Name: ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Jules Morin per commenti approfonditi sul manoscritto. Questa ricerca è stata finanziata dai premi dell'organizzazione non-profit CADASIL Together We Have Hope, del Center for Women's Health and Research e della NHLBI R01HL136636 (FD).

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Colorado, Anschutz Medical Campus e sono stati eseguiti secondo le linee guida del National Institutes of Health.
1. Soluzioni
<ol><li>Utilizzare la salina tampone MOPS per la dissezione e conservare i campioni a 4 gradi centigradi prima del loro utilizzo. Non gas la soluzione. Preparare la salina tamponata tamponata MOPS con la seguente composizione: 135 mM NaCl, 5 mM KCl...

<ol>
	<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex.">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+fragile+aspects+of+cortical+blood+flow+in+relation+to+the+underlying+angioarchitecture.">Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+Myogenic+Tone,+and+Vasodilator+Responses+in+Middle+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles:+Effect+of+Ischemia+and+Reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li><li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization.">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels.">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors,+calcium+signaling,+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation.">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li><li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles+with+Aging:+Role+of+Rho+Kinase+2+and+Impact+of+Genetic+Background.">Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+smallest+stroke:+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit.">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).</li><li>Koide, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+KV+channels+in+cerebral+small+vessel+pathologies.">The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).</li><li>Girouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+endfoot+Ca2++and+BK+channels+determine+both+arteriolar+dilation+and+constriction.">Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2,+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent,+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles.">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).</li><li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K++channel+function.">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).</li><li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+TRPV3+channel+Ca2++influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).</li><li>Johnson, A. C., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+hippocampal+arteriole+structure+and+function+in+a+rat+model+of+preeclampsia:+Potential+role+in+impaired+seizure-induced+hyperemia.">Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).</li><li>Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+impairment+in+spontaneously+hypertensive+rats+is+associated+with+hippocampal+hypoperfusion+and+hippocampal+vascular+dysfunction.">Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. , (2019).</li><li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurovascular+Unit+Coming+of+Age:+A+Journey+through+Neurovascular+Coupling+in+Health+and+Disease.">The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease.</a> Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).</li><li>Roy, C. S., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Regulation+of+the+Blood-supply+of+the+Brain.">On the Regulation of the Blood-supply of the Brain.</a> The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).</li><li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+K+-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow.">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+GqPCR+activity+controls+capillary+electrical+signaling+and+brain+blood+flow+through+PIP2+depletion.">Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+depletion+promotes+TRPV4+channel+activity+in+mouse+brain+capillary+endothelial+cells.">PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells.</a> eLife. 7, 351 (2018).</li><li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+description+of+membrane+current+and+its+application+to+conduction+and+excitation+in+nerve.">A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.</a> The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).</li><li>Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potentials+and+microenvironment+of+rat+dorsal+vagal+cells+in+vitro+during+energy+depletion.">Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion.</a> The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).</li><li>Filosa, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+potassium+signaling+couples+neuronal+activity+to+vasodilation+in+the+brain.">Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).</li><li>Attwell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow.">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li><li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+patterns+of+the+rat+hippocampal+formation.">Vascular patterns of the rat hippocampal formation.</a> Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).</li><li>Wang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+the+K(ir)2+family+of+inward+rectifier+potassium+channels+by+a+small+molecule+probe:+the+discovery,+SAR,+and+pharmacological+characterization+of+ML133.">Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133.</a> ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).</li><li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles.">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li><li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure.">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li><li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus.">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis,+potentially+impacting+cognitive+functions.">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li><li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation.">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li></ol>

La preparazione pressurizzata HiCaPA (ippocampo capillary-parenchymal arteriole) descritta nel presente manoscritto è un'estensione della nostra procedura consolidata per isolare, pressurizzare e studiare arteriole parenchymal29. Recentemente abbiamo riferito che Kir2.1 canali in cervello capillare cellule endoteliali senso aumenta in [K]o associato con l'attivazione neurale, e generare un segnale iperpolarizzante ascendente che dilata arterioles a monte20<...

