Name: characterizing exon skipping efficiency in dmd patient samples in clinical trials of antisense oligonucleotides
Uploaded: 2020-05-07T13:00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides at JoVE.com

Vi er takknemlige til Dr Takashi Saito, Dr Tetsuya Nagata, Mr Satoshi Masuda, og Dr Eri Takeshita for vitenskapelig diskusjon.

Den operative prosedyren for den utprøver-initierte studien er godkjent av NCNP etisk utvalg (godkjennings-ID: A2013-019).
1. Utarbeidelse av muskelprøver
MERK: Biceps brachii eller quadriceps muskler er ofte valgt som biopsi nettsteder. Tibialis-fremre ble imidlertid brukt i den kliniske studien.
<ol><li>
Muskelbiopsi fra pasienter
	<ol>
<li>Merk snittstedet før hudforberedelse.</li>
		<li>Forbered saltvannsdemivt gasbind for biopsiprøven. Klem gasbind godt.</li>
		<li>Injiser lokalbedøvelse i hud og subkutant vev, men ikke i muskel. Sørg for dybden av anestesi ved fravær av kutan smerte. MERK: Generell anestesi brukes vanligvis hos pediatriske pasienter under 15 år.</li>
		<li>Lag et snitt fra huden til det subkutane vevet. Bruk små retractors å åpne snittet og skille subkutan fett. MERK: På dette trinnet kan en del av huden kuttes for fibroblastkultur.</li>
		<li>Gjør en annen liten snitt i fascia og kutte fascia videre. Klem kantene ved hjelp av myggtang for å avsløre muskelen.</li>
		<li>Bruk en sutur for å trekke opp den valgte delen av muskelen. Lag en liten tunnel ved hjelp av Iris saks og sett mygg tang inn i tunnelen.</li>
		<li>Skill muskelbunten ved hjelp av tang og kutt begge endene av måldelen. MERK: Muskelbiopsiprøver bør være rundt størrelsen på en blyant for voksne pasienter (lengde 1,0-1,5 cm, diameter 0,8-1,0 cm). Prøven skal være rundt 1 cm lang og 5 mm i diameter hos pediatriske pasienter.</li>
		<li>Pakk prøven i saltvannsdemivert gasbind og transporter den friske muskelen ved romtemperatur (RT) umiddelbart til et anlegg hvor prøven kan tilberedes for videre analyse. MERK: Prøvene skal transporteres ved 4 °C hvis transportvarigheten overstiger 1 time.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Forberedelse av muskelprøve
<ol><li>Bland like mengder tragacanth tyggegummi og vann til tannkjøttet blir mykt og klebrig. Legg blandingen i 25 ml sprøyter. Sprøytene kan oppbevares i kjøleskap.</li>
	<li>Plasser ca. 0,5 til 1 cm tragacanth tyggegummi på korkplater. Merk platene på motsatt side.</li>
	<li>Plasser en beholder med isopentan i flytende nitrogen til noe av væsken fryser.</li>
	<li>Plasser prøven i tragacanth tyggegummi. Langsgående akse av hver muskel bør være vinkelrett på korken. Plasser tyggegummi rundt bunnen av hver muskel for å hjelpe riktig plassering.</li>
	<li>Bruk pinsett, legg muskel-/korkprøven i kald isopentan tilberedt i trinn 2.3 for å fryse. Flytt prøven hele tiden i 1 min eller til den er helt frosset, og legg den midlertidig på tørris.</li>
	<li>Plasser prøven i hetteglass og oppbevar ved -80 °C.</li>
</ol>3. Muskelseksjon
<ol><li>Sett opp kryostaten for snitting med en arbeidstemperatur på -25 °C.</li>
	<li>Monter korken/muskelblokken og trim til flate seksjoner er oppnådd.</li>
	<li>Bruk en snitttykkelse på 10 μm for RT-PCR og vestlig blotting. Bruk en tykkelse på henholdsvis 6-8 μm og 10-12 μm til immunohistokjemi eller hematoksylin og eosinfarging. Sett skiver seksjoner i 2,0 ml rør og oppbevar ved -80 °C for RT-PCR og vestlig blotting.</li>
</ol>4. RNA ekstraksjon og omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (RT-PCR)
<ol><li>Trekk ut ca 10 skiver med 10 μm tykkelse fra frossen muskel av en kryostat. Samle opp den rensede totale RNA ved hjelp av rensesettet til total RNA i henhold til produsentens instruksjoner.</li>
	<li>Mål RNA-konsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer.</li>
	<li>Kombiner de nødvendige reagensene for en RT-PCR-reaksjon i PCR-rør i henhold til tabell 1. Se tabell 2 for primersekvenser. MERK: Den fremre primeren var 44F for pasient NS-03 og 46F for pasient NS-07. Den omvendte primeren var 54/55R som standard. Hvis ikke-spesifikke produkter var tydelige, ble 54R brukt som et alternativ.</li>
	<li>Plasser PCR-rørene som inneholder blandingen i en termo-cycler. Kjør termo-cycler i henhold til tabell 3.</li>
	<li>Oppbevar PCR-produktet ved 4 °C for korttidslagring eller -20 °C for langtidslagring.</li>
</ol>5. Mikrochip elektroforese og exon hoppe beregning
MERK: Et MCE-system (microchip electrophoresis) er ofte valgt for å analysere exon hoppe effektivitet. I denne protokollen beskriver vi trinnene som er nødvendige for å analysere exon hoppe effektivitet ved hjelp av et MCE-system av produsent A samt fra produsent B, heretter kalt system A og B. Under den kliniske studien ble exon hoppeeffektivitet analysert på system A. System A er imidlertid ikke lenger til salgs, og vi anbefaler system B å analysere exon hoppe effektivitet. Vi har inkludert protokoller for begge systemene (se pkt. 5.1 for system A og 5.2 for system B). Se Materials tabell for informasjon om system A og B. Videre kan dette trinnet også utføres med normal agarose gel elektroforese, men følsomheten reduseres markant.
<ol><li>Mikrochip elektroforese ved hjelp av system A MERK: System A har to typer sjetonger. Her beskriver vi trinnene for DNA-brikken.<ol>
