Name: characterizing exon skipping efficiency in dmd patient samples in clinical trials of antisense oligonucleotides
Uploaded: 2020-05-07T13:00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides at JoVE.com

Agradecemos al Dr. Takashi Saito, al Dr. Tetsuya Nagata, al Sr. Satoshi Masuda y al Dr. Eri Takeshita para su debate científico.

<ol>
	<li>Bushby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+Duchenne+muscular+dystrophy,+part+2:+implementation+of+multidisciplinary+care.">Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care.</a> Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51 (6), 919-928 (1987).</li><li>Mendell, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+amounts+of+dystrophin+produced+by+skipping+the+mutated+exon+in+the+mdx+dystrophic+mouse.">Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse.</a> Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).</li><li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+systemic+morpholino+exon-skipping+in+Duchenne+dystrophy+dogs.">Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs.</a> Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).</li><li>Kesselheim, A. S., Avorn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approving+a+Problematic+Muscular+Dystrophy+Drug:+Implications+for+FDA+Policy.">Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).</li><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eteplirsen+for+the+treatment+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).</li><li>Komaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+the+antisense+oligonucleotide+NS-065/NCNP-01+for+skipping+of+exon+53+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy.">Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).</li><li>Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Droplet+PCR+for+the+Absolute+Quantification+of+Exon+Skipping+Induced+by+Antisense+Oligonucleotides+in+(Pre-)Clinical+Development+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> PLoS One. 11 (9), e0162467 (2016).</li><li>Takizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Duchenne+muscular+dystrophy+in+MYOD1-converted+urine-derived+cells+treated+with+3-deazaneplanocin+A+hydrochloride.">Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3807 (2019).</li></ol>

Los ensayos clínicos de DMD han producido éxitos y fracasos en los últimos años. Tanto RT-PCR como la hinchazón occidental son técnicas comunes para evaluar la eficiencia de salto generada por los compuestos exones-salto administrados a los pacientes. Sin embargo, RT-PCR se ha informado de sobreestimar la eficiencia de omisión en comparación con pcR digital15. Aunque esto se debe a una serie de razones, es causada principalmente por la amplificación más eficiente de los fragmentos saltados más pequeños durante los ciclos de PCR. Parece que RT-PCR utilizado en este ensayo clínico también generó mayores eficiencias de omisión en comparación con la expresión de proteína estimada por la hinchazón occidental. Según la FDA, esta es una manera más confiable de cuantificar la restauración de la distrofina12. Por lo tanto, se debe tener precaución al interpretar los resultados de saltar RT-PCR; sin embargo, las muestras todavía se pueden comparar. Las muestras que muestran mayores eficiencias de omisión basadas en los resultados de RT-PCR comúnmente exhbit niveles más altos de expresión de proteínas en los análisis de manchas occidentales.
Dado que todos los pacientes en ensayos clínicos de DMD no tienen el mismo patrón de eliminación, puede ser difícil diseñar imprimaciones y sondas que sean adecuadamente específicas para realizar digitales o qPCR en todas las muestras. Por lo tanto, RT-PCR sigue siendo una buena alternativa para una primera evaluación de la eficiencia de omisión. Antes de que comenzara el ensayo clínico de NS-065/NCNP-01, era tedioso evaluar la eficiencia de omisión para cada paciente in vitro, ya que una biopsia muscular o de piel era obligatoria para generar mioblastos específicos del paciente. Sin embargo, recientemente hemos publicado una novedosa técnica para generar células derivadas de orina (UDC) convertidas por MYOD1 específicas del paciente como un novedoso modelo de células musculares DMDmodelo 16. Por lo tanto, sólo se requiere orina del paciente para generar los mióblastos, y no es necesario ningún procedimiento invasivo. Creemos que este método se puede utilizar para detectar diferentes AONs en células específicas del paciente. Además, se pueden probar diferentes imprimaciones y sondas antes de que el paciente comience cualquier ensayo clínico. Esto puede facilitar el uso de qPCR o PCR digital para la medición de saltos exones en ensayos clínicos de DMD en el futuro.
Para realizar análisis de manchas occidentales en este ensayo clínico, se utilizó un solo anticuerpo contra la distrofina, y solo se utilizó un control saludable como muestra de referencia. Por lo tanto, la especificidad del anticuerpo no se validó adecuadamente. Esto, junto con el hecho de que el anticuerpo sólo reconoce el dominio C-terminal de la distrofina, es una limitación del protocolo. Más controles saludables y anticuerpos dirigidos contra diferentes dominios de la molécula de distrofina son recomendables en el futuro.
Aquí, resumimos los protocolos que se utilizaron en el reciente ensayo exploratorio iniciado por el investigador, primero en humanos de NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 es potencialmente aplicable al 10,1% de los pacientes con DMD.

