Name: ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study at JoVE.com

De auteurs willen Jules Morin bedanken voor de inzichtelijke opmerkingen over het manuscript. Dit onderzoek werd gefinancierd door Awards van de CADASIL samen hebben we hoop non-profit organisatie, het centrum voor de gezondheid van vrouwen en onderzoek, en de NHLBI R01HL136636 (FD).

Alle experimenten werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Universiteit van Colorado, Anschutz Medical campus en werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health.
1. oplossingen
<ol><li>Gebruik MOPS-gebufferde zoutoplossing voor de dissectie en om monsters bij 4 °C te houden vóór het gebruik ervan. Gas de oplossing niet. Bereid MOPS gebufferde zoutoplossing met volgende samenstelling: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM ...

<ol>
	<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex.">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+fragile+aspects+of+cortical+blood+flow+in+relation+to+the+underlying+angioarchitecture.">Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+Myogenic+Tone,+and+Vasodilator+Responses+in+Middle+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles:+Effect+of+Ischemia+and+Reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li><li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization.">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels.">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors,+calcium+signaling,+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation.">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li><li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles+with+Aging:+Role+of+Rho+Kinase+2+and+Impact+of+Genetic+Background.">Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+smallest+stroke:+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit.">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).</li><li>Koide, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+KV+channels+in+cerebral+small+vessel+pathologies.">The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).</li><li>Girouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+endfoot+Ca2++and+BK+channels+determine+both+arteriolar+dilation+and+constriction.">Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2,+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent,+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles.">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).</li><li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K++channel+function.">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).</li><li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+TRPV3+channel+Ca2++influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).</li><li>Johnson, A. C., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+hippocampal+arteriole+structure+and+function+in+a+rat+model+of+preeclampsia:+Potential+role+in+impaired+seizure-induced+hyperemia.">Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).</li><li>Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+impairment+in+spontaneously+hypertensive+rats+is+associated+with+hippocampal+hypoperfusion+and+hippocampal+vascular+dysfunction.">Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. , (2019).</li><li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurovascular+Unit+Coming+of+Age:+A+Journey+through+Neurovascular+Coupling+in+Health+and+Disease.">The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease.</a> Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).</li><li>Roy, C. S., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Regulation+of+the+Blood-supply+of+the+Brain.">On the Regulation of the Blood-supply of the Brain.</a> The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).</li><li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+K+-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow.">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+GqPCR+activity+controls+capillary+electrical+signaling+and+brain+blood+flow+through+PIP2+depletion.">Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+depletion+promotes+TRPV4+channel+activity+in+mouse+brain+capillary+endothelial+cells.">PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells.</a> eLife. 7, 351 (2018).</li><li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+description+of+membrane+current+and+its+application+to+conduction+and+excitation+in+nerve.">A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.</a> The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).</li><li>Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potentials+and+microenvironment+of+rat+dorsal+vagal+cells+in+vitro+during+energy+depletion.">Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion.</a> The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).</li><li>Filosa, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+potassium+signaling+couples+neuronal+activity+to+vasodilation+in+the+brain.">Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).</li><li>Attwell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow.">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li><li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+patterns+of+the+rat+hippocampal+formation.">Vascular patterns of the rat hippocampal formation.</a> Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).</li><li>Wang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+the+K(ir)2+family+of+inward+rectifier+potassium+channels+by+a+small+molecule+probe:+the+discovery,+SAR,+and+pharmacological+characterization+of+ML133.">Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133.</a> ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).</li><li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles.">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li><li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure.">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li><li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus.">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis,+potentially+impacting+cognitive+functions.">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li><li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation.">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li></ol>

De onder druk staande hicapa (hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole) voorbereiding beschreven in het huidige manuscript is een Verleng teken van onze gevestigde procedure om parenchymale arteriolen29te isoleren, onder druk te zetten en te bestuderen. We onlangs gemeld dat Kir 2.1 kanalen in hersen capillaire endotheliale cellen Sense toeneemt in [K+]o geassocieerd met neurale activering, en het genereren van een stijgende hyperpolariserende signaal dat stroomopwaarts ...