<li>Likevektssettreagenser (flekkbuffer, lastbuffer, stige og gelbuffer) til RT, vortex og spinn ned.</li>
		<li>For å klargjøre gelflekkbuffer (GS), tilsett 12,5 μL flekkbuffer til 250 μL gelbuffer og virvel i 10 s. Flytt løsningen til et spinnfilterrør og sentrifuge ved 2400 x g i 15 min. Kast filteret. MERK: Den filtrerte GS kan oppbevares ved 4 °C i 1 måned.</li>
		<li>Hvis prøvene er svært konsentrerte, må du fortynne til ca. 50 ng/μL med TE-buffer eller DNase-fritt vann. MERK: Hvis prøvene er i en saltkonsentrasjon ≥ 200 mM KCl (eller NaCl) og/eller 15 mM MgCl2,bør du bytte bufferen.</li>
		<li>Tilsett 12 μL GS-oppløsning i gelprimingbrønnen (uthevet og merket GS) av DNA-brikken og plasser brikken i grunningsstasjonen. MERK: For å unngå luftbobler, sett pipettespissen vertikalt og til bunnen av brønnen når du sender ut. Dispenser sakte til første stopp på pipetten, og ikke utvis luft på enden av pipetteringstrinnet.</li>
		<li>Velg C3-modus og trykk på Start-knappen. Etter at grunning er fullført, fjern brikken.</li>
		<li>Inspiser mikrokanalene visuelt for fanget luftbobler eller ufullstendig grunning.</li>
		<li>Last de tilberedte prøvene og stigen på brikken som nedenfor.<ol>
<li>Pipette 9 μL GS-oppløsning i de andre 3 GS-brønnene.</li>
			<li>Pipette 5 μL lastbuffer inn i L-brønnen og hver prøvebrønn (1-11).</li>
			<li>Pipette 1 μL stige inn i L-brønnen.</li>
			<li>Pipette 1 μL DNA-prøve i hver av de 11 prøvebrønnene.</li>
			<li>Pipette 1 μL TE eller DNase-fritt vann i ubrukte brønner. Settets hurtigveiledning viser en figur av chipoppsettet. MERK: Inspiser alle brønner for luftbobler ved å holde brikken over en lett farget bakgrunn. Løsne eventuelle fanget luftbobler på bunnen av en brønn med en ren pipettespiss eller ved å fjerne og laste løsningen på nytt.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plasser brikken i vortexstasjonen og trykk Mix. Vortex-stasjonen stopper automatisk etter 1 min.</li>
		<li>Kjør brikken i elektroforesestasjonen innen 5 min lasting.</li>
		<li>Velg Ny kjøring på programvareverktøylinjen. Velg DNA og DNA 1K fra rullegardinlisten Analyse på Nytt løp-skjermen.</li>
		<li>Velg enten en prosjektmappe for kjøringen fra rullegardinlisten Prosjekt, eller opprett en ny prosjektmappe ved å skrive inn et navn i Prosjekt-feltet.</li>
		<li>Skriv inn et navn på kjøringen i feltet Kjør prefiks, og klikk Start kjør.</li>
		<li>Instrumentet piper når analysen er fullført, og et vindu åpnes som angir slutten av løpet. Velg OK og fjern brikken fra chip-plattformen.</li>
		<li>Velg Fil | Eksporter data for å eksportere dataene. Velg de ønskede alternativene i eksportdialogen.</li>
		<li>For å rengjøre elektrodene, fyll en rengjøringsbrikke med 800 μL av deionisert vann og legg den på chipplattformen, lukk lokket og la det være lukket i 1 min. Etter 1 min åpner du lokket, fjerner rengjøringsbrikken og lar elektrodene tørke i 1 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikrochip elektroforese ved hjelp av system B
	<ol>
<li>Åpne driftsprogramvaren, og skriv inn eksempelinformasjonen. Når du har angitt informasjonen, beregner programvaren mengden av å skille buffer- og markørløsninger automatisk.</li>
		<li>Klargjør den nødvendige mengden skillebuffer beregnet av programvaren. Først klargjør 100x nukleinsyre gel flekk løsning ved å fortynne 10,000x løsning med riktig mengde TE buffer. 100x oppløsningen kan lagres ved -20 °C.</li>
		<li>Bland en passende mengde 100x nukleinsyre gel flekk medseparasjonbuffer i det spesifikke røret levert av selskapet for å forberede en 1x løsning. Vortex løsningen.</li>
		<li>Forbered den nødvendige mengden markørløsning i røret.</li>
		<li>Start probevaskprogrammet.</li>
		<li>Start mikrochipvaskprogrammet når du er ferdig.</li>
		<li>Samtidig pipette prøvene til en PCR multiplate (96-brønn, klar) og fortynne 4 ganger med deionisert vann. Minimumsvolumet maskinen kan håndtere er 6 μL, og maksimumet er 30 μL. Vi foreslår et totalt volum på 10 μL (2,5 μL prøve og 7,5 μL vann/TE-buffer).</li>
		<li>Dekk platene med selvklebende PCR-tetningsfolieplater og spinn ned prøvene.</li>
		<li>Still inn platen, markørløsningen og 1x skillebufferen i maskinen i henhold til plasseringen som vises av maskinen. Trykk på Start-knappen.</li>
		<li>Når kjøringen er fullført, eksporterer du resultatdataene som en CSV-fil fra programvaren og beregner exon hoppe effektivitet ved hjelp av molar konsentrasjon som følger: Exon hoppe effektivitet (%) = (Hoppet bånd / (Hoppet bånd + Ikke-hoppet bånd) X 100</li>
	</ol></li>
</ol>6. Komplementær DNA (cDNA) sekvensering
<ol><li>
Agarose gel forberedelse
	<ol>
<li>Mål 1,5 g agarosepulver og bland pulveret med 100 ml 1x TAE-buffer i en mikrowavbar kolbe (noe som resulterer i en 1,5 % agarosegel).</li>
		<li>Mikrobølgeovn i 1-3 min til agarose er helt oppløst. MERK: Ikke overkoke oppløsningen, siden noe av bufferen vil fordampe og endre den endelige agaroseprosenten av gelen.</li>
		<li>La agaroseløsningen avkjøles til ca. 50 °C.</li>
		<li>Tilsett 10 μL 10 000x fluorescerende nukleinsyrefargestoff til agaroseoppløsningen.</li>
		<li>Hell agarose i et gelbrett med brønnkammen på plass. La på RT i 20-30 min til den er helt størknet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sekvensering
