3.jpg"> 図3:脛表筋前筋生検サンプルからの患者NS-03およびNS-07の効率をスキップする。a)患者NS-03およびNS-07からの未治療および治療されたサンプルのRT-PCRサンプルの電気泳動システムAによって生成されたゲル画像。上部パネルには、NS-03と下部パネルNS-07が三重に表示されます。NS-03 の場合、スキップされないバンドは 422 bp、スキップされたバンドは 212 bp です。NS-07の場合、バンドはそれぞれ836 bpと624 bpです。配列解析では、NS-03に対するエキソン44とエキソン54と、NS-07のエキソン47とエキソン44の連結を示した。b)治療前後のスキップ効率が患者NS-03およびNS-07に対して示され、スキップされたバンド/(スキップされたバンド+スキップされていないバンド)x 100としてシステムAが提供する2つのバンドのモル濃度から計算される。NS-03のスキップ効率は、治療後に非常に低く、非常に低かった。NS-07では、スキップ効率は70%を超えました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig4.jpg"> 図4:エキソンスキップ療法の前後のジストロフィンアイソフォームのタンパク質定量化a) エキソンスキップ療法の前後のジストロフィンアイソフォームのタンパク質定量化治療前後の患者NS-03およびNS-07の脛表症前部からの筋肉生検のウェスタンブロットおよび三重における健康なコントロールからの。ジストロフィンは、健康なコントロールのために427 kDaで、治療後のNS-07のために389 kDaで見ることができます。治療前のいずれの患者にもジストロフィンは検出できなかったか、患者NS-03の治療後も検出できなかった。黒いボックスの領域を図 4bに示します。各ブロットの左にマーカーが表示されます。b)患者NS-07の治療後に回復したジストロフィンの量。ジストロフィン復元は、ジストロフィンのバンドの強度、背景、およびスペクトリンの長くて短いアイソフォームの強度に基づいて計算された: (ジストロフィン - 背景)/(スペクトリンL -バックグラウンド)+(スペクトルS - バックグラウンド)健康コントロールの比率が100%に設定されています。各バンドの強度は、図に示す青色のボックス内で測定した。NS-07のジストロフィン修復は、治療後9.1%であった。ジストロフィンシグナルは、未処理のサンプルで測定するには弱すぎました。マーカーのサイズはキロダルトンで示されています。Dys:ジストロフィン、BG:背景、SL:スペクトリン長いアイソフォーム、SS:スペクターリン短いアイソフォーム、私:ミオシンタイプ1。マーカーのサイズはキロダルトンで示されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ソリューション</td>
			<td>ボリューム/リアクション(μl)</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNaseフリーウォーター(提供)</td>
			<td>変数</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>5x QIAGEN ワンステップ RT-PCR バッファー</td>
			<td>5.0</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP ミックス (各 dNTP の 10 mM を含む)</td>
			<td>1.0</td>
			<td>各 dNTP の 400 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>フォワードプライマー(10 μM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.6 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>リバースプライマー(10 μM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.6 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>QIAGEN ワンステップ RT-PCR 酵素ミックス</td>
			<td>1.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase阻害剤(オプション)</td>
			<td>変数</td>
			<td>5~10単位/反応</td>
		</tr>
<tr>
<td>テンプレート RNA</td>
			<td>50 ng</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>合計</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表1:RT-PCR試薬。 RT-PCRの1つの反応に必要な化合物。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>プライマー</td>
			<td>シーケンス</td>
		</tr>
<tr>
<td>44F</td>
			<td>5'-CCTGAGAATTGGGAATGC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>46F</td>
			<td>5'-アアッケガーアガガガッカガア-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>48F</td>
			<td>5'-CCAAAGAAGGACCATTGACG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54/55R</td>
			<td>5'-TCTCGCTCTCACTCACCCTTTT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54R</td>
			<td>5'-GTGGACTTTCTGGATCAT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>表2: プライマーリスト 本研究で使用されるプライマーのシーケンス。F: 前方、R: 逆。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1サイクル</td>
			<td>逆転写</td>
			<td>30分</td>
			<td>50°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1サイクル</td>
			<td>初期 PCR 活性化ステップ</td>
			<td>15分</td>
			<td>95°C</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">35サイクル</td>
			<td>変性</td>
			<td>1分</td>
			<td>94°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>焼鈍</td>
			<td>1分</td>
			<td>60°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>拡張子</td>
			<td>1分</td>
			<td>72°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1サイクル</td>
			<td>最終拡張</td>
			<td>7分</td>
			<td>72°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>保持</td>
			<td></td>
			<td>∞</td>
			<td>4°C</td>
		</tr>
</tbody></table>表3:PCRを用いた条件を用いた。 RT-PCR反応の PCR 条件を表示します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ソリューション</td>
			<td>ボリューム/リアクション(μl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNaseフリーウォーター</td>
			<td>変数</td>
		</tr>
<tr>
<td>BigDyeターミネーター3.1レディリアクションミックス</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>フォワードプライマー/リバースプライマー(3.2 μM)</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>テンプレート RNA</td>
			<td>20 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>合計</td>
			<td>20</td>
		</tr>
</tbody></table>表4:シーケンシング反応に必要な試薬。 セットアップでは、両方を同時に使用せず、前方またはリバースプライマーを使用します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1サイクル</td>
			<td>1分</td>
			<td>96°C</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">25サイクル</td>
			<td>10 s</td>
			<td>96°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 s</td>
			<td>50°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>4分</td>
			<td>60°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>保持</td>
			<td>∞</td>
			<td>4°C</td>
		</tr>
</tbody></table>表5:サンガーシーケンシングのPCR条件。