La circolazione pial sulla superficie del cervello è stata oggetto di molti studi, in parte a causa della sua accessibilità sperimentale. Tuttavia, la topologia della vascolatura cerebrale crea regioni distinte. In contrasto con la solida rete di pial ricca di anastomosi con notevole capacità di reindirizzare il flusso sanguigno, le arteriole parenchimale intracerebrali (PA) presentano un approvvigionamento collaterale limitato, ognuno dei quali perfonde un volume discreto di tessuto nervoso1,2. Questo crea un effetto di collo di bottiglia sul flusso sanguigno che, combinato con caratteristiche fisiologiche uniche3,4,5,6,7,8, rende arteriole intracerebrali un sito cruciale per la regolazione del flusso sanguigno cerebrale (CBF)9,10. Nonostante le sfide tecniche inerenti all'isolamento e alla cannosazione delle PA, l'ultimo decennio ha visto un crescente interesse per gli studi ex-vivo utilizzando navi pressurizzate11,12,13,14,15,16,17. Uno dei motivi di questo maggiore interesse è il notevole sforzo di ricerca condotto sull'accoppiamento neurovascolare (NVC), il meccanismo che sostiene l'iperemia funzionale del cervello18.
A livello regionale, CBF può aumentare rapidamente a seguito di attivazione neurale locale19. I meccanismi cellulari e le proprietà di segnalazione che controllano la NVC sono incompleti. Tuttavia, abbiamo identificato un ruolo precedentemente imprevisto per i capillari cerebrali durante NVC nel percepire l'attività neurale e tradurla in un segnale elettrico iperpolarizzante per dilatare arteriolea a monte20,21,22. Potenziale di azione23,24 e l'apertura di grande conduttanza Ca2 ,attivato K(BK) canali sui piedi di posta astrociti25,26 aumentare la concentrazione di ioni di potassio interstiziale [K]o, che si traduce in attivazione di forte rettificatore interiore K(Kir) canali nell'endotelio vascolare dei capillari. Questo canale è attivato da Kesterno, ma anche dall'iperpolarizzazione stessa. Diffondendosi attraverso giunzioni gap, la corrente iperpolarizzante poi si rigenera in cellule endoteliali capillari adiacenti fino all'arteriolo, dove provoca il rilassamento del miocito e l'aumento della CBF20,21. Lo studio di questo meccanismo ci ha portato a sviluppare una preparazione capillare-parenchymal arteriola (CaPA) pressurizzata per misurare il diametro arteriolare durante la stimolazione capillare con agenti vasoattivi. La preparazione CaPA è composta da un segmento di arteriole intracerebrale cannulato con una ramificazione capillare intatta a valle. Le estremità capillari sono compresse sul fondo del vetro della camera da una micropipetta, che occia e stabilizza l'intera formazione vascolare20,21.
In precedenza abbiamo fatto innovazioni strumentali da imaging Preparati CaPA dalla corteccia del topo20,21 e arteriole dal ratto amigdala13 e ippocampo16,17. Poiché la vascolatura dell'ippocampa riceve maggiore attenzione a causa della sua suscettibilità alle condizioni patologiche, qui forniamo un metodo passo-passo per la preparazione del CaPA dall'ippocampo del topo (HiCaPA) che può essere utilizzato non solo negli studi funzionali NVC, ma anche nella biologia molecolare, nell'immunochimica e nell'elettrofisiologia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Syringe Filters</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>229751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-0 Nylon (12cm) Black</td>
			<td>Microsurgery Instruments, Inc</td>
			<td>S12-0 NYLON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &#8212; complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Water Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra&#8482; Miltex&#8482;Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML 133 hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NS309</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>PS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PP-83</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study

Dalle sottili alterazioni comportamentali alla demenza in fase avanzata, il danno vascolare si sviluppa in genere a seguito di ischemia cerebrale. L'ictus e l'arresto cardiaco sono malattie sessualmente dimorfiche, ed entrambi inducono l'ischemia cerebrale. Tuttavia, i progressi nella comprensione del danno vascolare vascolare, e quindi nello sviluppo di trattamenti specifici per il sesso, sono stati in parte limitati dalle sfide nello studio della microcircolazione cerebrale dai modelli murini negli studi funzionali. Qui, presentiamo un approccio per esaminare la segnalazione capillary-to-arteriola in una preparazione capillary-ppillaryle capillary-parenchymic (HiCaPA) ex vivo ippocampale -parenchymal (HiCaPA) dal cervello di topo. Descriviamo come isolare, cannulare e pressurizzare la microcircolazione per misurare il diametro arteriolare in risposta alla stimolazione capillare. Mostriamo quali controlli funzionali appropriati possono essere utilizzati per convalidare l'integrità di preparazione HiCaPA e visualizzare risultati tipici, tra cui il test del potassio come agente di accoppiamento neurovascolare e l'effetto dell'inibitore recentemente caratterizzato della famiglia di canali di potassio rettificante interno Kir2, ML133. Inoltre, confrontiamo le risposte nei preparati vinti da topi maschi e femmine. Mentre questi dati riflettono le indagini funzionali, il nostro approccio può essere utilizzato anche negli studi di biologia molecolare, immunochimica ed elettrofisiologia.

Icanali diconducono conduzione endoteliale di piccole endoterie (SK) e di conduzione intermedia (IK) Ca2,sensibili a K, esercitano un'influenza dilatoria sul diametro delle PA. L'applicazione del bagno di 1 -M NS309, un agonista sintetico IK e SK canale, causato dilatazione quasi massima (Figura 2A,B). Tuttavia, le cellule endoteliali capillari mancano di canali IK e SK e non hanno iperpolarizzato in risposta a NS309<sup...