	<ol>
<li>Bland 5 μL RT-PCR-produkt (fra trinn 4.4) og 1 μL 6x lastbuffer. Last dem inn i brønnene til 1,5% agarose gel.</li>
		<li>Kjør gelen ved 135 V i 5 min og 120 V i 20 min.</li>
		<li>Visualiser båndene ved hjelp av en transilluminator i henhold til produsentens protokoll.</li>
		<li>Avgiftsdirektoratet band av interesse fra gelen og bruke en gel og PCR opprydding kit for å hente RT-PCR produkter.</li>
		<li>Mål konsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer. MERK: Det rensede båndet kan sendes til sekvensering hos et selskap eller sekvenseringsanlegg hvis det ikke er noe Sanger-sekvenseringsutstyr tilgjengelig internt.</li>
		<li>Klargjør de nødvendige reagensene for et syklussekvenseringssett og pipette til en PCR-plate med flere plater i henhold til tabell 4. Se tabell 2 for primersekvenser.</li>
		<li>Forsegle platen med klar selvklebende film.</li>
		<li>Vortex platen i 2 til 3 s. Sentrifuge kort i en svingende bøtte sentrifuge slik at innholdet bosette seg til bunnen av brønnene (5 til 10 s) på 1000 x g. MERK: Luftbobler kan være til stede i brønnene, men de påvirker ikke reaksjonen negativt.</li>
		<li>Plasser blandingen i en termo-cycler og kjør i henhold til tabell 5.</li>
		<li>Rens sekvenseringsreaksjonene med plater i henhold til produsentens instruksjoner.</li>
		<li>Bruk en DNA-analysator til å bestemme sekvensene i henhold til produsentens protokoll.</li>
		<li>Sammenlign sekvensen som er oppnådd med pasientens forventede sekvens.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Vestlig blotting
<ol><li>Prøve forberedelse
	<ol>
<li>Forbered SDS prøvebuffer (4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoetanol, 10% glyserol, 70 mM Tris-HCl pH 6.4, 0.001% bromofenol blå og proteasehemmer).</li>
		<li>Plasser rundt 100 skiver av de 10 μm muskelseksjonene som er samlet inn fra kryoseksjon i 150 μL SDS-buffer.</li>
		<li>Kort homogenisere protein prøver på is i 30 s ved hjelp av en praktisk mikro homogenisator.</li>
		<li>Sentrifuge ved 16 500 x g i 15 min, og overfør supernatanten til et friskt rør. Fortsett med analyse eller oppbevar ved -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>SDS-PAGE for måling av proteinkonsentrasjon MERK: En fluorescerende gelflekk ble brukt til å bestemme proteinkonsentrasjonen.<ol>
<li>Bestem den normale sunne kontrollprøven og konsentrasjonen ved hjelp av BCA-proteinanalysesettet i henhold til produsentens instruksjoner.</li>
		<li>Forbered prøvene for gelelektroforese. Pipette 10 μg av totalt protein av sunn kontroll og 5 μL av pasientprøvene, 5 μL 4x prøvebuffer, 2 μL av 10x prøvereduserende middel. Når disse er blandet, tilsett deionisert vann til et endelig volum på 20 μL i hver prøve.</li>
		<li>Varmeprøver ved 70 °C i 10 min.</li>
		<li>Klargjør 2000 ml 1x SDS-buffer som kjører ved hjelp av 50 ml 40x SDS som kjører buffer. Fortynn med 1950 ml avionisert vann. MERK: På dette tidspunktet er 1000 ml løpebuffer nok. Den resterende bufferen på 1000 ml brukes i trinn 7.3.1.</li>
		<li>Bland godt og sett av 800 ml av 1x SDS løpebuffer for bruk i det nedre (ytre) bufferkammeret på gelboksen.</li>
		<li>Umiddelbart før elektroforese, tilsett 500 μL antioksidantbuffer til 200 ml 1x SDS løpebuffer for bruk i det øvre (indre) bufferkammeret på gelboksen.</li>
		<li>Forbered deg på gelelektroforese ved å sette opp en 3-8% Tris-acetatgel i henhold til produsentens protokoll. Legg 20 μL av hver prøve på gelen.</li>
		<li>Utfør elektroforese ved 150 V i 75 min.</li>
		<li>Etter elektroforese, legg gelen direkte inn i et rent brett som inneholder 50 ml fluorescerende gelflekkoppløsning.</li>
		<li>Dekk brettet, legg på en shaker og agert uten å sprute væske eller skade gelen i 90 min.</li>
		<li>Overfør gelen til vann før avbildning i et fluorescenssystem ved 312 nm belysning med ethidiumbromidutslippsfilter for å oppdage fluorescens.</li>
		<li>Mål konsentrasjonene av pasientprøvene basert på en analytisk kurve konstruert ved hjelp av normal kontrolllylat med kjent konsentrasjon.</li>
	</ol></li>
	<li>SDS-SIDE for vestlig blotting
	<ol>
<li>Forbered gelboksen i henhold til trinn 7.2.4-7.2.6.</li>
		<li>Basert på konsentrasjonsmålingen oppnådd i trinn 7.2.11, last 100 μg per kjørefelt med sunn kontrolllysat og 300 μg per kjørefelt av pasientprøven. Elektroforese ved hjelp av de samme innstillingene som trinn 7.2.7.</li>
	</ol></li>
	<li>Overføring av proteiner
	<ol>
<li>Klargjør overføringsbufferen. Bløtlegg en PVDF-membran i 20 s i metanol. Flytt den til blotting buffer B til bruk.</li>
		<li>Bløtlegg et ekstra tykt blottingspapir i blottingbuffer A, B og C i minst 30 min per buffer.</li>
		<li>Etter elektroforese, suge gelen i blotting buffer B i 5 min.</li>
		<li>Plasser blotting papir, PVDF membran, og gel på semi-tørr overføringsmaskin i henhold til tegningen i figur 1. Rull ut luftbobler mellom gel og membran med en rulle.</li>
		<li>Overfør ved 2 mA/cm2 membran i 1 t ved RT. MERK: Etter overføring anbefales det å utføre en total proteinflekk som ligner på Ponceau-farging for å bekrefte vellykket overføring av de store molekylære proteinene.</li>
	</ol></li>
	<li>Blokkering og antistofffarging
	<ol>
