Name: ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study at JoVE.com

Die Autoren danken Jules Morin für die aufschlussreichen Kommentare zum Manuskript. Diese Forschung wurde durch Auszeichnungen der gemeinnützigen Organisation CADASIL Together We Have Hope, des Center for Women es Health and Research und des NHLBI R01HL136636 (FD) finanziert.

Alle Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Colorado, Anschutz Medical Campus, genehmigt und nach den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt.
1. Lösungen
<ol><li>Verwenden Sie MOPS-gepufferte Saline für die Sezierung und halten Sie Proben bei 4 °C vor ihrer Nutzung. Vergasen Sie die Lösung nicht. Bereiten Sie MOPS gepufferte Saline mit folgender Zusammensetzung vor: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO<sub...

<ol>
	<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex.">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+fragile+aspects+of+cortical+blood+flow+in+relation+to+the+underlying+angioarchitecture.">Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+Myogenic+Tone,+and+Vasodilator+Responses+in+Middle+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles:+Effect+of+Ischemia+and+Reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li><li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization.">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels.">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors,+calcium+signaling,+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation.">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li><li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles+with+Aging:+Role+of+Rho+Kinase+2+and+Impact+of+Genetic+Background.">Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+smallest+stroke:+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit.">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).</li><li>Koide, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+KV+channels+in+cerebral+small+vessel+pathologies.">The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).</li><li>Girouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+endfoot+Ca2++and+BK+channels+determine+both+arteriolar+dilation+and+constriction.">Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2,+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent,+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles.">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).</li><li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K++channel+function.">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).</li><li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+TRPV3+channel+Ca2++influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).</li><li>Johnson, A. C., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+hippocampal+arteriole+structure+and+function+in+a+rat+model+of+preeclampsia:+Potential+role+in+impaired+seizure-induced+hyperemia.">Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).</li><li>Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+impairment+in+spontaneously+hypertensive+rats+is+associated+with+hippocampal+hypoperfusion+and+hippocampal+vascular+dysfunction.">Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. , (2019).</li><li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurovascular+Unit+Coming+of+Age:+A+Journey+through+Neurovascular+Coupling+in+Health+and+Disease.">The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease.</a> Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).</li><li>Roy, C. S., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Regulation+of+the+Blood-supply+of+the+Brain.">On the Regulation of the Blood-supply of the Brain.</a> The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).</li><li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+K+-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow.">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+GqPCR+activity+controls+capillary+electrical+signaling+and+brain+blood+flow+through+PIP2+depletion.">Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+depletion+promotes+TRPV4+channel+activity+in+mouse+brain+capillary+endothelial+cells.">PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells.</a> eLife. 7, 351 (2018).</li><li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+description+of+membrane+current+and+its+application+to+conduction+and+excitation+in+nerve.">A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.</a> The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).</li><li>Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potentials+and+microenvironment+of+rat+dorsal+vagal+cells+in+vitro+during+energy+depletion.">Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion.</a> The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).</li><li>Filosa, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+potassium+signaling+couples+neuronal+activity+to+vasodilation+in+the+brain.">Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).</li><li>Attwell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow.">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li><li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+patterns+of+the+rat+hippocampal+formation.">Vascular patterns of the rat hippocampal formation.</a> Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).</li><li>Wang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+the+K(ir)2+family+of+inward+rectifier+potassium+channels+by+a+small+molecule+probe:+the+discovery,+SAR,+and+pharmacological+characterization+of+ML133.">Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133.</a> ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).</li><li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles.">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li><li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure.">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li><li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus.">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis,+potentially+impacting+cognitive+functions.">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li><li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation.">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li></ol>

Die unter Druck stehende HiCaPA (hippocampal kapillar-parenchymale Arteriole) Präparation, die in diesem Manuskript beschrieben wird, ist eine Erweiterung unseres etablierten Verfahrens zur Isolierung, Unterdruck bildung und Untersuchung von parenchymalen Arteriolen29. Wir berichteten vor kurzem, dass Kir2.1 Kanäle in Gehirnkapillaren Endothelzellen Wahrnehmen steigt in [K+]o mit neuronaler Aktivierung verbunden, und erzeugen ein aufsteigendes hyperpolarisierendes Signal, d...

