Name: characterizing exon skipping efficiency in dmd patient samples in clinical trials of antisense oligonucleotides
Uploaded: 2020-05-07T13:00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides at JoVE.com

Мы признательны д-ру Такаси Сайто, д-ру Тэцуя Нагате, г-ну Сатоси Масуде и д-ру Эри Такешите за научное обсуждение.

<ol>
	<li>Bushby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+Duchenne+muscular+dystrophy,+part+2:+implementation+of+multidisciplinary+care.">Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care.</a> Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51 (6), 919-928 (1987).</li><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li><li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Greenberg, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+studies+in+newborn+males+with+Duchenne+muscular+dystrophy+detected+by+neonatal+screening.">Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening.</a> Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).</li><li>Forrest, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+of+gene+deletions+that+cause+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophies.">Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies.</a> Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).</li><li>Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+explanation+for+the+phenotypic+differences+between+patients+bearing+partial+deletions+of+the+DMD+locus.">An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus.</a> Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).</li><li>Flanigan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+spectrum+of+DMD+mutations+in+dystrophinopathy+patients:+application+of+modern+diagnostic+techniques+to+a+large+cohort.">Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort.</a> Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).</li><li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-frame+dystrophin+following+exon+51-skipping+improves+muscle+pathology+and+function+in+the+exon+52-deficient+mdx+mouse.">In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse.</a> Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).</li><li>Lu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+amounts+of+dystrophin+produced+by+skipping+the+mutated+exon+in+the+mdx+dystrophic+mouse.">Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse.</a> Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).</li><li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+systemic+morpholino+exon-skipping+in+Duchenne+dystrophy+dogs.">Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs.</a> Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).</li><li>Kesselheim, A. S., Avorn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approving+a+Problematic+Muscular+Dystrophy+Drug:+Implications+for+FDA+Policy.">Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).</li><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eteplirsen+for+the+treatment+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).</li><li>Komaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+the+antisense+oligonucleotide+NS-065/NCNP-01+for+skipping+of+exon+53+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy.">Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).</li><li>Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Droplet+PCR+for+the+Absolute+Quantification+of+Exon+Skipping+Induced+by+Antisense+Oligonucleotides+in+(Pre-)Clinical+Development+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> PLoS One. 11 (9), e0162467 (2016).</li><li>Takizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Duchenne+muscular+dystrophy+in+MYOD1-converted+urine-derived+cells+treated+with+3-deazaneplanocin+A+hydrochloride.">Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3807 (2019).</li></ol>

Ни один.

Клинические испытания DMD дали как успехи, так и неудачи в последние несколько лет. Как RT-PCR, так и западные blotting являются общими методами для оценки эффективности пропуска порожденных экзон-пропуск соединений, вводимых пациентам. Тем не менее, RT-PCR, как сообщается, чрезмерно оценить эффективность пропуска по сравнению с цифровым ПЦР15. Хотя это связано с рядом причин, это в первую очередь вызвано более эффективным усилением меньших пропущенных фрагментов во время циклов ПЦР. Похоже, что RT-PCR, используемый в этом клиническом испытании, также вызвал более высокую эффективность пропуска по сравнению с выражением белка, оцененного западным blotting. По данным FDA, это более надежный способ количественного восстановления дистрофина12. Таким образом, следует проявлять осторожность при интерпретации результатов пропуска RT-PCR; однако образцы все еще можно сравнить. Образцы, показывающие более высокую эффективность пропуска на основе результатов RT-PCR, обычно эксбит более высокие уровни экспрессии белка в западных анализах помарки.
Поскольку все пациенты в клинических испытаниях DMD не имеют той же модели удаления, это может быть трудно разработать грунтовки и зонды, которые являются адекватно конкретными для выполнения цифровых или qPCR на всех образцах. Таким образом, RT-PCR по-прежнему является хорошей альтернативой для первой оценки эффективности пропуска. До начала клинических испытаний NS-065/NCNP-01 было утомительно оценивать эффективность пропуска каждого пациента в пробирке, так как биопсия мышц или кожи была обязательной для генерации специфических миобластов пациента. Тем не менее, мы недавно опубликовали новый метод для создания конкретных пациентов MYOD1 преобразованы, мочи полученных клеток (UDCs) в качестве нового DMD мышечнойклеточной модели 16. Таким образом, только моча, собранная у пациента, необходима для генерации миобластов, и никакой инвазивной процедуры не требуется. Мы считаем, что этот метод может быть использован для проверки различных AONs в конкретных клеток пациента. Кроме того, различные грунтовки и зонды могут быть проверены до того, как пациент начнет какие-либо клинические испытания. Это может облегчить использование qPCR или цифрового ПЦР для пропуска измерений в клинических испытаниях DMD в будущем.
Для выполнения западного анализа помарки в этом клиническом испытании, одно антитело против дистрофина было использовано, и только один здоровый контроль был использован в качестве эталонного образца. Таким образом, специфичность антитела не была подтверждена надлежащим образом. Это, наряду с тем, что антитела распознает только C-терминальный домен дистрофина, является ограничением протокола. Более здоровые элементы управления и антитела, направленные против различных областей молекулы дистрофина, являются целесообразными в будущем.
Здесь мы обобщили протоколы, которые были использованы в недавнем исследовательском следователе, начатом, первом в человеке судебном разбирательстве NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 потенциально применим к 10,1% пациентов с ДМД.

Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является дегенеративным заболеванием мышц, вызывая прогрессирующую потерю мышечной массы, дыхательной недостаточности и кардиомиопатии, и это приводит кпреждевременной смерти 1. Заболевание вызвано отсутствием большого структурного дистрофина мышечного белка2. Мутации в DMD-гене на Х-хромосоме рецессивны, и болезнь поражает 1 из 3500-5000новорожденных самцов 3,,4,,5. Мутации часто большие удаления в области горячих точек между экзонами 44 и 55, которые приводят к искаженной раме чтения и преждевременной остановки кодонов, вызывая нонсенс-опосредованного распада и почти полное отсутствие белка дистрофина6,7,8. Рама чтения может быть исправлена с помощью антисенс олигонуклеотидов (AONs), которые вызывают отшелушивание пропуская и восстановить считывания кадра, частично восстанавливая экспрессию дистрофина и задержкипрогрессирования болезни 9,10,11. Морфолино AON eteplirsen, который недавно был одобрен Федеральным агентством по лекарственным наркотикам (FDA), вызывает пропуск exon 51 и может восстановить чтение кадра у пациентов с exon 52 удаления12,13. Тем не менее, exon 53 пропуск восстанавливает читальный каркас для пациентов с exon 52 удаления, и это потенциально может лечить около 10% пациентов DMD14. Морфолино АОН препарат NS-065/NCNP-01 было показано, чтобы вызвать exon 53 пропуская в клетках человека, и мы недавно ввели NS-065/NCNP-01 пациентам DMD в фазе 1 открытой этикетки доза эскалации клинических испытаний (hereinafter, называется "исследование") (зарегистрирован как UMIN: 000010964 и ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. Исследование показало, доза зависит увеличение exon 53 пропуск на основе RT-PCR и дистрофин белковых уровней на основе западной blotting, и никаких серьезных неблагоприятных событий наркотиков или отсеване наблюдалось 14.
Во всех клинических испытаниях анализ результатов имеет первостепенное значение. Для dmD клинических испытаний, дискуссия по-прежнему продолжается в отношении наилучшего метода, чтобы показать пользу лечения. Клинические тесты, такие как 6-минутный тест ходьбы имеют определенные недостатки. Молекулярная характеристика экспрессии дистрофина может быть выполнена с помощью нескольких методов, таких как RT-PCR, qPCR, digital-PCR, западная blotting, и иммуногистохимия. Тем не менее, степень восстановления экспрессии белка, которая необходима для придание клинической пользы остается неясным. В этой статье методов, мы описываем подробно RT-PCR и западные методы blotting, используемые для определения exon пропуская и уровни белка, соответственно, в фазе 1 испытания AON пропуская сна снадобья NS-065/NCNP-0114.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Takara</td>
			<td>3407A</td>
			<td>marker solution for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35436-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>21418-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15-2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#215; Loading Buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose ME</td>
			<td>Iwai chemical</td>
			<td>50013R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A41046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>05808-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centri-Sep 96-Well Plates</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Blocking Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>2922498000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Automated Electrophoresis Station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007010</td>
			<td>Microchip electrophoresis system A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007107JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Priming Station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Vortex Station II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Thick Blot Filter Paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EzBlot</td>
			<td>Atto</td>
			<td>AE-1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vial</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>1880 SV20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>17045-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histofine Simple Stain MAX PO</td>
			<td>Nichirei</td>
			<td>424151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Clear Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>mlp9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus)</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>NCL-DYS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>NCL-SPEC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EA03785BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LA0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oriole Fluorescent Gel Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physcotron Handy micro-homogenizer</td>
			<td>MICROTEC</td>
			<td>NS-310E3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>556463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN OneStep RT-PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>210212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31606-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-dry transfer machine</td>
			<td>Bio Craft</td>
			<td>41-1293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td>for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35430-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth Gum</td>
			<td>Wako</td>
			<td>200-02245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA Buffer</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>316-90025</td>
			<td>for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35907-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing exon skipping efficiency in dmd patient samples in clinical trials of antisense oligonucleotides

Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является дегенеративным заболеванием мышц, которое вызывает прогрессирующую потерю мышечной массы, что приводит к преждевременной смерти. Мутации часто вызывают искаженную рамку чтения и преждевременные остановки кодонов, что приводит к почти полному отсутствию белка дистрофина. Рама чтения может быть исправлена с помощью антисенс-олигонуклеотидов (AONs), которые вызывают отшелушивание пропуска. Морфолино AON viltolarsen (кодовое название: NS-065/NCNP-01) было показано, чтобы вызвать exon 53 пропуск, восстановление читальный каркас для пациентов с exon 52 удаления. Недавно мы ввели NS-065/NCNP-01 внутривенно пациентам DMD в исследовательском следователе, инициированном, первом в человеке испытании NS-065/NCNP-01. В этой статье методов, мы представляем молекулярную характеристику экспрессии дистрофина с помощью Сэнгера секвенирования, RT-PCR, и западные blotting в клинических испытаниях. Характеристика экспрессии дистрофина была основополагающей в исследовании для демонстрации эффективности, так как не были проведены функциональные тесты результатов.

Для использования RT-PCR для обнаружения exon пропуска, грунтовки по обе стороны от exon, которые будут пропущены были разработаны и оценены, чтобы дать только конкретные полосы (см. рисунок 2 для схематической диаграммы exon пропуска и грунтовки позиции). Праймеры должны генерировать продукты, которые можно легко отличить по размеру на системе MCE или нормальный электрофорез агароза гель, если MCE не доступен. Рисунок 3показывает MCE системы гель изображения RT-PCR реакций и секвенирования результатов пропущенной полосы от пациентов NS-03 и NS-07 до и после лечения NS-065/NCNP-01 в дозе эскалации фазы 1 суда. NS-03 и NS-07 гавани удаления, которые охватывают exons 45-52 и 48-52, соответственно. NS-03 получал 5 мг/кг и НС-07 20 мг/кг НС-065/НКНП-01 еженедельно в течение 12 недель. Как и ожидалось до лечения, оба пациента не показали пропуск, и только не пропустил полосу можно визуализировать. После 12 недель лечения, четкая пропущенная нижняя полоса была визуализирована для NS-07. Тем не менее, по-прежнему трудно обнаружить какой-либо пропущенный продукт для пациента NS-03. Результаты секвенирования показали конкатенацию экзонов 47 и 54 для НС-07, а также экзонов 44 и 54 для НС-03. Согласно последовательности, они теоретически могут производить функциональный, но укороченный дистрофин изоформ. Для расчета процентного пропуска, показанного на рисунке 3b,концентрация моляров для пропущенной полосы была разделена пропущенной и не пропущенной полосой. Для пациента NS-07 процент после лечения составил 72%, а для НС-03 – 3,4%. Западные данные помарки (в тройном) от пациентов NS-03, NS-07, и здоровый контроль показаны на рисунке 4a. Ожидается, что до начала лечения не было обнаружено ни одной полосы дистрофина. После лечения была обнаружена полоса от пациента NS-07 с более низким молекулярным весом по сравнению со здоровым контролем (дистрофин дикого типа имеет молекулярный вес 427 кДа, а дистрофин NS-07 имеет молекулярный вес 389 кДа). Из-за удаления экзона и пропуска, дистрофин из-за пациента NS-07 не хватало нескольких экзонов, и он должен был иметь более низкий молекулярный вес. Пациент NS-03 не показал обнаруживаемых уровней дистрофина после лечения. На рисунке 4bпоказано количество дистрофина по сравнению со здоровым контролем для пациента NS-07. Место, где были измерены интенсивности сигнала для расчета восстановления дистрофина, обозначено синими квадратами. Соотношение дистрофин спектрин был использован для расчета количества дистрофина по сравнению с здоровым контролем. С этой целью сигнал от дистрофина минус фон был разделен на сумму двух спектральных изоформ (длинных и коротких) минус фона (см. шаг 8.6.5). Соотношение для здорового контроля было установлено до 100%. Количество дистрофина по сравнению со здоровым контролем у пациента NS-07 после лечения составило 9,1%. Тем не менее, процент не может быть рассчитан для пациента NS-03 из-за слабой полосы дистрофина, который похож на те, которые получены для предварительного лечения образцов для обоих пациентов.