De Piale circulatie op het oppervlak van de hersenen is het voorwerp geweest van veel studie, deels vanwege de experimentele toegankelijkheid. Echter, de topologie van de cerebrale vasculatuur creëert verschillende regio's. In tegenstelling tot het robuuste pial-netwerk dat rijk is aan anastomosen met aanzienlijke capaciteit voor het omleiden van de bloedstroom, presenteren de intracerebrale parenchymale arteriolen (PAs) beperkte onderpand toevoer, elk met een discrete hoeveelheid zenuwweefsel1,2. Dit creëert een knelpunt effect op de bloedstroom die, in combinatie met unieke fysiologische kenmerken3,4,5,6,7,8, maakt intracerebrale arteriolen een cruciale plaats voor de cerebrale doorbloeding (CBF) voorschrift9,10. Ondanks de technische uitdagingen die inherent zijn aan de isolatie en de cannulatie van PAs, heeft de laatste tien jaar een toegenomen belangstelling voor ex-vivo -functionele studies met onder druk staande schepen11,12,13,14,15,16,17. Een van de redenen voor deze toegenomen belangstelling is de aanzienlijke onderzoeksinspanningen uitgevoerd op neurovasculaire koppeling (NVC), het mechanisme ondersteunen van de hersenen functionele hyperemie18.
Regionaal, CBF kan snel toenemen na lokale neurale activering19. De cellulaire mechanismen en signalering eigenschappen die NVC beheersen zijn niet volledig begrepen. Echter, we identificeerden een eerder onverwachte rol voor de hersen capillairen tijdens NVC in sensing neurale activiteit en vertalen in een hyperpolariserende elektrische signaal te verwijden stroomopwaarts arteriolen20,21,22. Actie potentialen23,24 en opening van grote-conductance CA2 +-geactiveerde K+ (BK) kanalen op de astrocytische endfeet25,26 Verhoog de concentratie van de interstitiële kalium ionen [K+]o, wat resulteert in de activering van sterke inkomende gelijkrichter K+ (KIR) kanalen in het vasculaire endotheel van de capillairen. Dit kanaal wordt geactiveerd door externe K+ , maar ook door hyperpolarisatie zelf. De hyperpolariserende stroom verspreidt zich door tussenruimte kruisingen en regenereert vervolgens in aangrenzende capillaire endotheliale cellen tot aan de Arteriole, waar het myocyten ontspanning en CBF verhoogt20,21. De studie van dit mechanisme leidde ons tot het ontwikkelen van een onder druk staande capillaire-parenchymale Arteriole (CaPA) voorbereiding voor het meten van de arteriollaire diameter tijdens capillaire stimulatie met vasoactieve agentia. De capa preparaat is samengesteld uit een gecanuleerde intracerebrale Arteriole segment met een intact, downstream capillaire vertachting. De capillaire uiteinden worden gecomprimeerd tegen de kamer glazen bodem door een micro Pipet, die de gehele vasculaire vorming20,21occludeert en stabiliseert.
Eerder maakten we instrumentale innovaties door Imaging Capa-preparaten uit de muis cortex20,21 en arteriolen van de rat amygdala13 en Hippocampus16,17. Aangezien de hippocampal therapieën meer aandacht krijgt vanwege de gevoeligheid voor pathologische omstandigheden, bieden we hier een stapsgewijze methode voor Capa-bereiding van de muis Hippocampus (hicapa) die niet alleen kan worden gebruikt in functionele NVC-studies, maar ook in moleculaire biologie, Immunochemie en elektrofysiologie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Syringe Filters</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>229751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-0 Nylon (12cm) Black</td>
			<td>Microsurgery Instruments, Inc</td>
			<td>S12-0 NYLON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &#8212; complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Water Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra&#8482; Miltex&#8482;Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML 133 hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NS309</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>PS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PP-83</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study