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Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Il presente manoscritto descrive come isolare le arteriole e i capillari ippocampali dal cervello del topo e come pressurizzarli per la miografia a pressione, l'immunofluorescenza, la biochimica e gli studi molecolari.

Ex Vivo Pressurizzato Ippocampo Capillary-Parenchymal Arteriole Preparazione per lo Studio Funzionale

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Il nostro metodo consente lo studio dei vasi sanguigni situati in strutture che altrimenti sarebbero difficili da immaginare in Vivo, come l'ippocampo. Poiché i vasi sanguigni vengono rimossi dal tessuto cerebrale, la segnalazione tra i capillari e l'arteriola può essere studiata senza effetti fuori bersaglio sul tessuto circostante. Per isolare l'ippocampo, utilizzare piccole forbici di dissezione per tagliare la pelle lungo la linea mediana nella parte superiore della testa del mouse e spostare la pelle ai lati.Partendo dal lato caudale del cranio, tagliare il cranio lungo la linea mediana fino a raggiungere i bulbi olfattivi e rimuovere porzioni del cranio fino a quando il cerebro non viene esposto. Iniziando vicino al naso del topo, rimuovere lentamente il cervello, usando le forbici per tagliare i bulbi olfattivi, i nervi cranici e il midollo spinale. Immergere il cervello, il lato ventrale verso il basso nella salina tamponata MOPS, al centro di una piastra di dissezione, e posizionare la piastra sotto un microscopio a dissezione.Tenendo il bordo affilato parallelo al fondo del piatto, utilizzare la lama del rasoio per tagliare il cervello a metà lungo la fessura longitudinale in un colpo solo. Posizionare un emisfero al centro della piastra con la linea mediana rivolta verso il basso e spingere la lama del rasoio direttamente attraverso il tessuto lungo la fessura trasversale per rimuovere il cervelletto e il tronco encefalico. Ruotare l'emisfero in modo che il lato mediale sia rivolto verso l'alto e utilizzare una spatola per tenere il cervello in posizione.Inserire la punta di una seconda spatola sotto il corpo calloso, raccogliendo sotto il tessuto per rimuovere il talamo, il setto e l'ipotalamo dall'ippocampo. L'ippocampo dovrebbe ora essere visibile come una struttura curva vicino al lato posteriore del cerebro. Usando una spatola per tenere il cerebro in posizione, usa la seconda spatola per raccogliere l'ippocampo dal cerebro.Quindi trasferire gli ippocampi in una nuova piastra di dissezione, riempita circa a metà strada con una fresca soluzione di MOP. Per l'isolamento dell'arteriolo ippocampale, posizionare piccoli perni ad ogni estremità di un ippocampo per fissare il lato dell'arteria ippocampale campione verso l'alto. Utilizzando forcelle molto affilate, allungare delicatamente piccole sezioni degli ippocampi per allentare il tessuto che circonda le arteriole.E cerca attraverso i tessuti ippocampali dorsali per identificare le arterie trasversali esterne. Quando l'arteria è stata localizzata, afferrare l'arteria trasversale esterna dall'ippocampo e allontanarla lentamente dal tessuto per raccogliere le arteriole e i capillari. L'arteria di ogni ippocampo viene rimossa separatamente.Quando non ci sono più vasi da rimuovere, posizionare i campioni sul ghiaccio e scartare il tessuto ippocampale rimanente. Per la cannulazione delle arteriole, individuare e arteriolare con un ramo che termina con i capillari e posizionare l'arteriola in una camera d'organo. Spingere con attenzione la punta della cannula attraverso la parete dell'arteriola sotto l'area bersaglio per montare il vaso sanguigno.Quindi, far scorrere attentamente il vaso sulla cannula fino a quando non c'è abbastanza tessuto su cui posizionare la cravatta. Utilizzare 12-0 suture di nylon per creare un nodo sciolto che si adatta al vaso sanguigno e alla cannula e utilizzare un nodo mezzo intoppo per fissare le cravatte, tirare le estremità per stringere il nodo per fissare l'arteriola alla cannula. Fissare un'altra cravatta sull'altra estremità dell'arteriola per sigillarla.Sul lato opposto della camera, abbassare una seconda cannula fino a quando il punto della cannula fissa la cravatta all'estremità dell'arteriola. Quindi utilizzare una terza cannula per fissare il ramo capillare al coverslip, posizionando la punta vicino all'estremità del ramo, lasciando esposte le estremità dei capillari. Poiché il microcircolo cerebrale è squisitamente fragile, assicurati di ridurre al minimo lo stiramento e la movimentazione dei vasi durante la procedura di cannulazione per garantire la sopravvivenza delle arteriole.Per l'analisi della miografia a pressione, trasferire la camera su uno stadio di microscopio luminoso con software di registrazione e collegare i tubi di afflusso e deflusso alla camera per la profusione. Iniziare la profusione con 37 gradi Celsius Liquido cerebrospinale artificiale a una portata di quattro millilitri al minuto e attaccare la cannula pressante alla pompa peristaltica abbinata a un trasduttore di pressione. Portare la pressione interna a 20 millimetri di