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig1.jpg"> Рисунок 1: Схематическая диаграмма стека передачи для анализа западной помарки. Сборка западного стека передачи пятно с блоттинг бумаги пропитанной в blotting буфера в нижней части следуют blotting бумаги пропитанной blotting буфер B, PVDF мембраны, 3-8% Трис-Ацетат гель и на верхней 2 blotting документы пропитанной blotting буфер C показано. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig2.jpg"> Рисунок 2: Схематический рисунок exon пропуска exon 53 у пациента с удалением exon 45-52 в гене DMD. Например, пациент NS-03 в дозе эскалации клинических испытаний было это удаление. Если exon 53 сохраняется, мРНК будет из кадра, так как exon-exon соединение между exon 44 и 53 нарушает чтение кадра, в результате чего остановить кодон в exon 53. Рама чтения восстанавливается при пропущении exon 53 и производится более короткая изоформа дистрофина. Для обнаружения exon 53-пропуск RT-PCR, грунтовки в exon 44 и 54 используются так, что ПЦР-продукт между пропущенным и ООН-пропущенных мРНК можно легко обнаружить. FWD: вперед грунтовка, REV: обратный грунт, PMO: фосфородиамидат морфолино олигомер. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig3.jpg"> Рисунок 3: Пропуск эффективности для пациентов NS-03 и NS-07 из передних образцов биопсии мышц голени. a)Гель-изображение, генерируемое системой электрофореза А образцов RT-PCR необработанных и обработанных образцов у пациентов NS-03 и NS-07. Верхняя панель показывает NS-03 и нижнюю панель NS-07 в тройном. Для NS-03, НЕ-пропущенная полоса 422 bp, и пропущенная полоса 212 bp. Для NS-07 диапазоны 836 bp и 624 bp, соответственно. Анализ последовательности показал конкатенацию exon 44 и exon 54 для NS-03 и exon 47 к exon 54 для NS-07. б)Пропуск эффективности до и после лечения показан для пациентов NS-03 и NS-07, рассчитанный из моларной концентрации двух полос, предоставляемых системой A как пропущенная полоса/(пропущенная полоса и непровереная полоса) x 100. Эффективность пропуска NS-03 была очень низкой после лечения; для NS-07 эффективность пропуска составила более 70%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig4.jpg"> Рисунок 4: Белковая количественная оценка дистрофина изоформов до и после экзон пропуска терапии. а)Белковая количественная оценка дистрофиных изоформ до и после экзон-терапии. Западная помарка биопсии мышц от tibialis передней от пациентов NS-03 и NS-07 перед и после обработки и от здорового управления в тройном. Дистрофин можно увидеть на 427 kDa для здорового контроля и на 389 kDa для NS-07 после лечения. Дистрофин не может быть обнаружен ни для пациента до лечения, ни один из них не может быть обнаружен после лечения пациента NS-03. Область в черном ящике показана на рисунке 4b. Слева в каждой помарке отображается маркер. б)Количество дистрофина восстановлено после лечения пациента НС-07. Восстановление дистрофина было рассчитано на основе интенсивности полос для дистрофина, фона, а также длинной и короткой изоформы спектрина по формуле: (дистрофин - фон)/(спектррин L-фон) - (спектрин S - фон), где соотношение для здорового контроля установлено до 100%. Интенсивность каждой полосы измерялась внутри синих коробок, показанных на рисунке. Восстановление дистрофина для NS-07 составило 9,1% после лечения. Сигнал дистрофина был слишком слаб, чтобы измерять в необработанных образцах. Размеры маркеров показаны в килодальтонах. Дис: Дистрофин, BG: фон, SL: Спектрин длинный изоформ, СС: Спектрин короткий изоформ, Мой: Миозин типа 1. Размеры маркеров показаны в килодальтонах. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Решение</td>