Van subtiele gedragsveranderingen tot laattijdige dementie ontwikkelt vasculaire cognitieve stoornissen zich meestal na cerebrale ischemie. Beroerte en hartstilstand zijn opmerkelijk seksueel dimorfe ziekten, en beide induceren cerebrale ischemie. Echter, vooruitgang in het begrijpen van de vasculaire cognitieve stoornissen, en vervolgens het ontwikkelen van seks-specifieke behandelingen, is deels beperkt door uitdagingen bij het onderzoeken van de hersenen microcirculatie van Muismodellen in functionele studies. Hier presenteren we een benadering om de capillaire-naar-Arteriole-signalering te onderzoeken in een ex vivo hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole (hicapa) voorbereiding van muizenhersenen. We beschrijven hoe de microcirculatie te isoleren, te cannuleren en onder druk te zetten om de arteriolaire diameter te meten als reactie op capillaire stimulatie. We laten zien welke geschikte functionele controles kunnen worden gebruikt om de integriteit van de voorbereiding van de HiCaPA te valideren en typische resultaten weer te geven, waaronder het testen van kalium als een neurovasculaire koppelings agent en het effect van de recentelijk gekarakteriseerde remmer van de Kir2 actieve gelijkrichter kaliumkanaal familie, ML133. Verder vergelijken we de reacties in preparaten die zijn verkregen van mannelijke en vrouwelijke muizen. Hoewel deze gegevens functioneel onderzoek weerspiegelen, kan onze aanpak ook worden gebruikt in moleculaire biologie, Immunochemie en elektrofysiologie studies.

Endotheliale Small-conductance (SK) en intermediaire-conductance (IK) CA2 +-gevoelige K+ kanalen oefenen een dilatorische invloed uit op de diameter van de PAs. Bad toepassing van 1 μM NS309, een synthetische IK en SK kanaal agonist, veroorzaakt in de buurt van maximale verwijding (Figuur 2a, B). Echter, capillaire endotheliale cellen missen IK en SK kanalen en niet hyperpolariseren in reactie op NS309...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study at JoVE.com

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Het huidige manuscript laat zien hoe hippocampal arteriolen en haarvaten van de muis hersenen isoleren en hoe ze onder druk kunnen worden gezet voor myografie, immunofluorescentie, biochemie en moleculaire studies.

Ex vivo onder druk Hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole voorbereiding voor functionele studie