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Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

ここでは、サンガーシーケンシング、RT-PCR、ウェスタンブロッティングを用いたジストロフィン38発現の分子特性を臨床試験で紹介する。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床試験におけるDMD患者サンプルにおけるエキソンスキップ効率の特徴付け

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

このプロトコルは、DMD分野で信頼性の高い結果を得るために重要である前臨床設定および臨床試験で筋肉組織を調製し、処理するための標準化された方法論を提供する。このテクニックは、DMD の試行をスキップする場合に関連しています。そして、主な利点は、それらが十分に確立され、まとめて行われれば再現可能であるということです。これらの技術は主にDMDでのエキソンスキップに焦点を当てていますが、プライマーの変更により、スプライシング療法で治療される他の疾患にも同じ技術を適用できます。これらの方法は、エキソンスキップ効率とRNAおよびタンパク質の両方を達成するために使用することができる。分析用のサンプルを調製するには、まず、ガムが柔らかく粘着性になるまで、トラガカンスガムと水の等量を混合します。この混合物を25ミリリットルのシリンジにロードし、0.5〜1センチメートルのガムを個々のコルクディスクに分配します。反対側にディスクにラベルを付け、液体の一部が凍結するまで液体窒素にイポランタンの容器を置きます。各標本を、コルクに対して垂直な各筋肉の縦軸を持つディスク上のトラガカンスガムに入れる。各筋肉の底にガムを置いて筋肉を所定の位置に保持し、ピンセットを使用して冷たいイセペンタンの標本を凍結します。試料を1分間連続的に移動するか、完全に凍結するまで、一時的にドライアイスに置きます。その後、標本をガラスバイアルに入れ、摂氏80度の貯蔵を行います。分析のために凍結した筋肉組織を切り離すために、クライオスタットを25°Cの作動温度に設定し、筋肉ブロックをホルダーに取り付けます。平らな切片が達成されるまで組織ブロックをトリミングします。逆転写PCRおよびウェスタンブロット分析では、厚さ10マイクロメートルのスライスを得る。免疫体化学分析のために、6〜8マイクロメートルの厚いスライスを得て、そしてヘマトキシリンおよびエオシン染色のために、10〜12マイクロメートルの厚いスライスを得る。獲得後、スライスした切片を2本のミリリットルチューブに入れる。PCRおよびウェスタンブロッティングのサンプルを摂氏80度で保存してください。ここで、マイクロチップ電気泳動システムは、逆転写酵素PCR反応のゲル画像、および用量エスカレーションフェーズ1でアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置前後の2人の患者からのスキップされたバンドのシーケンシング結果を示す。両方の患者は、削除を抱えています。予想通り、治療前に、両方の患者はスキップを示さなかったし、唯一のスキップされていないバンドを視覚化することができた。12週間の治療の後、2番目の患者のために明確にスキップされた下のバンドを視覚化したが、第1の患者に対して任意のスキップされた製品を検出することは依然として困難であった。シーケンシング結果は、第2の患者に対してエキソン47と54、および第1の患者に対してエキソン44と54の連結を示した。スキップされたパーセンテージを計算するために、スキップされたバンドのモル濃度をスキップバンドとスキップされていないバンドで割った値です。予想通り、治療前にウェスタンブロットによってジストロフィンバンドが検出されなかった。治療後、健常性コントロールで観察されたものと比較して、分子量が低い第2の患者からバンドを検出した。しかし、最初の患者は、治療後に検出可能なレベルのジストロフィンを示さなかった。筋肉組織を正しく処理し、各標本をトラガカンスガムに一貫した方法で配置することが重要です。組織切片は、人工PCR、デジタルPCR、ウェスタンブロット、免疫組織化学、および異なるタイプのオミクスを含む多くの異なる方法で分析することができます。これらの技術は、加速することができ、開発、異なるエキソンを標的とする薬物をスキップする追加のエキソン、およびDMDの編集においてウイルスベースの開発に再び適用することができる。

Research

JoVE Journal

Medicine

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Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

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