<li>Skyll membranen to ganger med PBST (1x PBS med 0,1 % Tween 20).</li>
		<li>Plasser membranen i 1% blokkeringsmiddel, og rock forsiktig i 1 t ved RT for å blokkere.</li>
		<li>Inkuber membranen med anti-dystrophin antistoff i blokkeringsoppløsning (1:125) og anti-spektrin antistoff (1:25,000) i 1 time ved RT eller over natten ved 4 °C.</li>
		<li>Vask membranen tre ganger i 10 min hver med PBST ved RT.</li>
		<li>Inkuber membranen med pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert sekundært antimus/kaninantistoff i PBST (1:100) i 40 min ved RT.</li>
		<li>Vask membranen igjen tre ganger i 10 min med PBST ved RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Oppdagelsen
	<ol>
<li>Blandedeteksjonsløsninger A og B i forholdet 1:1. Det endelige volumet av deteksjonsreagens som kreves er 0,1 ml/ cm2 membran.</li>
		<li>Fjern overflødig PBST fra den vasket membranen og legg den med proteinsiden opp på et plastfolie eller andre egnede rene overflater. Tilsett blandet deteksjonsreagens på membranen og inkuber i 5 minutter ved RT.</li>
		<li>Fjern overflødig deteksjonsreagens ved å holde membranen forsiktig i tang og berøre kanten mot et vev.</li>
		<li>Plasser flekkproteinet side opp på et prøvebrett. Bruk det fluorescerende systemet i henhold til brukerdokumentasjonen. Still inn maskinen som følger. Eksponeringstype: Økning, Intervalltid: 10 s, Følsomhet/oppløsning: høy. MERK: Målte områder ble bokset med et blått rektangel (figur 4a-b): BG: bakgrunn; D: dystrophin 427 kDa, SL: spectrin beta lang isoform (274 kDa); SS: kort isoform (253 kDa). Dystrophin/spektrinsignalforhold ble beregnet som (D-BG)/[(SL-BG) + (SS-BG)]. Forholdet mellom normal kontroll ble angitt som 100 %.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Bushby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+Duchenne+muscular+dystrophy,+part+2:+implementation+of+multidisciplinary+care.">Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care.</a> Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51 (6), 919-928 (1987).</li><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li><li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Greenberg, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+studies+in+newborn+males+with+Duchenne+muscular+dystrophy+detected+by+neonatal+screening.">Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening.</a> Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).</li><li>Forrest, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+of+gene+deletions+that+cause+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophies.">Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies.</a> Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).</li><li>Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+explanation+for+the+phenotypic+differences+between+patients+bearing+partial+deletions+of+the+DMD+locus.">An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus.</a> Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).</li><li>Flanigan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+spectrum+of+DMD+mutations+in+dystrophinopathy+patients:+application+of+modern+diagnostic+techniques+to+a+large+cohort.">Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort.</a> Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).</li><li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-frame+dystrophin+following+exon+51-skipping+improves+muscle+pathology+and+function+in+the+exon+52-deficient+mdx+mouse.">In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse.</a> Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).</li><li>Lu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+amounts+of+dystrophin+produced+by+skipping+the+mutated+exon+in+the+mdx+dystrophic+mouse.">Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse.</a> Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).</li><li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+systemic+morpholino+exon-skipping+in+Duchenne+dystrophy+dogs.">Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs.</a> Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).</li><li>Kesselheim, A. S., Avorn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approving+a+Problematic+Muscular+Dystrophy+Drug:+Implications+for+FDA+Policy.">Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).</li><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eteplirsen+for+the+treatment+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).</li><li>Komaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+the+antisense+oligonucleotide+NS-065/NCNP-01+for+skipping+of+exon+53+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy.">Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).</li><li>Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Droplet+PCR+for+the+Absolute+Quantification+of+Exon+Skipping+Induced+by+Antisense+Oligonucleotides+in+(Pre-)Clinical+Development+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> PLoS One. 11 (9), e0162467 (2016).</li><li>Takizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Duchenne+muscular+dystrophy+in+MYOD1-converted+urine-derived+cells+treated+with+3-deazaneplanocin+A+hydrochloride.">Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3807 (2019).</li></ol>