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular degenerativa que causa pérdida progresiva de masa muscular, insuficiencia respiratoria y miocardiopatía, y conduce a la muerte prematura1. La enfermedad es causada por la falta de la gran distrofina de proteína muscular estructural2. Las mutaciones en el gen DMD en el cromosoma X son recesivas, y la enfermedad afecta a 1 de cada 3500-5000 varones recién nacidos3,,4,,5. Las mutaciones son a menudo grandes deleciones en una región de puntos críticos entre los exones 44 y 55 que conducen a un marco de lectura distorsionado y codones de parada prematura, causando descomposición mediada sin sentido y una falta casi total de proteína distrofina6,,7,,8. El marco de lectura se puede corregir utilizando oligonucleótidos antisrés (AON) que inducen la omisión de exón y restauran el marco de lectura, restaurando parcialmente la expresión de la distrofina y retrasando la progresión de la enfermedad9,,10,,11. El morpholino AON eteplirsenn, que fue aprobado recientemente por la Agencia Federal de Medicamentos (FDA), induce la falta del exón 51 y puede restaurar el marco de lectura en pacientes con exón 52 deleciones12,,13. Sin embargo, exón 53 saltar restaura el marco de lectura para los pacientes con exón 52 deleciones, y potencialmente puede tratar aproximadamente 10% de los pacientes con DMD14. Se ha demostrado que el fármaco morpholino AON NS-065/NCNP-01 induce el exón 53 saltando en células humanas, y recientemente administramos NS-065/NCNP-01 a pacientes con DMD en un ensayo clínico de fase 1 de escalamiento de dosis de etiqueta abierta (en adelante, denominado "el estudio") (registrado como UMIN: 000010964 y ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. El estudio mostró un aumento dependiente de la dosis de exón 53 omitiendo basado en los niveles de RT-PCR y proteína distrofina basado en la hinchazón occidental, y no se observaron eventos adversos graves o deserciones14.
En todos los ensayos clínicos, el análisis de los resultados es de suma importancia. Para los ensayos clínicos de DMD, todavía está en curso un debate sobre el mejor método para mostrar un beneficio de tratamiento. Las pruebas clínicas, como la prueba de caminata de 6 minutos, tienen ciertos inconvenientes. La caracterización molecular de la expresión de distrofina se puede realizar utilizando varios métodos, tales como RT-PCR, qPCR, digital-PCR, hinchazón occidental, e inmunohistoquímica. Sin embargo, el grado de restauración de la expresión proteica que se requiere para impartir un beneficio clínico sigue sin estar claro. En este artículo de métodos, describimos en detalle los métodos RT-PCR e hinchazón occidental utilizados para determinar los niveles de saltos de exones y proteínas, respectivamente, en el ensayo de fase 1 del AON que omite el fármaco NS-065/NCNP-0114.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Takara</td>
			<td>3407A</td>
			<td>marker solution for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35436-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>21418-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15-2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#215; Loading Buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose ME</td>
			<td>Iwai chemical</td>
			<td>50013R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A41046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>05808-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centri-Sep 96-Well Plates</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Blocking Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>2922498000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Automated Electrophoresis Station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007010</td>
			<td>Microchip electrophoresis system A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007107JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Priming Station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Vortex Station II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Thick Blot Filter Paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EzBlot</td>
			<td>Atto</td>
			<td>AE-1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vial</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>1880 SV20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>17045-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histofine Simple Stain MAX PO</td>
			<td>Nichirei</td>
			<td>424151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Clear Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>mlp9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus)</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>NCL-DYS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>NCL-SPEC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EA03785BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LA0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oriole Fluorescent Gel Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physcotron Handy micro-homogenizer</td>
			<td>MICROTEC</td>
			<td>NS-310E3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>556463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN OneStep RT-PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>210212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31606-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-dry transfer machine</td>
			<td>Bio Craft</td>
			<td>41-1293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td>for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35430-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth Gum</td>
			<td>Wako</td>
			<td>200-02245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA Buffer</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>316-90025</td>
			<td>for MultiNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>35907-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing exon skipping efficiency in dmd patient samples in clinical trials of antisense oligonucleotides