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Onze methode maakt het mogelijk om bloedvaten te bestuderen in structuren die anders moeilijk in vivo te beeld krijgen, zoals de hippocampus. Omdat de bloedvaten uit het hersenweefsel worden verwijderd, kan de signalering tussen de haarvaten en de arteriole worden bestudeerd zonder off-target effecten op het omliggende weefsel. Om de hippocampus te isoleren, gebruik je een kleine dissectieschaar om de huid langs de middellijn aan de bovenkant van het hoofd van de muis te snijden en de huid naar de zijkanten te verplaatsen.Vanaf de staartzijde van de schedel snijdt u de schedel langs de middellijn totdat de reukbollen zijn bereikt en verwijder delen van de schedel totdat de cerebrum wordt blootgesteld. Beginnend in de buurt van de neus van de muis, langzaam verwijderen van de hersenen, met behulp van de schaar te snijden door de olfactorische bollen, craniale zenuwen, en ruggenmerg. Dompel de hersenen onder, ventrale kant naar beneden in MOPS Gebufferd Saline, in het midden van een dissectie plaat, en plaats de plaat onder een dissectie microscoop.Houd de scherpe rand parallel aan de bodem van de schotel, gebruik scheermesje om de hersenen in de helft langs de longitudinale fissuur in een slag te snijden. Plaats een halfrond in het midden van de plaat met de middellijn naar beneden en duw het scheermesje dwars door het weefsel langs de dwarse spleet om het cerebellum en de hersenstam te verwijderen. Draai het halfrond, zodat de mediale kant naar boven gericht en gebruik een spatel om de hersenen op zijn plaats te houden.Steek het puntje van een tweede spatel onder het corpus callosum, scheppen onder het weefsel om de thalamus, septum, en hypothalamus te verwijderen uit de hippocampus. De hippocampus moet nu zichtbaar zijn als een gebogen structuur in de buurt van de achterste kant van de cerebrum. Met behulp van een spatel om de cerebrum op zijn plaats te houden, gebruik de tweede spatel om de hippocampus uit de cerebrum te scheppen.Breng de hippocampi vervolgens over naar een nieuwe dissectieplaat, ongeveer halverwege gevuld met een verse MOP-oplossing. Voor hippocampal arteriole isolatie, plaats kleine pinnen aan elk uiteinde van een hippocampus om het monster hippocampal slagader kant omhoog te beveiligen. Met behulp van zeer scherpe tangen, voorzichtig strekken kleine delen van de hippocampi om het weefsel rond de arterioles los te maken.En zoek door de rug hippocampal weefsels om de externe dwarse slagaders te identificeren. Wanneer de slagader is gelokaliseerd, pak de externe dwarsslagader van de hippocampus en trek het langzaam weg van het weefsel om de slagaders en haarvaten te verzamelen. De slagader van elke hippocampus wordt apart verwijderd.Wanneer er geen vaten meer verwijderd moeten worden, plaatst u de monsters op ijs en gooi u het resterende hippocampale weefsel weg. Voor cannulation van de arterioles, lokaliseren en arteriole met een tak die eindigt met haarvaten en plaats de arteriole in een orgelkamer. Duw de canulepunt voorzichtig door de arteriole wand onder het doelgebied om het bloedvat te monteren.Schuif het vat vervolgens voorzichtig op de canule totdat er voldoende weefsel is waarop de das kan worden gevonden. Gebruik 12-0 nylon hechtingen om een losse knoop te maken die over het bloedvat en canule past, en gebruik een halve kink in de kabel om de banden te beveiligen, trek de uiteinden om de knoop aan te scherpen om de arteriole aan de canule te beveiligen. Zet een andere das aan de andere kant van de arteriole om het te verzegelen.Aan de andere kant van de kamer, lager een tweede canule tot het punt van de canule pinnen vaststelling van de das aan het einde van de arteriole. Gebruik vervolgens een derde canule om de haarvaten aan de coverslip te vastpinnen, waarbij de punt dicht bij het einde van de tak wordt plaatsgelegd, terwijl de uiteinden van de haarvaten worden blootgesteld. Als de hersenen microcirculatie is prachtig kwetsbaar, zorg ervoor dat het uitrekken en hanteren van de vaten te minimaliseren tijdens de cannulation procedure om de overleving van de arterioles te garanderen.Voor druk myografie analyse, breng de kamer naar een lichtmicroscoop stadium met opnamesoftware en sluit de in- en uitstroom buizen aan de kamer voor overvloed. Start de overvloed met 37 graden Celsius Kunstmatige cerebrospinale vloeistof op een vier milliliter per minuut stroomsnelheid, en bevestig de druk canule aan peristaltische pomp in combinatie met een druktransducer. Breng de interne druk op 20 millimeter Mercurius en start de opnamesoftware.Pas de microscoop en de beeldinstellingen aan om een zo duidelijk mogelijk beeld te bereiken. En gebruik de Edge Detection-software om te controleren of de