Kliniske studier av DMD har produsert både suksesser og feil de siste årene. Både RT-PCR og vestlig blotting er vanlige teknikker for å vurdere hoppeeffektiviteten generert av exon-skipping forbindelser administrert til pasientene. RT-PCR har imidlertid blitt rapportert å overvurdere hoppeeffektiviteten sammenlignet med digital PCR15. Selv om dette skyldes en rekke årsaker, er det først og fremst forårsaket av den mer effektive forsterkningen av de mindre hoppet fragmenter under PCR sykluser. Det ser ut til at RT-PCR som brukes i denne kliniske studien også genererte høyere hoppeeffektivitet sammenlignet med proteinuttrykket estimert ved vestlig blotting. Ifølge FDA er dette en mer pålitelig måte å kvantifisere dystrophin restaurering12. Derfor bør forsiktighet utvises når du tolker RT-PCR hoppe resultater; prøvene kan imidlertid fortsatt sammenlignes. Prøver som viser høyere effektivitet basert på RT-PCR-resultater, gir vanligvis høyere proteinuttrykksnivåer i vestlige flekkanalyser.
Siden alle pasienter i kliniske DMD-studier ikke har samme slettingsmønster, kan det være vanskelig å designe primere og sonder som er tilstrekkelig spesifikke for å utføre digitale eller qPCR på alle prøver. Derfor er RT-PCR fortsatt et godt alternativ for en første vurdering av hoppeeffektiviteten. Før den kliniske studien av NS-065/NCNP-01 startet, var det kjedelig å vurdere å hoppe over effektivitet for hver pasient in vitro siden enten en muskel- eller hudbiopsi var obligatorisk for å generere pasientspesifikke myoblaster. Vi har imidlertid nylig publisert en ny teknikk for å generere pasientspesifikk MYOD1-konverterte, urinavledede celler (UDCer) som en ny DMD muskelcellemodell16. Dermed er det bare urin samlet inn fra pasienten å generere myoblastene, og ingen invasiv prosedyre er nødvendig. Vi tror at denne metoden kan brukes til å screene forskjellige AONer i pasientspesifikke celler. Videre kan ulike primere og sonder testes før pasienten starter en klinisk studie. Dette kan lette bruken av qPCR eller digital PCR for exon hoppe måling i DMD kliniske studier i fremtiden.
For å utføre western blot analyse i denne kliniske studien ble et enkelt antistoff mot dystrophin brukt, og bare en sunn kontroll ble brukt som referanseprøve. Derfor ble spesifisiteten av antistoffet ikke validert riktig. Dette, sammen med det faktum at antistoffet bare gjenkjenner C-terminaldomenet dystrophin, er en begrensning av protokollen. Mer sunne kontroller og antistoffer rettet mot ulike domener av dystrophinmolekylet er tilrådelig i fremtiden.
Her oppsummerte vi protokollene som ble brukt i den nylige utforskende etterforsker-initierte, første-i-menneskelige studien av NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 gjelder potensielt for 10,1 % av pasientene med DMD.

Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en degenerativ muskelsykdom som forårsaker progressiv tap av muskelmasse, respirasjonssvikt og kardiomyopati, og det fører til tidlig død1. Sykdommen er forårsaket av mangel på det store strukturelle muskelproteinet dystrophin2. Mutasjoner i DMD-genet på X-kromosomet er recessive, og sykdommen påvirker 1 av 3500-5000 nyfødte menn3,4,5. Mutasjonene er ofte store slettinger i en hotspot-region mellom exons 44 og 55 som fører til en forvrengt leseramme og for tidlig stoppkodoner, forårsaker tullmediert forfall og en nesten total mangel på dystrophin protein6,7,8. Leserammen kan korrigeres ved hjelp av antisense oligonucleotides (AONer) som induserer exon hoppe og gjenopprette leserammen, delvis gjenopprette dystrophin uttrykk og forsinke sykdomsprogresjon9,10,11. Den morpholino AON eteplirsen, som nylig ble godkjent av Federal Drug Agency (FDA), induserer hoppe av exon 51 og kan gjenopprette leserammen hos pasienter med exon 52 slettinger12,13. Exon 53 hoppe gjenoppretter imidlertid leserammen for pasienter med exon 52 slettinger, og det kan potensielt behandle ca 10% av DMD pasienter14. Morpholino AON stoffet NS-065/NCNP-01 har vist seg å indusere exon 53 hoppe i menneskelige celler, og vi nylig administrert NS-065/NCNP-01 til DMD pasienter i en fase 1 åpen dose-eskalering klinisk studie (heretter, referert til som "studien") (registrert som UMIN: 000010964 og ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. Studien viste en doseavhengig økning av exon 53 hoppe basert på RT-PCR og dystrophin proteinnivåer basert på vestlig blotting, og ingen alvorlige bivirkninger eller dropouts ble observert14.
I alle kliniske studier er analysen av resultatene av avgjørende betydning. For kliniske DMD-studier pågår det fortsatt en debatt om den beste metoden for å vise en behandlingsfordel. Kliniske tester som 6-minutters gangetest har visse ulemper. Molekylær karakterisering av dystrophinuttrykket kan utføres ved hjelp av flere metoder, for eksempel RT-PCR, qPCR, digital-PCR, vestlig blotting og immunohistochemistry. Imidlertid er omfanget av proteinuttrykksrestaurering som er nødvendig for å gi en klinisk fordel, fortsatt uklart. I denne metodeartikkelen beskriver vi i detalj RT-PCR og vestlige blotting metoder som brukes til å bestemme exon hoppe og proteinnivåer, henholdsvis i fase 1 studien av AON hoppe stoffet NS-065/NCNP-0114.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Takara</td>
			<td>3407A</td>
			<td>marker solution for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35436-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>21418-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15-2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#215; Loading Buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose ME</td>
			<td>Iwai chemical</td>
			<td>50013R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A41046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>05808-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centri-Sep 96-Well Plates</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Blocking Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>2922498000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Automated Electrophoresis Station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007010</td>
			<td>Microchip electrophoresis system A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007107JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Priming Station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Vortex Station II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Thick Blot Filter Paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EzBlot</td>
			<td>Atto</td>
			<td>AE-1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vial</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>1880 SV20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>17045-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histofine Simple Stain MAX PO</td>
			<td>Nichirei</td>
			<td>424151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Clear Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>mlp9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus)</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>NCL-DYS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>NCL-SPEC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EA03785BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LA0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oriole Fluorescent Gel Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physcotron Handy micro-homogenizer</td>
			<td>MICROTEC</td>
			<td>NS-310E3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>556463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN OneStep RT-PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>210212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31606-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-dry transfer machine</td>
			<td>Bio Craft</td>
			<td>41-1293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td>for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35430-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth Gum</td>
			<td>Wako</td>
			<td>200-02245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA Buffer</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>316-90025</td>
			<td>for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35907-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing exon skipping efficiency in dmd patient samples in clinical trials of antisense oligonucleotides

Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en degenerativ muskelsykdom som forårsaker progressiv tap av muskelmasse, noe som fører til tidlig død. Mutasjonene forårsaker ofte en forvrengt leseramme og for tidlig stoppkodoner, noe som resulterer i en nesten total mangel på dystrophinprotein. Leserammen kan korrigeres ved hjelp av antisense oligonucleotides (AONer) som induserer exon hoppe. Morpholino AON viltolarsen (kodenavn: NS-065/NCNP-01) har vist seg å indusere exon 53 hoppe, gjenopprette leserammen for pasienter med exon 52 slettinger. Vi administrerte nylig NS-065/NCNP-01 intravenøst til DMD-pasienter i en eksplorativ utprøver-initiert, første-i-menneskelig studie av NS-065/NCNP-01. I denne metodeartikkelen presenterer vi molekylær karakterisering av dystrophin uttrykk ved hjelp av Sanger sekvensering, RT-PCR, og vestlig blotting i den kliniske studien. Karakteriseringen av dystrophinuttrykket var grunnleggende i studien for å vise effekten siden ingen funksjonelle utfallstester ble utført.

Hvis du vil bruke RT-PCR til å oppdage exon-hopp, ble primere på hver side av eksonen som skal hoppes over, utformet og evaluert for å gi bare bestemte bånd (se figur 2 for et skjematisk diagram med exonhopping og primerposisjon). Primers bør generere produkter som lett kan skilles etter størrelse på et MCE-system eller normal agarose gel elektroforese hvis MCE ikke er tilgjengelig. Figur 3a viser MCE-systemet A gelbilder av RT-PCR-reaksjoner og sekvenseringsresultatene av det hoppede båndet fra pasienter NS-03 og NS-07 før og etter behandling med NS-065/NCNP-01 i doseopptrappingsfase 1-studien. NS-03 og NS-07 havneslettinger som strekker seg over henholdsvis 45-52 og 48-52. NS-03 fikk 5 mg/kg og NS-07 20 mg/kg NS-065/NCNP-01 ukentlig i 12 uker. Som forventet før behandling viste begge pasientene ingen hoppe, og bare et ikke-hoppet bånd kunne visualiseres. Etter 12 ukers behandling ble et klart hoppet underbånd visualisert for NS-07. Det var imidlertid fortsatt vanskelig å oppdage noe hoppet produkt for pasient NS-03. Sekvenseringsresultatene viste en sammenføyning av exons 47 og 54 for NS-07, samt exons 44 og 54 for NS-03. Ifølge sekvensen kan disse teoretisk produsere en funksjonell, men forkortet dystrophin isoform. For å beregne hoppeprosenten som vises i figur 3b, ble molarkonsentrasjonen for det hoppet over båndet delt på det hoppet og uhoppet bånd. For pasient NS-07 var andelen etter behandling 72 %, og den var 3,4 % for NS-03. Vestlige blotdata (i triplikate) fra pasienter NS-03, NS-07 og en sunn kontroll er vist i figur 4a. Forventet ble det ikke påvist noe dystrophinbånd før behandling. Etter behandling ble et bånd fra pasient NS-07 påvist med lavere molekylvekt sammenlignet med sunn kontroll (vill type dystrophin har en molekylvekt på 427 kDa, og NS-07 dystrophin har en molekylvekt på 389 kDa). På grunn av exon sletting og hoppe, dystrophin isoform fra pasienten NS-07 manglet flere exons, og det var forventet å ha en lavere molekylvekt. Pasient NS-03 viste ingen påviselige nivåer av dystrophin etter behandling. I figur 4ber mengden dystrophin sammenlignet med en sunn kontroll for pasient NS-07 vist. Plasseringen der signalintensiteter ble målt for beregning av dystrophin restaurering er indikert med blå firkanter. Dystrophin spektrin forholdet ble brukt til å beregne mengden dystrophin sammenlignet med den friske kontrollen. For dette formål ble signalet fra dystrophin minus bakgrunn delt på summen av de to spektrinisoformene (lang og kort) minus bakgrunn (se trinn 8.6.5). Forholdet for sunn kontroll ble satt til 100%. Mengden dystrophin sammenlignet med den friske kontrollen hos pasient NS-07 etter behandling var 9,1 %. Prosentandelen kunne imidlertid ikke beregnes for pasient NS-03 på grunn av et svakt dystrophinbånd, som ligner de som ble oppnådd for tidligere behandlingsprøver for begge pasientene.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig1.jpg"> Figur 1: Skjematisk diagram av overføringsstakken for western blot analyse. Montering av den vestlige blot overføringsstabelen med blotting papir gjennomvåt i blotting buffer A i bunnen etterfulgt av blotting papir gjennomvåt i blotting buffer B, PVDF membran, 3-8% Tris-Acetate Gel og på topp 2 blotting papirer gjennomvåt i blotting buffer C vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig2.jpg"> Figur 2: Skjematisk tegning av exon hoppe av exon 53 hos en pasient med exon 45-52 sletting i DMD genet. For eksempel hadde pasient NS-03 i den kliniske doseopptrappingsstudien denne slettingen. Hvis exon 53 beholdes, vil mRNA være ute av rammen siden exon-exon-krysset mellom exon 44 og 53 forstyrrer leserammen, noe som forårsaker en stoppkodon i exon 53. Leserammen gjenopprettes når exon 53 hoppes over, og en kortere isoform av dystrophin produseres. For å oppdage exon 53-skipping av RT-PCR, primere i exon 44 og 54 brukes slik at PCR-produktet mellom hoppet og un-hoppet mRNA kan lett oppdages. FWD: fremover primer, REV: omvendt primer, PMO: fosforodiamidate morpholino oligomer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig3.jpg"> Figur 3: Hopper over effektivitet for pasienter NS-03 og NS-07 fra tibialis fremre muskelbiopsiprøver. a) Gelbilde generert av elektroforesesystem A av RT-PCR-prøver av ubehandlede og behandlede prøver fra pasienter NS-03 og NS-07. Øvre panel viser NS-03 og nedre panel NS-07 i triplikate. For NS-03 er det uhoppede bandet 422 bp, og det hoppet bandet er 212 bp. For NS-07 er bandene henholdsvis 836 bp og 624 bp. Sekvensanalyse viste en sammenføyning av exon 44 og exon 54 for NS-03 og exon 47 til exon 54 for NS-07. b) Hoppe over effektivitet før og etter behandling er vist for pasienter NS-03 og NS-07, beregnet ut fra molarkonsentrasjonen av de to båndene som leveres av system A som hoppet bånd /(hoppet bånd + uhoppet bånd) x 100. Hoppeeffekten for NS-03 var svært lav etter behandling; for NS-07 var hoppeeffektiviteten over 70%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig4.jpg"> Figur 4: Protein kvantifisering av Dystrophin isoformer før og etter exon hoppebehandling. a)Protein kvantifisering av dystrophin isoformer før og etter exon hoppebehandling. Vestlig flekk av muskelbiopsi fra tibialis fremre fra pasienter NS-03 og NS-07 før og etter behandling og fra sunn kontroll i triplicate. Dystrophin kan sees ved 427 kDa for sunn kontroll og ved 389 kDa for NS-07 etter behandling. Det kan ikke påvises dystrophin for hverken pasient før behandling, eller ingen av dem kunne påvises etter behandling for pasient NS-03. Området i den svarte boksen vises i figur 4b. Til venstre i hver flekk vises markøren. b) Mengden dystrophin gjenopprettet etter behandling for pasient NS-07. Dystrophin restaurering ble beregnet basert på intensitetene i båndene for dystrophin, bakgrunn, og den lange og korte isoform av spektrin i henhold til formelen: (dystrophin - bakgrunn) / (spectrin L -bakgrunn) + (spectrin S - bakgrunn) hvor forholdet for sunn kontroll er satt til 100%. Intensiteten til hvert bånd ble målt inne i de blå boksene som vises på figuren. Dystrophin-restaureringen for NS-07 var 9,1 % etter behandling. Dystrophinsignalet var for svakt til å måle i de ubehandlede prøvene. Markørstørrelser er vist i kilodaltonn. Dys: Dystrophin, BG: bakgrunn, SL: Spectrin lang isoform, SS: Spectrin kort isoform, Min: Myosin type 1. Markørstørrelser er vist i kilodaltonn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Løsning</td>
			<td>Volum/reaksjon (μl)</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-fritt vann (medfølgende)</td>
			<td>Variabel</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer</td>
			<td>5.0</td>
			<td>1x (andre)</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP Mix (som inneholder 10 mM av hver dNTP)</td>
			<td>1.0</td>
			<td>400 μM av hver dNTP</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer forover (10 μM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0,6 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Omvendt primer (10 μM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0,6 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>QIAGEN OneStep RT-PCR enzym blanding</td>
			<td>1.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-hemmer (valgfritt)</td>
			<td>Variabel</td>
			<td>5–10 enheter/reaksjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mal RNA</td>
			<td>50 ng</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: RT-PCR-reagenser. De nødvendige forbindelsene for en reaksjon av RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer</td>
			<td>Sekvens</td>
		</tr>
<tr>
<td>44F (andre)</td>
			<td>5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>46F</td>
			<td>5'-AACCTGGAAAAGAGCAGCAA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>48F</td>
			<td>5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54/55R</td>
			<td>5'-TCTCGCTCACTCACCCTTTT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54R (andre personer)</td>
			<td>5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Primer-liste. Sekvenser for primere som brukes i denne studien. F: Forover, R: Revers.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 syklus</td>
			<td>Omvendt transkripsjon</td>
			<td>30 min.</td>
			<td>50 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 syklus</td>
			<td>Første trinn for PCR-aktivering</td>
			<td>15 min.</td>
			<td>95 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">35 sykluser</td>
			<td>Denning</td>
			<td>1 min.</td>
			<td>94 °C (andre)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Annealing</td>
			<td>1 min.</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Forlengelsen</td>
			<td>1 min.</td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 syklus</td>
			<td>Endelig utvidelse</td>
			<td>7 min.</td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Holde</td>
			<td></td>
			<td>∞</td>
			<td>4 °C (andre)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: PCR betinget brukt. Vis PCR-forhold for RT-PCR-reaksjonen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Løsning</td>
			<td>Volum/reaksjon (μl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-fritt vann</td>
			<td>Variabel</td>
		</tr>
<tr>
<td>BigDye Terminator 3.1 Klar Reaksjon Mix</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer/revers (3,2 μM)</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mal RNA</td>
			<td>20 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td>20</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 4: Reagenser som er nødvendige for sekvenseringsreaksjonen. Bruk enten Forward eller Reverse primer i oppsettet, ikke begge samtidig.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 syklus</td>
			<td>1 min.</td>
			<td>96 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">25 sykluser</td>
			<td>10 s</td>
			<td>96 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 s</td>
			<td>50 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 min.</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Holde</td>
			<td>∞</td>
			<td>4 °C (andre)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 5: PCR-betingelser for Sanger-sekvenseringen.