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular degenerativa que causa pérdida progresiva de la masa muscular, lo que conduce a la muerte prematura. Las mutaciones a menudo causan un marco de lectura distorsionado y codones de parada prematura, lo que resulta en una falta casi total de proteína distrofina. El marco de lectura se puede corregir utilizando oligonucleótidos antisrés (AON) que inducen la omisión de exón. Se ha demostrado que el morfolino AON viltolarsen (nombre en clave NS-065/NCNP-01) induce el exón 53 saltándose, restaurando el marco de lectura para pacientes con deleciones exón 52. Recientemente administramos NS-065/NCNP-01 por vía intravenosa a pacientes con DMD en un ensayo exploratorio iniciado por investigador, primero en humano de NS-065/NCNP-01. En este artículo de métodos, presentamos la caracterización molecular de la expresión de distrofina usando la secuenciación de Sanger, RT-PCR, y la hinchazón occidental en el ensayo clínico. La caracterización de la expresión de distrofina fue fundamental en el estudio para mostrar la eficacia ya que no se realizaron pruebas de resultados funcionales.

Para utilizar RT-PCR para detectar saltos de exón, los imprimadores a ambos lados del exón que se omitirán se diseñaron y evaluaron para producir solo bandas específicas (consulte la Figura 2 para obtener un diagrama esquemático de saltos de exón y posición de imprimación). Las imprimaciones deben generar productos que se puedan distinguir fácilmente por el tamaño en un sistema MCE o electroforesis de gel de agarosa normal si MCE no está disponible. Figura 3a muestrael sistema MCE Imágenes de gel de reacciones RT-PCR y los resultados de secuenciación de la banda omitida de los pacientes NS-03 y NS-07 antes y después del tratamiento con NS-065/NCNP-01 en el ensayo de fase 1 de escala de dosis. NS-03 y NS-07 harbor eliminaciones que abarcan exons 45-52 y 48-52, respectivamente. NS-03 recibió 5 mg/kg y NS-07 20 mg/kg de NS-065/NCNP-01 semanalmente durante 12 semanas. Como se esperaba antes del tratamiento, ambos pacientes no mostraban saltar, y sólo se podía visualizar una banda no omitida. Después de 12 semanas de tratamiento, se visualizó una banda inferior clara omitida para NS-07. Sin embargo, todavía era difícil detectar cualquier producto omitido para el paciente NS-03. Los resultados de la secuenciación mostraron una concatenación de exones 47 y 54 para NS-07, así como exones 44 y 54 para NS-03. Según la secuencia, estos teóricamente podrían producir una isoforma de distrofina funcional pero acortada. Para calcular el porcentaje de omisión que se muestra en la Figura 3b, la concentración molar de la banda omitida se dividió por la banda omitida y no omitida. Para el paciente NS-07, el porcentaje después del tratamiento fue del 72%, y fue del 3,4% para NS-03. Los datos de western blot (en triplicado) de los pacientes NS-03, NS-07, y un control saludable se muestran en la Figura 4a. Se esperaba que no se detectara ninguna banda de distrofina antes del tratamiento. Después del tratamiento se detectó una banda del paciente NS-07 con un menor peso molecular en comparación con un control saludable (la distrofina de tipo salvaje tiene un peso molecular de 427 kDa, y la distrofina NS-07 tiene un peso molecular de 389 kDa). Debido a la deleción y saltos de exones, la isoforma de la distrofina del paciente NS-07 carecía de varios exones, y se esperaba que tuviera un menor peso molecular. El paciente NS-03 no mostró niveles detectables de distrofina después del tratamiento. En la Figura 4b, se muestra la cantidad de distrofina en comparación con un control saludable para el paciente NS-07. La ubicación donde se midieron las intensidades de la señal para el cálculo de la restauración de la distrofina se indican con cuadrados azules. La relación de espectrina de distrofina se utilizó para calcular la cantidad de distrofina en comparación con la del control saludable. Con este fin, la señal del fondo distrofina menos se dividió por la suma de las dos isoformas de spectrin (largo y corto) menos el fondo (véase el paso 8.6.5). La relación de control saludable se estableció en 100%. La cantidad de distrofina en comparación con el control saludable en el paciente NS-07 después del tratamiento fue del 9,1%. Sin embargo, el porcentaje no se pudo calcular para el paciente NS-03 debido a una banda de distrofina débil, que similar a las obtenidas para muestras de tratamiento previas para ambos pacientes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig1.