arteriole ongeveer 15 tot 30 micrometer in diameter is wanneer deze volledig verwijd is. Zodra de instellingen zijn geoptimaliseerd, begint u met de opname en verhoogt u de intravasculaire druk in het vat tot 40 millimeter Mercurius, terwijl u de arteriooldiameter registreert met de Edge Detection-software.Maak vervolgens 15 tot 20 minuten gebruik van de kamer om de MOP-oplossing uit te wassen. Om de levensvatbaarheid van het vat te testen, breng een micromolar NS309-oplossing aan op de badoverdaad, moet het arteriolarsegment verwijden, wat een myogene tint van 30 tot 40% aantoont. Zodra de basistoon voor de arteriole is vastgesteld, gebruik een glazen trekker om canules te maken met een fijn punt aan de ene kant, en gebruik tangen om de punt van elke canule te breken, zodat de drug van belang soepel kan stromen door de tip op vijf pond druk per vierkante inch.Vul de canule met het medicijn van belang. En laad de canule op een drieassige micromanipulator aan de microscoop. Sluit de slang van het drukuitwerpsysteem aan op de canule en laat de canule langzaam in het bad in de buurt van de haarvaten zakken, waarbij u ervoor zorgt dat het schip of de kamer niet wordt geraakt.Om de haarvaten te stimuleren, laat u de canule naar de coverslip net naast de haarvaten zakken en activeer het drukuitwerpsysteem met de gewenste uitwerptijd. Verhoog aan het einde van de stimulatie de canule iets om verdere stimulatie te voorkomen. Om te bevestigen dat alleen de haarvaten werden gestimuleerd, vul de nieuwe canule met één micromolar NS309-oplossing en stimuleer de haarvaten zoals aangetoond.Verkrijg vervolgens de maximale vaatverwijding door het preparaat te baden met de calciumvrije oplossing. De toepassing van het bad van één micromolar NS309 veroorzaakt een dichtbijgelegen maximale dilatatie van arteriole toe te schrijven aan Calcium-gevoelige Kaliumkanalen in het endothhelium. Capillaire endotheelcellen echter, gebrek aan tussenliggende en kleine geleiding kanalen en niet hyperpolariseren in reactie op de agonist, als gevolg daarvan, het stimuleren van haardolelijke uiteinden met NS309, veroorzaakt geen upstream arteriolar dilatatie, dit geeft aan dat NS309 niet de arteriole bereikt, en kan worden gebruikt als een controle om toegang te krijgen tot de ruimtelijke beperking van de verbinding op toegepaste op toegepaste haarvaten door middel van druk ejection.Met behulp van de hippocampal capillaire parenchymale arteriole voorbereiding zoals aangetoond, de toepassing van een kunstmatige hersenvocht aangevuld met 10 millimolar Kalium op de capillaire uiteinden, resulteert in een upstream arteriolar dilatatie die niet verschilt tussen preparaten van mannelijke en vrouwelijke muizen. Verder, de toevoeging van de Kir2 remmer ML 133, vrijwel schaft de capillaire geïnduceerde arteriolar dilatatie, in reactie op 10 millimolar Kalium in preparaten van zowel mannelijke als vrouwelijke muizen. Bij het monteren van de bloedsssel, beperken directe interacties met het bloedvat om de schade aan te minimaliseren, en verhoging van de levensvatbaarheid van het vat.Zodra het bloedvat is geïsoleerd, verschillende geneesmiddelenverbindingen kunnen worden getest of het bloedvat kan verder worden verwerkt voor oleculaire biologie, immunochemie, of elektrofysiologie studies.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Voorbereiding van de Acute hippocampus Plakjes van ratten en transgene muizen voor de Studie van Synaptic Wijzigingen bij het ouder worden en amyloïdpathologie

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methoden voor Studie van Neuronale Morphogenesis:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporatie in Embryonale Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Muis hindbrain<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur aan Facial Branchiomotor Neuron Migratie Studie

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaan<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functioneel testen van Two netvliezen door<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

Implantatie van chronische Silicon sondes en opname van Hippocampal plaats cellen in een verrijkte loopband-apparaat

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Voorbereiding van acute menselijke hippocampal slices voor elektrofysiologische opnames

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Voorbereiding van de heupzenuw van de rat voor ex vivo neurofysiologie

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for AMD Research

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration (Video) | JoVE 

Ex Vivo OCT-gebaseerde multimodale beeldvorming van menselijke donorogen voor onderzoek naar leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...