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides at JoVE.com

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

Her presenterer vi molekylær karakterisering av dystrophin 38-uttrykk ved hjelp av Sanger-sekvensering, RT-PCR og vestlig blotting i den kliniske studien.

Karakteriserer Exon Skipping Effektivitet i DMD pasientprøver i kliniske studier av Antisense Oligonucleotides

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Denne protokollen gir en standardisert metodikk for å forberede og håndtere muskelvev i prekliniske innstillinger og kliniske studier, noe som er viktig for å oppnå pålitelige resultater innen DMD-feltet. Teknikkene er relevante for exon hoppe tryouts for DMD. Og den største fordelen er at de er godt etablert og reproduserbare hvis de utføres kollektivt.Disse teknikkene er hovedsakelig fokusert på exon hoppe i DMD, men med en endring av primere, de samme teknikkene kan brukes på andre sykdommer behandlet med spleising terapi. Disse metodene kan brukes til å oppnå exon hoppe effektivitet både og RNA og protein. For å forberede en prøve for analyse, bland først like mengder tragacanth tyggegummi og vann til tannkjøttet blir mykt og klebrig.Legg denne blandingen i 25 milliliter sprøyter og dispenser 0,5 til en centimeter tyggegummi på individuelle korkplater. Merk platene på motsatt side og legg en beholder med isopentan i flytende nitrogen til noe av væsken fryser. Plasser hvert eksemplar i tragacanth tyggegummi på diskene med en langsgående akse av hver muskel vinkelrett på korken.Plasser tyggegummi rundt til bunnen av hver muskel for å holde muskelen på plass, og bruk pinsett for å fryse prøvene i den kalde isopentanen. Flytt prøvene kontinuerlig i ett minutt eller til de er helt frosset før du plasserer dem midlertidig på tørris. Deretter plasserer du prøvene i hetteglass i 80 grader Celsius lagring.For å seksjonere det frosne muskelvevet for analyse, sett en kryostat til en arbeidstemperatur på 25 grader Celsius, og for å montere muskelblokken på holderen. Trim vevsblokken til flate seksjoner er oppnådd. For omvendt transkripsjon PCR og Western blot analyse, få 10 mikrometer tykke skiver.For immunohistokjemisk analyse, få seks til åtte mikrometer tykke skiver, og for hematoksylin og eosin farging, få 10 til 12 mikrometer tykke skiver. Etter oppkjøpet plasserer du de skivede seksjonene i to milliliter rør. Oppbevar prøvene for PCR og vestlig blotting ved 80 grader Celsius.Her er mikrochip elektroforesesystem, gelbilder av omvendt transkripsjon av PCR-reaksjoner og sekvenseringsresultatene av det hoppet over båndet fra to pasienter før og etter behandling med en antisense oligonucleotide i en doseopptrappingsfase en studie vist. Begge pasientene har sletting. Som forventet, før behandling, begge pasientene viste ingen hoppe og bare en ikke-hoppet bånd kunne visualiseres.Etter 12 ukers behandling ble et klart hoppet underbånd visualisert for den andre pasienten, men det var fortsatt vanskelig å oppdage noe hoppet produkt for den første pasienten. Sekvenseringsresultatene viste en sammenføyning av exons 47 og 54 for den andre pasienten, og exons, 44 og 54 for den første pasienten. For å beregne den hoppet prosenten ble molarkonsentrasjonen for det hoppet bandet delt på de hoppet og uskippede båndene.Som forventet ble det ikke påvist noe dystrophinbånd av vestlig flekk før behandling. Etter behandling ble det påvist et bånd fra den andre pasienten med lavere molekylvekt sammenlignet med det som ble observert i den sunne kontrollen. Den første pasienten viste imidlertid ingen påviselige nivåer av dystrophin etter behandling.Det er viktig å håndtere muskelvevet riktig, og å plassere hver prøve på tragacanth tyggegummi på konsekvent måte. Vevseksjonene kan analyseres på en rekke forskjellige måter, inkludert kunstig til PCR, digital PCR, vestlig flekk, immunohistochemistry, og med forskjellige typer omics. Disse teknikkene kan akselerere, utvikling, ekstra exon hoppe narkotika rettet mot ulike exons, og kan brukes til utvikling av viral basert og igjen i redigering for DMD.

Research

JoVE Journal

Medicine

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Slow-release Drug Delivery gjennom Elvax 40W til Rat Retina: Konsekvenser for behandling av kroniske betingelser

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

miRNA Expression Analyser i Prostate Cancer Clinical Vev

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Multi-exon Hoppe Bruke Cocktail Antisenseoligonukleotider i Canine X-linked muskeldystrofi

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Objektivt Deep Sekvensering av RNA virus fra kliniske prøver

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

Prøvetaking strategier og behandling av Biobank fra svin biomedisinsk modeller

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Collecting Hair Samples for Hair Cortisol Analysis in African Americans

Samle hårprøver for hår kortisol analyse i afrikanske amerikanere

The hormone cortisol is typically assessed in saliva, serum, or urine samples. More recently, cortisol has been successfully extracted from hair, ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

Evaluering av ekson inkludering av skjøte bytte Antisense Oligonucleotides i SMA pasienten fibroblaster

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Kvantitativ [18F]-NAF-pet-MRI analyse for evalueringen av drivkraft benomsetning inne en pasient med Facetogenic lav Ryggsmerte

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Inducing og karakteriserer flytande steatosis i differensiert HepaRG celler

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Bruke en kjemisk biopsi for graftkvalitetsvurdering

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...