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático de la pila de transferencia para el análisis de manchas occidentales. Montaje de la pila de transferencia de manchas occidentales con papel hinchado empapado en el tampón A en la parte inferior seguido de papel hinchado empapado en el tampón B, membrana PVDF, el 3-8% Tris-Acetate Gel y en la parte superior 2 papeles de hinchazón empapados en el tampón C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig2.jpg"> Figura 2: Dibujo esquemático de exón omitiendo el exón 53 en un paciente con deleción de exón 45-52 en el gen DMD. Por ejemplo, el paciente NS-03 en el ensayo clínico de aumento de dosis tuvo esta deleción. Si se conserva el exón 53, el ARNm estará fuera de la trama ya que la unión exón-exón entre el exón 44 y el 53 interrumpe el marco de lectura, causando un codón de parada en el exón 53. El marco de lectura se restaura cuando se omite el exón 53, y se produce una isoforma más corta de distrofina. Para detectar exón 53-skipping por RT-PCR, se utilizan imprimaciones en exón 44 y 54 para que el producto PCR entre el ARNm omitido y no saltado pueda detectarse fácilmente. FWD: imprimación delantera, REV: imprimación inversa, PMO: fósforodamidate morpholino oligómero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig3.jpg"> Figura 3: Saltar la eficiencia para los pacientes NS-03 y NS-07 de las muestras de biopsia muscular anterior tibialis. a) Imagen de gel generada por el sistema de electroforesis A de muestras RT-PCR de muestras no tratadas y tratadas de pacientes NS-03 y NS-07. El panel superior muestra NS-03 y el panel inferior NS-07 en triplicado. Para NS-03, la banda no saltada es 422 bp, y la banda omitida es 212 bp. Para NS-07, las bandas son 836 bp y 624 bp, respectivamente. El análisis de secuencia mostró una concatenación de exón 44 y exón 54 para NS-03 y exón 47 a exón 54 para NS-07. b) Se muestra la eficiencia de omisión antes y después del tratamiento para los pacientes NS-03 y NS-07, calculado a partir de la concentración molar de las dos bandas proporcionadas por el sistema A como banda omitida/(banda omitida + banda no saltada) x 100. La eficiencia de salto para NS-03 fue muy baja después del tratamiento; para NS-07, la eficiencia de salto fue superior al 70%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig4.jpg"> Figura 4: Cuantificación de proteínas de las isoformas de la distrofina antes y después de que el exón omita la terapia. a) Cuantificación de proteínas de isoformas distrofinas antes y después de la terapia de exón omitiendo la terapia. Mancha occidental de biopsia muscular de tibialis anterior de los pacientes NS-03 y NS-07 antes y después del tratamiento y de control saludable en triplicado. La distrofina se puede ver a 427 kDa para el control saludable y a 389 kDa para NS-07 después del tratamiento. No se pudo detectar distrofina para ninguno de los pacientes antes del tratamiento, o tampoco se pudo detectar después del tratamiento para el paciente NS-03. El área de la caja negra se muestra en la Figura 4b. A la izquierda en cada mancha se muestra el marcador. b) La cantidad de distrofina restaurada después del tratamiento para el paciente NS-07. La restauración de la distrofina se calculó sobre la base de las intensidades de las bandas para la distrofina, el fondo, y la isoforma larga y corta de la espectrota según la fórmula: (distrofina - fondo)/(espectro L -fondo) + (espectro S - fondo) donde la relación para el control saludable se establece en 100%. La intensidad de cada banda se midió dentro de las cajas azules que se muestran en la figura. La restauración de la distrofina para NS-07 fue del 9,1% después del tratamiento. La señal de distrofina era demasiado débil para medir en las muestras no tratadas. Los tamaños de los marcadores se muestran en kilodaltons. Didárate: Distrofina, BG: fondo, SL: Isoforma larga de Spectrin, SS: Isóforma corta Spectrin, Mi: Miosina tipo 1. Los tamaños de los marcadores se muestran en kilodaltons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Solución</td>
