Name: ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Jules Morin for indsigtsfulde kommentarer til manuskriptet. Denne forskning blev finansieret af Awards fra CADASIL sammen har vi håbet non-profit organisation, Center for Women's Health and Research, og NHLBI R01HL136636 (FD).

Alle eksperimenter blev godkendt af den institutionelle dyrepleje og brug udvalg (IACUC) af University of Colorado, Anschutz Medical campus og blev udført i henhold til retningslinjerne fra National Institutes of Health.
1. løsninger
<ol><li>Brug MOPS-Buffered saltvand til dissektion og til at holde prøverne ved 4 °C før deres udnyttelse. Opløsningen må ikke gas. Forbered MOPS bufferet saltvand med følgende sammensætning: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2po4, 1 m...

<ol>
	<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex.">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+fragile+aspects+of+cortical+blood+flow+in+relation+to+the+underlying+angioarchitecture.">Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+Myogenic+Tone,+and+Vasodilator+Responses+in+Middle+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles:+Effect+of+Ischemia+and+Reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li><li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization.">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels.">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors,+calcium+signaling,+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation.">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li><li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles+with+Aging:+Role+of+Rho+Kinase+2+and+Impact+of+Genetic+Background.">Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+smallest+stroke:+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit.">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).</li><li>Koide, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+KV+channels+in+cerebral+small+vessel+pathologies.">The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).</li><li>Girouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+endfoot+Ca2++and+BK+channels+determine+both+arteriolar+dilation+and+constriction.">Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2,+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent,+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles.">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).</li><li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K++channel+function.">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).</li><li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+TRPV3+channel+Ca2++influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).</li><li>Johnson, A. C., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+hippocampal+arteriole+structure+and+function+in+a+rat+model+of+preeclampsia:+Potential+role+in+impaired+seizure-induced+hyperemia.">Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).</li><li>Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+impairment+in+spontaneously+hypertensive+rats+is+associated+with+hippocampal+hypoperfusion+and+hippocampal+vascular+dysfunction.">Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. , (2019).</li><li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurovascular+Unit+Coming+of+Age:+A+Journey+through+Neurovascular+Coupling+in+Health+and+Disease.">The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease.</a> Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).</li><li>Roy, C. S., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Regulation+of+the+Blood-supply+of+the+Brain.">On the Regulation of the Blood-supply of the Brain.</a> The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).</li><li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+K+-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow.">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+GqPCR+activity+controls+capillary+electrical+signaling+and+brain+blood+flow+through+PIP2+depletion.">Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+depletion+promotes+TRPV4+channel+activity+in+mouse+brain+capillary+endothelial+cells.">PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells.</a> eLife. 7, 351 (2018).</li><li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+description+of+membrane+current+and+its+application+to+conduction+and+excitation+in+nerve.">A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.</a> The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).</li><li>Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potentials+and+microenvironment+of+rat+dorsal+vagal+cells+in+vitro+during+energy+depletion.">Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion.</a> The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).</li><li>Filosa, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+potassium+signaling+couples+neuronal+activity+to+vasodilation+in+the+brain.">Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).</li><li>Attwell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow.">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li><li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+patterns+of+the+rat+hippocampal+formation.">Vascular patterns of the rat hippocampal formation.</a> Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).</li><li>Wang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+the+K(ir)2+family+of+inward+rectifier+potassium+channels+by+a+small+molecule+probe:+the+discovery,+SAR,+and+pharmacological+characterization+of+ML133.">Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133.</a> ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).</li><li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles.">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li><li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure.">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li><li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus.">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis,+potentially+impacting+cognitive+functions.">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li><li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation.">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li></ol>

Det trykbærende hicapa (hippocampus kapillar-parenkymal arteriole), der er beskrevet i dette manuskript, er en udvidelse af vores veletablerede procedure til at isolere, under tryk og studere parenkymal arterioler29. Vi rapporterede for nylig, at KIR 2.1 kanaler i hjernen kapillar endotelceller Sense stigninger i [K+]o forbundet med neurale aktivering, og generere et stigende hyperpolariserende signal, der udvider upstream arterioler20. Afslører denn...