			<td>Объем/Реакция (ол)</td>
			<td>Окончательная концентрация</td>
		</tr>
<tr>
<td>Вода без RNase (предоставлена)</td>
			<td>Переменной</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>5x ЗИАГЕН OneStep RT-PCR буфер</td>
			<td>5.0</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP Mix (содержащий 10 мМ каждого dNTP)</td>
			<td>1.0</td>
			<td>400 МКМ каждого dNTP</td>
		</tr>
<tr>
<td>Форвард Праймер (10 МКМ)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0,6 МКМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Обратный праймер (10 МКМ)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0,6 МКМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>ЗИАГЕН Онстеп RT-PCR Фермент микс</td>
			<td>1.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ингибитор RNase (необязательно)</td>
			<td>Переменной</td>
			<td>5-10 единиц/реакция</td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаблон РНК</td>
			<td>50 нг</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Общая</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Реагенты RT-PCR. Необходимые соединения для одной реакции RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Грунтовка</td>
			<td>Последовательности</td>
		</tr>
<tr>
<td>44F</td>
			<td>5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>46F</td>
			<td>5'-AACCTGGAAAAGAGCAGCAA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>48F</td>
			<td>5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54/55R</td>
			<td>5'-TCTCGCTCCACCCTTTT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54R</td>
			<td>5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: Список праймеров. Последовательности для грунтовки, используемые в этом исследовании. Ф: Вперед, Р: Обратно.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 цикл</td>
			<td>Обратная транскрипция</td>
			<td>30 мин.</td>
			<td>50 КК</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 цикл</td>
			<td>Первоначальный шаг активации ПЦР</td>
			<td>15 мин.</td>
			<td>95 КК</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">35 циклов</td>
			<td>Денатурация</td>
			<td>1 мин.</td>
			<td>94 КК</td>
		</tr>
<tr>
<td>Отжига</td>
			<td>1 мин.</td>
			<td>60 КК</td>
		</tr>
<tr>
<td>Расширение</td>
			<td>1 мин.</td>
			<td>72 КК</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 цикл</td>
			<td>Окончательное продление</td>
			<td>7 мин.</td>
			<td>72 КК</td>
		</tr>
<tr>
<td>Держать</td>
			<td></td>
			<td>∞</td>
			<td>4 КК</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 3: PCR условный используется. Показать условия ПЦР для реакции RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Решение</td>
			<td>Объем/Реакция (ол)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Вода без RNase</td>
			<td>Переменной</td>
		</tr>
<tr>
<td>BigDye Терминатор 3.1 Готовый микс реакции</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Форвард Праймер/Обратный Праймер (3,2 МКМ)</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаблон РНК</td>
			<td>20 нг</td>
		</tr>
<tr>
<td>Общая</td>
			<td>20</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 4: Реагенты, необходимые для секвенирования реакции. Используйте либо вперед или обратный грунтовка в установке, а не оба в то же время.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 цикл</td>
			<td>1 мин.</td>
			<td>96 КК</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">25 циклов</td>
			<td>10 с</td>
			<td>96 КК</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 с</td>
			<td>50 КК</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 мин.</td>
			<td>60 КК</td>
		</tr>
<tr>
<td>Держать</td>
			<td>∞</td>
			<td>4 КК</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 5: Условия ПЦР для последовательности Sanger.