Mercurio e avviare il software di registrazione.Regola il microscopio e le impostazioni dell'immagine per ottenere l'immagine più chiara possibile. E utilizzare il software Edge Detection per verificare che l'arteriola sia di circa 15-30 micrometri di diametro quando è completamente dilatata. Una volta ottimizzate le impostazioni, iniziare la registrazione e aumentare la pressione intravascolare nel recipiente fino a 40 millimetri di Mercurio, registrando il diametro dell'arteriola con il software Edge Detection.Quindi abbondante la camera per 15-20 minuti per lavare la soluzione MOP. Per testare la vitalità del recipiente, applicare una soluzione micromolare NS309 alla profusione del bagno, il segmento arteriolare deve dilatarsi, dimostrando un tono miogenico dal 30 al 40%. Una volta stabilito il tono di base per l'arteriola, utilizzare un estrattore di vetro per fare cannule con un punto fine ad un'estremità e utilizzare le forcep per rompere la punta di ogni cannula, in modo che il farmaco di interesse possa fluire senza intoppi attraverso la punta a cinque libbre di pressione per pollice quadrato.Riempi la cannula con il farmaco di interesse. E caricare la cannula su un micromanipolatore a tre assi attaccato al microscopio. Collegare il tubo dal sistema di espulsione della pressione alla cannula e abbassare lentamente la cannula nel bagno vicino ai capillari, facendo attenzione a non colpire nessuna parte del recipiente o della camera.Per stimolare i capillari, abbassare la cannula al coverslip appena accanto ai capillari e attivare il sistema di espulsione della pressione con il tempo di espulsione desiderato. Alla fine della stimolazione, sollevare leggermente la cannula per evitare ulteriori stimolazioni. Per confermare che venivano stimolati solo i capillari, riempire la nuova cannula con un micromolare di soluzione NS309 e stimolare i capillari come dimostrato.Quindi ottenere la vasodilatazione massima bagnando la preparazione con la soluzione senza calcio. L'applicazione a bagno di un micromolare NS309 provoca una dilatazione quasi massima dell'arteriola a causa dei canali del potassio sensibili al calcio nell'endotelio. Le cellule endoteliali capillari, tuttavia, mancano di canali di conduttanza intermedi e piccoli e non iperpolarizzano in risposta all'agonista, di conseguenza, stimolando le estremità capillari con NS309, non causano dilatazione arteriolare a monte, questo indica che NS309 non ha raggiunto l'arteriola, e può essere utilizzato come controllo per accedere alla restrizione smoziale del composto applicato sui capillari per espulsione di pressione.Utilizzando la preparazione dell'arteriola parenchimica capillare ippocampale come dimostrato, l'applicazione di un fluido cerebrospinale artificiale integrato con 10 millimolare potassio alle estremità capillari, si traduce in una dilatazione arteriolare a monte che non differisce tra preparati di topi maschi e femmine. Inoltre, l'aggiunta dell'inibitore kir2 ML 133, abolisce virtualmente la dilatazione arteriolare indotta capillarmente, in risposta al potassio millimolare 10 nei preparati di topi maschi e femmine. Quando si monta il vesssel sanguigno, limitare le interazioni dirette con il vaso sanguigno per ridurre al minimo il danno e aumentare la vitalità del vaso.Una volta che il vaso sanguigno è stato isolato, diversi composti farmacologici possono essere testati o il vaso sanguigno può essere ulteriormente elaborato per studi di biologia olecolare, immunochimica o elettrofisiologia.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Preparazione di acuta fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche durante l&#39;invecchiamento e Amiloide Patologia

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Ricerca

Neuroscienze

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

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Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elettroporazione RNAi in Embryonic Cerebral Cortex Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Topo romboencefalo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura per studiare la migrazione Branchiomotor Neuron viso

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Test funzionale di due retine per<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Elettroretinogramma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

Impianto di silicio cronica sonde e registrazione delle cellule ippocampali posto in un apparato di tapis roulant arricchito

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Preparazione di fette acute di ippocampale umano per registrazioni elettrofisiologiche

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Preparazione del nervo sciatico di ratto per la neurofisiologia Ex Vivo

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for AMD Research

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration (Video) | JoVE 

Ex Vivo Imaging multimodale basato su OCT di occhi di donatori umani per la ricerca sulla degenerazione maculare legata all'età

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...