Den piale cirkulation på overfladen af hjernen har været genstand for megen undersøgelse, dels på grund af dens eksperimentelle tilgængelighed. Men topologi af den cerebrale Vaskulaturen skaber særskilte regioner. I modsætning til den robuste Pial netværk rig på anastomoser med betydelig kapacitet til at omdirigere blodgennemstrømningen, intracerebral parenkymal arterioler (pas) nuværende begrænset sikkerhedsstillelse, hver af dem perfusing en diskret volumen af nervevæv1,2. Dette skaber en flaskehals effekt på blodgennemstrømningen, som kombineret med unikke fysiologiske funktioner3,4,5,6,7,8, gør intracerebral arterioler et afgørende sted for cerebral blodgennemstrømning (CBF) regel9,10. På trods af de tekniske udfordringer, som er forbundet med isolation og annullering af pas, har det sidste årti oplevet en øget interesse for ex vivo -funktionelle undersøgelser med trykbeholdere11,12,13,14,15,16,17. En af grundene til denne øgede interesse er den betydelige forskningsindsats, der udføres på neurovaskulære kobling (NVC), mekanismen opretholde hjernen funktionelle hyperæmi18.
Regionalt kan CBF hurtigt stige efter lokal neurale aktivering19. De cellulære mekanismer og signalerings egenskaber, der styrer NVC, er ufuldstændigt forstået. Men vi identificerede en tidligere uventet rolle for hjernen kapillærer under NVC i sensing neurale aktivitet og omsætte det til et hyperpolariserende elektrisk signal til spile opstrøms arterioler20,21,22. Action potentialer23,24 og åbning af store-ledning ca2 +-aktiverede k+ (BK) kanaler på astrocytiske endfeet25,26 øge den interstitiel kalium ionkoncentration [K+]o, hvilket resulterer i aktivering af stærke indadgående ensretter k+ (Kir) kanaler i den vaskulære endotelum af kapillærer. Denne kanal er aktiveret af ekstern K+ , men også af hyperpolarisering selv. Ved at sprede sig gennem Gap-kryds, regenererer hyperpolariserende strøm i tilstødende kapillar endotelceller op til arterien, hvor det forårsager nekrotiske afslapning og CBF øger20,21. Studiet af denne mekanisme fik os til at udvikle et trykbærende kapillar-parenchymal arteriole (CaPA) præparat til måling af arteriolær diameter under kapillær stimulation med vasoaktive stoffer. CaPA-præparatet består af et cannuleret intracerebral arteriole segment med en intakt, nedstrøms kapillær forgreningen. Kapillar enderne komprimeres mod kammer glasbunden med en mikropipette, som tilstopper og stabiliserer hele vaskulære dannelsen20,21.
Vi har tidligere lavet instrumental innovationer af Imaging Capa præparater fra Mouse cortex20,21 og arterioler fra rat amygdala13 og hippocampus16,17. Som hippocampus Vaskulaturen modtager mere opmærksomhed på grund af dens modtagelighed for patologiske tilstande, her giver vi en trin-for-trin metode til CaPA forberedelse fra musen hippocampus (HiCaPA), der ikke kun kan anvendes i funktionelle NVC undersøgelser, men også i molekylær biologi, immunkemi, og Elektrofysiologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Syringe Filters</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>229751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-0 Nylon (12cm) Black</td>
			<td>Microsurgery Instruments, Inc</td>
			<td>S12-0 NYLON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &#8212; complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Water Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra&#8482; Miltex&#8482;Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML 133 hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NS309</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>PS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PP-83</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study

Fra subtile adfærdsmæssige ændringer til sen-fase demens, vaskulær kognitiv svækkelse typisk udvikler efter cerebral iskæmi. Slagtilfælde og hjertestop er bemærkelsesværdigt seksuelt dimorfe sygdomme, og begge inducere cerebral iskæmi. Men, fremskridt i forståelsen af vaskulær kognitiv svækkelse, og derefter udvikle kønsspecifikke behandlinger, har været delvist begrænset af udfordringer i at undersøge hjernen mikrocirkulationen fra musemodeller i funktionelle undersøgelser. Her præsenterer vi en tilgang til at undersøge kapillær-til-arteriole signalering i en ex vivo hippocampus kapillar-parenchymal arteriole (hicapa) forberedelse fra mus hjernen. Vi beskriver, hvordan man isolerer, kanyle og under tryk mikrocirkulationen for at måle arteriolær diameter som respons på kapillær stimulation. Vi viser, hvilke passende funktionelle Kontroller der kan bruges til at validere HiCaPA-præparatets integritet og vise typiske resultater, herunder test af kalium som et Neuro vaskulær koblingsmiddel og effekten af den nyligt karakteriserede inhibitor af Kir2 aktiv rektificerende kalium kanal familie, ML133. Desuden sammenligner vi svarene i præparater opnået fra mandlige og kvindelige mus. Selv om disse data afspejler funktionelle undersøgelser, kan vores tilgang også anvendes i molekylær biologi, immunokemi og Elektrofysiologi undersøgelser.