Die piale Zirkulation auf der Oberfläche des Gehirns war Gegenstand vieler Untersuchungen, teilweise wegen seiner experimentellen Zugänglichkeit. Die Topologie der zerebralen Vaskulatur schafft jedoch unterschiedliche Regionen. Im Gegensatz zum robusten pialen Netzwerk reich an Anastomosen mit beträchtlicher Kapazität zur Umleitung des Blutflusses, die intrazerebralen parenchymalen Arteriolen (PAs) bieten eine begrenzte Kollateralversorgung, die jeweils ein diskretes Volumen an Nervengewebe1,2durchdringen. Dies erzeugt einen Engpass-Effekt auf den Blutfluss, die, kombiniert mit einzigartigen physiologischen Merkmalen3,4,5,6,7,8, macht intracerebral arterioles eine entscheidende Stelle für zerebrale Durchblutung (CBF) Regulierung9,10. Trotz der technischen Herausforderungen, die mit der Isolierung und Cannulation von PAs verbunden sind, hat das Interesse an ex vivo funktionellen Studien mit Druckgefäßen11,12,13,14,15,16,17zugenommen. Einer der Gründe für dieses erhöhte Interesse ist der beträchtliche Forschungsaufwand an neurovaskulärer Kopplung (NVC), dem Mechanismus zur Erhaltung der funktionellen Hyperämie des Gehirns18.
Regional kann CBF nach lokaler neuronaler Aktivierung schnell ansteigen19. Die zellulären Mechanismen und Signaleigenschaften, die NVC steuern, sind unvollständig verstanden. Wir identifizierten jedoch eine bisher unerwartete Rolle für die Hirnkapillaren während NVC bei der Erfassung der neuronalen Aktivität und der Übersetzung in ein hyperpolarisierendes elektrisches Signal zur Ausgliederung der vorgelagerten Arteriolen20,21,22. Aktionspotentiale23,24 und Öffnung von Großleitfähigkeit Ca2+-aktivierten K+ (BK) Kanälen auf den astrozytischen Endfüßen25,26 erhöhen die interstitielle Kaliumionenkonzentration [K+]o, was zur Aktivierung starker nachinnen gleichrichternder K+ (Kir) Kanäle im vaskulären Endothel von Kapillaren führt. Dieser Kanal wird durch externes K+, aber auch durch Hyperpolarisation selbst aktiviert. Der hyperpolarisierende Strom, der sich durch Spaltknoten ausbreitet, regeneriert sich dann in benachbarten Kapillaren-Endothelzellen bis zur Arteriole, wo er Myozytenentspannung und CBF-Erhöhung20,21verursacht. Die Untersuchung dieses Mechanismus führte uns dazu, ein unter Druck stehendes kapillar-parenchymale Arteriol (CaPA) Präparat zu entwickeln, um den arteriolaren Durchmesser während der Kapillarstimulation mit vasoaktiven Wirkstoffen zu messen. Das CaPA-Präparat besteht aus einem kanülierten intracereralen Arteriolsegment mit einer intakten, nachgeschalteten Kapillarverzweigung. Die Kapillarenden werden durch eine Mikropipette gegen den Kammerglasboden verdichtet, die die gesamte Gefäßbildung verdichtet und stabilisiert20,21.
Wir haben zuvor instrumentale Innovationen durch die Abbildung CaPA-Präpa-Präpa-Präpa-Präpaden aus dem Mauskortex20,21 und Arteriolen aus der Rattenamygdala13 und hippocampus16,17gemacht. Da die Hippocampus-Vaskulatur aufgrund ihrer Anfälligkeit für pathologische Bedingungen mehr Aufmerksamkeit erhält, bieten wir hier eine Schritt-für-Schritt-Methode zur CaPA-Vorbereitung aus dem Maus-Hippocampus (HiCaPA), die nicht nur in funktionellen NVC-Studien, sondern auch in der Molekularbiologie, Immunchemie und Elektrophysiologie eingesetzt werden kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
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		<tr>
			<td>0.22&#181;m Syringe Filters</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>229751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-0 Nylon (12cm) Black</td>
			<td>Microsurgery Instruments, Inc</td>
			<td>S12-0 NYLON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &#8212; complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Water Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra&#8482; Miltex&#8482;Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML 133 hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NS309</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>PS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PP-83</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study