			<td>Volumen/Reacción (l)</td>
			<td>Concentración final</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua libre de RNase (siempre)</td>
			<td>Variable</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer</td>
			<td>5.0</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP Mix (que contiene 10 mM de cada dNTP)</td>
			<td>1.0</td>
			<td>400 M de cada dNTP</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imprimación delantera (10 m)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0,6 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imprimación inversa (10 m)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0,6 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>QIAGEN OneStep RT-PCR Mezcla de enzimas</td>
			<td>1.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inhibidor de la RNase (opcional)</td>
			<td>Variable</td>
			<td>5–10 unidades/reacción</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plantilla ARN</td>
			<td>50 ng</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Reactivos RT-PCR. Los compuestos necesarios para una reacción del RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cartilla</td>
			<td>Secuencia</td>
		</tr>
<tr>
<td>44F</td>
			<td>5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>46F</td>
			<td>5'-AACCTGGAAAAGAGCAGCAA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>48F</td>
			<td>5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54/55R</td>
			<td>5'-TCTCGCTCACTCACCCTTTT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54R</td>
			<td>5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Lista de primer plano. Secuencias para las imprimaciones utilizadas en este estudio. F: Adelante, R: Invertir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 ciclo</td>
			<td>Transcripción inversa</td>
			<td>30 min</td>
			<td>50 oC</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ciclo</td>
			<td>Paso inicial de activación de PCR</td>
			<td>15 min</td>
			<td>95 oC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">35 ciclos</td>
			<td>Desnaturalización</td>
			<td>1 min</td>
			<td>94 oC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Recocido</td>
			<td>1 min</td>
			<td>60 oC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extensión</td>
			<td>1 min</td>
			<td>72 oC</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ciclo</td>
			<td>Extensión final</td>
			<td>7 min</td>
			<td>72 oC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mantener</td>
			<td></td>
			<td>∞</td>
			<td>4 oC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: PCR acondicionado utilizado. Mostrar las condiciones de PCR para la reacción RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Solución</td>
			<td>Volumen/Reacción (l)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua sin RNase</td>
			<td>Variable</td>
		</tr>
<tr>
<td>BigDye Terminator 3.1 Ready Reaction Mix</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer delantero/Primer inverso (3,2 m)</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plantilla ARN</td>
			<td>20 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td>20</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 4: Reactivos necesarios para la reacción de secuenciación. Utilice la imprimación forward o Reverse en la configuración, no ambas al mismo tiempo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 ciclo</td>
			<td>1 min</td>
			<td>96 oC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">25 ciclos</td>
			<td>10 s</td>
			<td>96 oC</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 s</td>
			<td>50 oC</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 min</td>
			<td>60 oC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mantener</td>
			<td>∞</td>
			<td>4 oC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 5: Condiciones de PCR para la secuenciación de Sanger.