Endothelial lille-ledning (SK) og intermediær-lednings-(IK) ca2 +-følsomme K+ kanaler har en forhalings indflydelse på diameteren af pas. Bad anvendelse af 1 μM NS309, en syntetisk IK og SK kanal agonist, forårsaget nær maksimal dilatation (figur 2a, B). Men, kapillar endotelceller mangler IK og SK kanaler og ikke hyperpolarize som reaktion på NS30920. Som et resultat, stimulerende kapillar...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study at JoVE.com

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Det nuværende manuskript beskriver, hvordan man isolerer hippocampus arterioler og kapillærer fra muse hjernen, og hvordan man presser dem til trykmyografi, immunofluorescens, biokemi og molekylære studier.

Ex vivo trykbærende Hippocampal kapillar-Parenchymal arteriole forberedelse til funktionel undersøgelse

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Vores metode gør det muligt at studere blodkar placeret i strukturer, der ellers ville være svært at billedet i Vivo, såsom hippocampus. Fordi blodkarrene er fjernet fra hjernevævet, signalering mellem kapillærer og arteriole kan studeres uden off-target effekter på det omgivende væv. For at isolere hippocampus, bruge små dissektion saks til at skære huden langs midterlinjen i toppen af hovedet af musen og flytte huden til siderne.Start ved caudal side af kraniet, skære kraniet langs midterlinjen, indtil olfaktoriske pærer er nået og fjerne dele af kraniet, indtil cerebrum er udsat. Start nær næsen af musen, langsomt fjerne hjernen, ved hjælp af saks til at skære gennem olfaktoriske pærer, kranienerver, og rygmarv. Nedsænk hjernen, ventrale side ned i MOPS Buffered Saltvand, i midten af en dissektion plade, og placere pladen under en dissektion mikroskop.Hold den skarpe kant parallelt med bunden af skålen, bruge barberbladet til at skære hjernen i halve langsgående revne i ét slag. Placer en halvkugle i midten af pladen med midterlinjen vender nedad og skub barberbladet lige gennem vævet langs den tværgående revne for at fjerne lillehjernen og hjernestammen. Roter halvkuglen, så den mediale side vender opad og bruge en spatel til at holde hjernen på plads.Indsæt spidsen af en anden spatel under corpus callosum, scooping under vævet for at fjerne thalamus, septum, og hypothalamus fra hippocampus. Hippocampus bør nu være synlig som en buet struktur nær den bageste side af cerebrum. Brug en spatel til at holde cerebrum på plads, skal du bruge den anden spatel til at øse hippocampus ud af cerebrum.Overfør derefter hippocampi til en ny dissektionsplade, fyldt ca. halvvejs med frisk MOP-opløsning. For hippocampal arteriole isolation, placere små stifter i hver ende af en hippocampus at sikre prøven hippocampal arterie side op. Brug meget skarpe snævler, forsigtigt strække små dele af hippocampi at løsne vævet omkring arterioler.Og søg gennem de dorsale hippocampal væv for at identificere de eksterne tværgående arterier. Når arterien er blevet placeret, grab den eksterne tværgående arterie fra hippocampus og langsomt trække det væk fra vævet til at indsamle arterioler og kapillærer. Arterien fra hver hippocampus fjernes separat.Når der ikke er flere beholdere, der skal fjernes, skal prøverne på isen sættes i gang, og det resterende hippocampalvæv kasseres. For cannulation af arterioler, lokalisere og arteriole med en gren, der ender med kapillærer og placere arteriole i et organ kammer. Skub forsigtigt kanylespidsen gennem arterievæggen under målområdet for at montere blodkarret.Skub derefter forsigtigt fartøjet på kanylen, indtil der er nok væv til at placere slipset. Brug 12-0 nylon suturer til at gøre en løs knude, der vil passe over blodkar og kanyle, og bruge en halv hitch knude til at sikre båndene, trække enderne til at stramme knuden for at sikre arterien til kanylen. Fastgør et andet slips i den anden ende af arteriole at forsegle den.På den modsatte side af kammeret, sænke en anden kanyle, indtil det punkt af kanylen stifter ned slips på enden af arteriel. Brug derefter en tredje kanyle til at fastgøre kapillær grenen til dækslet, og placere spidsen tæt på enden af grenen, mens enderne af kapillærerne udsættes. Da hjernen mikrocirkulationen er udsøgt skrøbelig, skal du sørge for at minimere strækning og håndtering af fartøjerne under cannulation procedure for at sikre overlevelsen af arteriolerne.For tryk myografi analyse, overføre kammeret til et lys mikroskop fase med optagelse software og forbinde ind-og udstrømning slange til kammeret for overflod. Start den overflod med 37 grader Celsius Kunstig cerebrospinalvæske ved en fire milliliter per minut strømningshastighed, og