Von subtilen Verhaltensänderungen bis hin zu Demenz im spätstadium entwickelt sich in der Regel eine vaskuläre kognitive Beeinträchtigung nach zerebraler Ischämie. Schlaganfall und Herzstillstand sind bemerkenswert geschlechtsdiamorphe Erkrankungen, und beide induzieren zerebrale Ischämie. Der Fortschritt beim Verständnis der vaskulären kognitiven Beeinträchtigung und der Entwicklung geschlechtsspezifischer Behandlungen wurde jedoch teilweise durch Herausforderungen bei der Untersuchung der Mikrozirkulation des Gehirns aus Mausmodellen in funktionellen Studien begrenzt. Hier stellen wir einen Ansatz zur Untersuchung der Kapillar-Arteriole-Signalisierung in einem ex vivo hippocampalen Kapillar-Parenchymal-Arteriole (HiCaPA)-Präparat vom Maushirn vor. Wir beschreiben, wie man die Mikrozirkulation isoliert, cannulate und unter Druck setzt, um den Arteriolardurchmesser als Reaktion auf die Kapillarstimulation zu messen. Wir zeigen, welche geeigneten funktionellen Kontrollen verwendet werden können, um die Integrität der HiCaPA-Präparation zu validieren und typische Ergebnisse anzuzeigen, einschließlich der Prüfung von Kalium als neurovaskulärem Kopplungsmittel und der Wirkung des kürzlich charakterisierten Inhibitors der Kir2-Inwärtsrektifigungs-Kaliumkanalfamilie ML133. Darüber hinaus vergleichen wir die Reaktionen in Präparaten von männlichen und weiblichen Mäusen. Während diese Daten funktionelle Untersuchungen widerspiegeln, kann unser Ansatz auch in molekularbiologischen, Immunchemie- und Elektrophysiologiestudien verwendet werden.

Endotheliale Kleinleitfähigkeit (SK) und Zwischenleitfähigkeit (IK) Ca2+-sensitive K+ Kanäle üben einen dilatatorischen Einfluss auf den Durchmesser von PAs aus. Badapplikation von 1 M NS309, einem synthetischen IK- und SK-Kanalagonisten, verursachte eine nahezu maximale Dilatation (Abbildung 2A,B). Kapillaren-Endothelzellen fehlen jedoch keine IK- und SK-Kanäle und haben als Reaktion auf NS30920</...

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Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Das vorliegende Manuskript beschreibt, wie Hippocampus-Arteriolen und Kapillaren aus dem Maushirn isoliert werden können und wie man sie für Druckmyographie, Immunfluoreszenz, Biochemie und molekulare Studien unter Druck setzt.

Ex Vivo Druck hippocampal Kapillare-Parenchymale Arteriole Vorbereitung für die funktionelle Studie