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Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

Aquí, presentamos la caracterización molecular de la expresión de la distrofina 38 usando la secuenciación de Sanger, RT-PCR, y la hinchazón occidental en el ensayo clínico.

Caracterización de exón omitiendo la eficiencia en muestras de pacientes dmd en ensayos clínicos de oligonucleótidos antisales

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Este protocolo proporciona una metodología estandarizada para la preparación y manipulación de tejido muscular en entornos preclínicos y ensayos clínicos, que es importante para obtener resultados confiables dentro del campo dmD. Las técnicas son relevantes para omitir las pruebas de exón para DMD. Y la principal ventaja es que, están bien establecidos y reproducibles si se llevan a cabo colectivamente.Estas técnicas se centran principalmente en la omisión de exones en DMD, pero con un cambio de imprimaciones, se pueden aplicar las mismas técnicas a otras enfermedades tratadas con terapias de empalme. Estos métodos se pueden utilizar para lograr la eficiencia de salto de exón tanto como el ARN y la proteína. Para preparar una muestra para el análisis, primero mezcle volúmenes iguales de goma de tragacanto y agua hasta que la encía se vuelva suave y pegajosa.Cargue esta mezcla en jeringas de 25 mililitros y dispense de 0,5 a un centímetro de goma en discos de corcho individuales. Etiquete los discos en el lado opuesto y coloque un recipiente de isopentano en nitrógeno líquido hasta que parte del líquido se congele. Coloque cada espécimen en la encía del tragacanto en los discos con un eje longitudinal de cada músculo perpendicular al corcho.Coloque la goma alrededor de la parte inferior de cada músculo para ayudar a mantener el músculo en su lugar, y utilice pinzas para congelar las muestras en el isopentano frío. Mueva los especímenes continuamente durante un minuto o hasta que estén completamente congelados antes de colocarlos temporalmente sobre hielo seco. A continuación, coloque los especímenes en viales de vidrio para un almacenamiento de 80 grados centígrados.Para secuestre el tejido muscular congelado para su análisis, establezca un criostato a una temperatura de trabajo de 25 grados Celsius, y para montar el bloque muscular en el soporte. Recorte el bloque de tejido hasta que se logren secciones planas. Para el análisis de la transcriptasa inversa PCR y Western blot, obtenga rodajas gruesas de 10 micrómetros.Para el análisis inmunohistoquímico, obtener rodajas de seis a ocho micrómetros de espesor, y para la tinción de hematoxilina y eosina, obtener rodajas de 10 a 12 micrómetros de espesor. Después de su adquisición, coloque las secciones cortadas en dos tubos mililitros. Almacene las muestras para PCR e hinchazón occidental a 80 grados centígrados.Aquí, se muestran el sistema de electroforesis de microchip, un gel de imágenes de reacciones de PCR de transcriptasa inversa y los resultados de secuenciación de la banda omitida de dos pacientes antes y después del tratamiento con un oligonucleótido antisorés en una fase de aumento de dosis de un ensayo. Ambos pacientes albergan deleciones. Como era de esperar, antes del tratamiento, ambos pacientes no mostraron saltos y sólo se podía visualizar una banda no omitida.Después de 12 semanas de tratamiento, se visualizó una banda inferior clara omitida para el segundo paciente, sin embargo, todavía era difícil detectar cualquier producto omitido para el primer paciente. Los resultados de la secuenciación mostraron una concatenación de exones 47 y 54 para el segundo paciente, y exones, 44 y 54 para el primer paciente. Para calcular el porcentaje omitido, la concentración molar para la banda omitida se dividió por las bandas omitidas y no desfaladas.Como era de esperar, ninguna banda de distrofina fue detectada por Western blot antes del tratamiento. Después del tratamiento, se detectó una banda del segundo paciente con un menor peso molecular en comparación con la observada en el control saludable. El primer paciente, sin embargo, no mostró niveles detectables de distrofina después del tratamiento.Es fundamental manejar el tejido muscular correctamente, y colocar cada espécimen en la encía del tragacanto de manera consistente. Las secciones de tejido se pueden analizar de varias maneras diferentes, incluyendo artificial a PCR, PCR digital, mancha occidental, inmunohistoquímica, y con diferentes tipos de omics. Estas técnicas se pueden acelerar, el desarrollo, exón adicional omitiendo medicamentos dirigidos a diferentes exones, y se pueden aplicar al desarrollo de la base viral y de nuevo en la edición de DMD.

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