fastgør trykdylen til peristaltisk pumpe parret med en tryktransducer. Bring det interne tryk til 20 millimeter kviksølv og start optagelsessoftwaren.Juster mikroskopet og billedindstillingerne for at opnå det klareste billede. Og brug Edge Detection software til at kontrollere, at arterien er omkring 15 til 30 mikrometer i diameter, når det er fuldt udvidet. Når indstillingerne er blevet optimeret, skal du begynde optagelsen og øge det intravaskulære tryk i karret op til 40 millimeter kviksølv, mens du registrerer arteriediameteren med Edge Detection-softwaren.Derefter kraftig kammeret i 15 til 20 minutter for at vaske ud MOP løsning. For at teste fartøjets levedygtighed skal der anvendes en mikromolar NS309-opløsning på badets overflod, arteriesegmentet skal spile, hvilket viser en 30 til 40% myogen tone. Når baseline tonen for arteriole er blevet etableret, bruge et glas puller at gøre kanyler med et fint punkt i den ene ende, og bruge kraftberne til at bryde spidsen af hver kanyle, således at stoffet af interesse kan flyde jævnt gennem spidsen på fem pounds af tryk per kvadrattomme.Fyld kanylen med det stof af interesse. Og læg kanylen på en treakset mikromanipulator, der er fastgjort til mikroskopet. Tilslut slangen fra trykudslyngningssystemet til kanylen, og sænk langsomt kanylen ned i badet nær kapillærerne, idet du skal passe på ikke at ramme nogen del af fartøjet eller kammeret.For at stimulere kapillærerne skal du sænke kanylen til dækslet lige ved siden af kapillærerne og aktivere trykudslyngningssystemet med den ønskede udslyngningstid. Ved slutningen af stimuleringen hæves kanylen en smule for at undgå yderligere stimulering. For at bekræfte, at kun kapillærerne blev stimuleret, skal du fylde den nye kanyle med en mikromolar NS309-opløsning og stimulere kapillærerne som påvist.Derefter opnås den maksimale vasodilatation ved at bade præparatet med calciumfri opløsning. Bad anvendelse af en en mikromolar NS309 forårsager en næsten maksimal udvidelse af arteriole på grund af calcium-følsomme kalium kanaler i endotel. Kapillær endotelceller mangler imidlertid ikke mellemliggende og små ledningsevnekanaler og hyperpolariserer ikke som reaktion på agonisten, som følge heraf stimulerende kapillær ender med NS309, ikke forårsager opstrøms arteriolar dilatation, dette indikerer, at NS309 ikke nåede arterielen, og kan bruges som en kontrol for at få adgang til spacial begrænsning af sammensat anvendes på kapillærer ved tryk.Ved hjælp af hippocampal kapillær parenkymal arteriel præparat som påvist, anvendelse af en kunstig cerebrospinalvæske suppleret med 10 millimolar kalium til kapillær ender, resulterer i en opstrøms arteriolar dilatation, der ikke adskiller sig mellem præparater fra mandlige og kvindelige mus. Endvidere, tilsætning af Kir2-hæmmer ML 133, stort set afskaffer kapillær induceret arteriel dilatation, som reaktion på 10 millimolar kalium i præparater fra både mandlige og kvindelige mus. Når montering af blodet vesssel, begrænse direkte interaktioner med blodkar for at minimere skaderne på, og øge levedygtigheden af fartøjet.Når blodkarrene er blevet isoleret, forskellige lægemiddelforbindelser kan testes eller blodkarrene kan yderligere behandles for oliecular biologi, immunkemi, eller elektrofysiologi undersøgelser.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Metoder til Undersøgelse af Neuronal morfogenese:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporation i embryoniske murin Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mus baghjernen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur til Uddannelse Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidige<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functional Test af to nethinder af<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetic Dissektion af Frygt Kredsløb i Brain Skiver

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

Implantation af kronisk silicium sonder og optagelse af hippocampus sted celler i en beriget løbebånd apparater

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Forberedelse af akut humane hippocampale skiver til elektrofysiologiske optagelser

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Forberedelse af rotte iskiasnerve til Ex Vivo neurofysiologi

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for AMD Research

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration (Video) | JoVE 

Ex vivo OCT-baseret multimodal billeddannelse af menneskelige donorøjne til forskning i aldersrelateret makuladegeneration

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...