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Unsere Methode ermöglicht die Untersuchung von Blutgefäßen in Strukturen, die sonst in Vivo schwer abzubilden wären, wie z. B. dem Hippocampus. Da die Blutgefäße aus dem Hirngewebe entfernt werden, kann die Signalisierung zwischen den Kapillaren und der Arteriole ohne off-target-Effekte auf das umgebende Gewebe untersucht werden. Um den Hippocampus zu isolieren, verwenden Sie eine kleine Sezierschere, um die Haut entlang der Mittellinie an der Oberseite des Mauskopfes zu schneiden und die Haut an die Seiten zu bewegen.Beginnend an der kaudalen Seite des Schädels, schneiden Sie den Schädel entlang der Mittellinie, bis die olfaktorischen Zwiebeln erreicht sind und entfernen Sie Teile des Schädels, bis das Großhirn freigelegt wird. Beginnend in der Nähe der Nase der Maus, langsam entfernen Sie das Gehirn, mit der Schere durch die Olfaktor-Glühbirnen schneiden, Hirnnerven, und Rückenmark. Tauchen Sie das Gehirn, ventrale Seite nach unten in MOPS Gepufferte Kochlinie, in der Mitte einer Sezierplatte, und legen Sie die Platte unter einem Seziermikroskop.Halten Sie die scharfe Kante parallel zum Boden der Schale, verwenden Sie Rasierklinge, um das Gehirn in der Hälfte entlang der Längsspalte in einem Schlag zu schneiden. Platzieren Sie eine Hemisphäre in der Mitte der Platte mit der Mittellinie nach unten und drücken Sie die Rasierklinge gerade durch das Gewebe entlang der Querspalte, um das Kleinhirn und den Hirnstamm zu entfernen. Drehen Sie die Hemisphäre so, dass die mediale Seite nach oben gerichtet ist, und verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten.Setzen Sie die Spitze eines zweiten Spachtels unter dem Corpus callosum ein und schaufeln Sie unter dem Gewebe, um Thalamus, Septum und Hypothalamus aus dem Hippocampus zu entfernen. Der Hippocampus sollte nun als gekrümmte Struktur in der Nähe der hinteren Seite des Großhirns sichtbar sein. Verwenden Sie einen Spachtel, um das Großhirn an Ort und Stelle zu halten, verwenden Sie den zweiten Spachtel, um den Hippocampus aus dem Großhirn zu schaufeln.Dann den Hippocampi auf eine neue Sezierplatte übertragen, die etwa zur Hälfte mit frischer MOP-Lösung gefüllt ist. Für hippocampale Arteriole Isolierung, legen Sie kleine Stifte an jedem Ende eines Hippocampus, um die Probe Hippocampus Arterie Seite nach oben zu sichern. Mit sehr scharfen Zangen, dehnen Sie sanft kleine Abschnitte des Hippocampi, um das Gewebe um die Arteriolen zu lösen.Und durchforsten Sie die dorsalen Hippocampusgewebe, um die äußeren Transversalarterien zu identifizieren. Wenn die Arterie gefunden wurde, greifen Sie die äußere Querarterie aus dem Hippocampus und ziehen Sie sie langsam aus dem Gewebe, um die Arteriolen und Kapillaren zu sammeln. Die Arterie aus jedem Hippocampus wird separat entfernt.Wenn keine Gefäße mehr entfernt werden müssen, legen Sie die Proben auf Eis und entsorgen Sie das verbleibende Hippocampusgewebe. Für die Cannulation der Arteriolen, lokalisieren und Arteriole mit einem Zweig, der mit Kapillaren endet und legen Sie die Arteriole in eine Orgelkammer. Schieben Sie die Kanülenspitze vorsichtig durch die Arterienwand unterhalb des Zielbereichs, um das Blutgefäß zu montieren.Dann schieben Sie das Gefäß vorsichtig auf die Kanüle, bis genügend Gewebe vorhanden ist, auf das sie die Krawatte legen kann. Verwenden Sie 12-0 Nylon Nähte, um einen lockeren Knoten zu machen, der über das Blutgefäß und die Kanüle passt, und verwenden Sie einen halben Hakenknoten, um die Krawatten zu sichern, ziehen Sie die Enden, um den Knoten zu ziehen, um die Arterie an der Kanüle zu sichern. Sichern Sie eine weitere Krawatte am anderen Ende der Arterie, um sie zu versiegeln.Auf der gegenüberliegenden Seite der Kammer, senken Sie eine zweite Kanüle, bis der Punkt der Kanüle die Krawatte am Ende der Arterie nistet. Verwenden Sie dann eine dritte Kanüle, um den Kapillarzweig an den Deckelzuschlag zu heften und die Spitze nahe am Ende des Asts zu platzieren, während die Enden der Kapillaren freigelegt werden. Da die Mikrozirkulation des Gehirns exquisit zerbrechlich ist, achten Sie darauf, die Dehnung und Handhabung der Gefäße während des Cannulationsverfahrens zu minimieren, um das Überleben der Arteriolen zu gewährleisten.Für die Druckmyographieanalyse übertragen Sie die Kammer mit Aufnahmesoftware auf eine Lichtmikroskopstufe und verbinden Sie die Zu- und Abflussschläuche zur Überflutung mit der Kammer. Beginnen Sie die Profusion mit 37 Grad Celsius Künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit mit einem Durchfluss von vier Millilitern pro Minute und befestigen Sie die Druckkanüle an der peristaltischen Pumpe gepaart mit einem Druckwandler. Bringen Sie den innendruck auf 20 Millimeter Quecksilber und starten Sie die Aufnahmesoftware.Passen Sie das Mikroskop und die Bildeinstellungen an, um ein möglichst klares Bild zu erzielen. Und verwenden Sie die Edge