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides at JoVE.com

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

Здесь мы представляем молекулярную характеристику экспрессии дистрофина 38 с помощью секвенирования Сэнгера, RT-PCR и западного блата в клинических испытаниях.

Характеристика Exon Пропуск эффективность в DMD пациент образцов в клинических испытаниях антисенс олигонуклеотидов

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Этот протокол содержит стандартизированную методологию подготовки и обработки мышечной ткани в доклинических условиях и клинических испытаниях, что важно для получения надежных результатов в области DMD. Методы актуальны для exon пропуска tryouts для DMD. И главное преимущество в том, что они хорошо зарекомендовали себя и воспроизводимы, если осуществляться коллективно.Эти методы в основном сосредоточены на exon пропуска в DMD, но с изменением грунтовки, те же методы могут быть применены к другим заболеваниям, обработанным сращивания терапии. Эти методы могут быть использованы для достижения экзон пропуская эффективность как РНК и белка. Чтобы подготовить образец для анализа, сначала смешайте равные объемы трагакантовой резинки и воды, пока жвачка не станет мягкой и липкой.Загрузите эту смесь в 25 миллилитровых шприцев и вылейте от 0,5 до одного сантиметра жвачки на отдельные пробковые диски. Этикетка дисков на противоположной стороне и поместите контейнер изопентан в жидкий азот, пока некоторые из жидкости замерзает. Поместите каждый образец в трагакантовую резинку на дисках с продольной оси каждой мышцы перпендикулярно пробке.Поместите резинку вокруг в нижней части каждой мышцы, чтобы помочь держать мышцы на месте, и использовать пинцет, чтобы заморозить образцы в холодной изопентан. Перемещение образцов непрерывно в течение одной минуты или до полного замораживания, прежде чем поместить их временно на сухой лед. Затем поместите образцы в стеклянные флаконы для хранения 80 градусов по Цельсию.Для раздела замороженных мышечной ткани для анализа, установить криостат к рабочей температуре 25 градусов по Цельсию, и смонтировать мышечный блок на держатель. Обрежьте блок ткани до тех пор, пока не будут достигнуты плоские секции. Для обратной транскриптазы ПЦР и западного анализа помарки, получить 10 микрометров толщиной ломтиками.Для иммуногистохимического анализа, получить от шести до восьми микрометров толщиной ломтиками, а для гематоксилина и эозина окрашивания, получить от 10 до 12 микрометров толщиной ломтиками. После их приобретения поместите нарезанные секции в две миллилитровые трубки. Храните образцы для ПЦР и западной blotting при 80 градусов по Цельсию.Здесь показаны система электрофореза микрочипа, гель-изображения реакций обратной транскриптазы ПЦР и результаты секвенирования пропущенной полосы от двух пациентов до и после лечения антисенс-олигонуклеотидом в фазе эскалации дозы первого исследования. Оба пациента гавани удаления. Как и ожидалось, перед лечением, оба пациента показали, не пропуская и только не пропустил полоса может быть визуализирована.После 12 недель лечения, четкая пропущенная нижняя полоса была визуализирована для второго пациента, однако, было все еще трудно обнаружить любой пропущенный продукт для первого пациента. Результаты секвенирования показали конкатенацию экзонов 47 и 54 для второго пациента, и экзонов, 44 и 54 для первого пациента. Для расчета пропущенного процента концентрация моляров для пропущенной полосы была разделена пропущенными и неотрековатыми полосами.Как и ожидалось, до начала лечения западной помарки не было обнаружено ни одной дистрофии. После лечения, полоса была обнаружена у второго пациента с более низким молекулярным весом по сравнению с тем, что наблюдается в здоровом контроле. Первый пациент, однако, не показал никаких обнаруживаемых уровней дистрофина после лечения.Очень важно правильно обрабатывать мышечную ткань и последовательно поставить каждый образец на трагакантовую резинку. Разделы тканей могут быть проанализированы различными способами, в том числе искусственные ПЦР, цифровой ПЦР, Западная помарка, иммуногистохимия, и с различными типами омиков. Эти методы могут быть ускорены, развитие, дополнительные exon пропуск наркотиков ориентации различных экзонов, и могут быть применены к разработке вирусных основе и снова в редактировании для DMD.

Research

JoVE Journal

Medicine

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Замедленное высвобождение доставка лекарств через Elvax 40 Вт в сетчатке крыс: последствия для лечения хронических условий

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

микроРНК экспрессии анализ рака предстательной железы Клинические тканей

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Multi-пропуск экзонов Использование Коктейль антисмысловые олигонуклеотиды в собачьих Х-хромосомой мышечной дистрофии

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Объективное Deep секвенирование РНК вирусов из клинических образцов

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

Стратегий выборки и обработки образцов ткани биобанка из свинины биомедицинской модели

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Collecting Hair Samples for Hair Cortisol Analysis in African Americans

Сбор образцов волос для анализа волос кортизола в африканских американцах

The hormone cortisol is typically assessed in saliva, serum, or urine samples. More recently, cortisol has been successfully extracted from hair, ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

Оценка экзона включение индуцированных сращивания переключения антисмысловых олигонуклеотидов в фибробластов SMA пациента

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Количественный :18F-Naf-PET-МРТ Анализ для оценки динамического оборота костей у пациента с facetogenic Низкая боль в спине

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Индуцирование и характеристика везикулярного стеатоза в дифференцированных клетках гепаррг

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Использование химической биопсии для оценки качества трансплантата

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...