Detection Software, um zu überprüfen, ob die Arteriole etwa 15 bis 30 Mikrometer im Durchmesser hat, wenn sie vollständig erweitert ist. Sobald die Einstellungen optimiert wurden, beginnen Sie mit der Aufnahme und erhöhen Sie den intravaskulären Druck im Gefäß bis zu 40 Millimeter Quecksilber, während Sie den Arteriendurchmesser mit der Edge Detection Software aufzeichnen.Dann die Kammer für 15 bis 20 Minuten überziehen, um die MOP-Lösung auszuwaschen. Um die Lebensfähigkeit des Gefäßes zu testen, wenden Sie eine Mikromolar NS309-Lösung auf die Badprofusion an, das arteriolarSegment sollte sich erweitern und einen 30 bis 40% myogenen Ton aufweisen. Sobald der Grundton für die Arterie festgelegt wurde, verwenden Sie einen Glasabzieher, um Kanülen mit einem feinen Punkt an einem Ende zu machen, und verwenden Sie Zangen, um die Spitze jeder Kanüle zu brechen, so dass das Medikament von Interesse reibungslos durch die Spitze bei fünf Pfund Druck pro Quadratzoll fließen kann.Füllen Sie die Kanüle mit dem Medikament von Interesse. Und laden Sie die Kanüle auf einen dreiachsigen Mikromanipulator, der am Mikroskop befestigt ist. Schließen Sie die Schläuche vom Druckauswurfsystem an die Kanüle an und senken Sie die Kanüle langsam in das Bad in der Nähe der Kapillaren, wobei darauf geachtet wird, dass kein Teil des Gefäßes oder der Kammer getroffen wird.Um die Kapillaren zu stimulieren, senken Sie die Kanüle auf den Deckelrutsch direkt neben den Kapillaren und aktivieren Sie das Druckauswurfsystem mit der gewünschten Auswurfzeit. Am Ende der Stimulation die Kanüle leicht anheben, um eine weitere Stimulation zu vermeiden. Um zu bestätigen, dass nur die Kapillaren stimuliert wurden, füllen Sie die neue Kanüle mit einem Mikromolaren der NS309-Lösung und stimulieren Sie die Kapillaren, wie gezeigt.Dann erhalten Sie die maximale Vasodilatation, indem Sie die Zubereitung mit der Calcium-freien Lösung baden. Die Bathapplikation eines einmikromollaren NS309 verursacht eine nahezu maximale Dilatation der Artezolole aufgrund der Calcium-empfindlichen Kaliumkanäle im Endothel. Kapillaren-Endothelzellen jedoch, fehlen Zwischen- und kleine Leitfähigkeitskanäle und nicht hyperpolarisieren als Reaktion auf den Agonisten, als Ergebnis, stimulierenkapillare Enden mit NS309, verursacht keine vorgelagerte arteriolar Dilatation, dies deutet darauf hin, dass NS309 die Arteriole nicht erreicht hat, und kann als Kontrolle verwendet werden, um die räumliche Beschränkung der Verbindung auf die Kapillare durch Druckauswurf zugreifen.Mit hilfe der hippocampalen Kapillarprävale parenchymale Arteriole-Präparation, wie gezeigt, führt die Anwendung einer künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit, die mit 10 Millimolaren-Kalium auf die Kapillarenenden ergänzt wird, zu einer vorgelagerten arteriolaren Dilatation, die sich nicht zwischen Präparaten von männlichen und weiblichen Mäusen unterscheidet. Darüber hinaus wird durch die Zugabe des Kir2-Inhibitors ML 133 die kapillarinduzierte arteriolare Dilatation als Reaktion auf 10 Millimolar Kalium in Präparaten von männlichen und weiblichen Mäusen praktisch abgeschafft. Bei der Montage des Blutvesssels, begrenzen Sie direkte Wechselwirkungen mit dem Blutgefäß, um die Schäden zu minimieren, und erhöhen Sie die Lebensfähigkeit des Gefäßes.Sobald das Blutgefäß isoliert ist, können verschiedene Wirkstoffverbindungen getestet oder das Blutgefäß für Olekuläre Biologie-, Immunchemie- oder elektrophysiologische Studien weiterverarbeitet werden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Vorbereitung der akuten Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für das Studium der Synaptic Veränderungen während des Alterns und Amyloid-Pathologie

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Forschung

Neurowissenschaften

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese:<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; RNAi Elektroporation in embryonale Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Maus-Hinterhirn<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur zu Gesichts Branchiomotor Neuron Migrationsstudie

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

Implantation von chronischen Silicon Sonden und Aufzeichnung der Hippocampal Platzzellen in eine angereicherte Laufband-Vorrichtung

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Vorbereitung von akuten menschlichen Hippocampusscheiben für elektrophysiologische Aufnahmen

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Vorbereitung des Rattenischiasnervs für die Ex-vivo-Neurophysiologie

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for AMD Research

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration (Video) | JoVE 

Ex Vivo OCT-basierte multimodale Bildgebung menschlicher Spenderaugen zur Erforschung der altersbedingten Makuladegeneration

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...