Name: ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00
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著者たちは、原稿に関する洞察力に満ちたコメントをジュール・モリンに感謝したいと思います。この研究は、CADASIL Together Have Hope非営利団体、女性の健康と研究センター、NHLBI R01HL136636(FD)からの賞によって資金提供されました。

すべての実験は、コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスの制度動物ケア利用委員会(IACUC)によって承認され、国立衛生研究所のガイドラインに従って行われました。
1. ソリューション
<ol><li>解剖のためにMOPS緩衝生理行を使用し、サンプルを使用する前に4°Cに保ちます。溶液にガスを入ないでください。次の組成でMOPS緩衝生理食合を準備する: 135 mM NaCl, 5 mM KCl...

<ol>
	<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex.">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+fragile+aspects+of+cortical+blood+flow+in+relation+to+the+underlying+angioarchitecture.">Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+Myogenic+Tone,+and+Vasodilator+Responses+in+Middle+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles:+Effect+of+Ischemia+and+Reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li><li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization.">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels.">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors,+calcium+signaling,+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation.">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li><li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles+with+Aging:+Role+of+Rho+Kinase+2+and+Impact+of+Genetic+Background.">Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+smallest+stroke:+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit.">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).</li><li>Koide, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+KV+channels+in+cerebral+small+vessel+pathologies.">The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).</li><li>Girouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+endfoot+Ca2++and+BK+channels+determine+both+arteriolar+dilation+and+constriction.">Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2,+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent,+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles.">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).</li><li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K++channel+function.">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).</li><li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+TRPV3+channel+Ca2++influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).</li><li>Johnson, A. C., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+hippocampal+arteriole+structure+and+function+in+a+rat+model+of+preeclampsia:+Potential+role+in+impaired+seizure-induced+hyperemia.">Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).</li><li>Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+impairment+in+spontaneously+hypertensive+rats+is+associated+with+hippocampal+hypoperfusion+and+hippocampal+vascular+dysfunction.">Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. , (2019).</li><li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurovascular+Unit+Coming+of+Age:+A+Journey+through+Neurovascular+Coupling+in+Health+and+Disease.">The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease.</a> Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).</li><li>Roy, C. S., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Regulation+of+the+Blood-supply+of+the+Brain.">On the Regulation of the Blood-supply of the Brain.</a> The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).</li><li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+K+-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow.">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+GqPCR+activity+controls+capillary+electrical+signaling+and+brain+blood+flow+through+PIP2+depletion.">Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+depletion+promotes+TRPV4+channel+activity+in+mouse+brain+capillary+endothelial+cells.">PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells.</a> eLife. 7, 351 (2018).</li><li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+description+of+membrane+current+and+its+application+to+conduction+and+excitation+in+nerve.">A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.</a> The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).</li><li>Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potentials+and+microenvironment+of+rat+dorsal+vagal+cells+in+vitro+during+energy+depletion.">Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion.</a> The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).</li><li>Filosa, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+potassium+signaling+couples+neuronal+activity+to+vasodilation+in+the+brain.">Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).</li><li>Attwell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow.">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li><li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+patterns+of+the+rat+hippocampal+formation.">Vascular patterns of the rat hippocampal formation.</a> Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).</li><li>Wang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+the+K(ir)2+family+of+inward+rectifier+potassium+channels+by+a+small+molecule+probe:+the+discovery,+SAR,+and+pharmacological+characterization+of+ML133.">Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133.</a> ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).</li><li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles.">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li><li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure.">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li><li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus.">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis,+potentially+impacting+cognitive+functions.">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li><li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation.">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li></ol>

本原稿に記載されている加圧されたHiCaPA(海馬毛細血管-パンレンキマル動脈)製剤は、分極化、加圧、および研究性の高い動脈29を分離、加圧、および研究するための確立された手順の延長である。我々は最近、脳毛細血管内皮細胞におけるKir2.1チャネルが神経活性化に関連する[K+]oにおいて感覚が増加し、上流動脈20を拡張する昇順の高い偏光シグ?...

脳表面の膜循環は、実験的なアクセシビリティの一部で、多くの研究の対象となっています。しかし、脳血管系のトポロジーは、異なる領域を作成します。血流をリダイレクトするための実質的な能力を有するアナストモーゼに富む堅牢な膜ネットワークとは対照的に、脳内性脳静脈内動脈(P)は限られた側頭供給を有し、それぞれが神経組織1、2の離散体積を透過する。これは、独特の生理学的特徴3、4、5、6、7、8と組み合わせることで、脳内動脈を脳血流(CBF)調節9、10にする血流にボトルネック効果を生じる。PAの分離およびカンギュレーションに固有の技術的な課題にもかかわらず、過去10年間は、加圧容器11、12、13、14、15、17を使用したex vivo機能研究への関心が高まっています。この関心の高まりの理由の一つは、神経血管カップリング(NVC)に対して行われたかなりの研究努力であり、脳機能性充血18を支持するメカニズムである。
地域的には、CBFは局所神経活性化19に続いて急速に増加することができる。NVCを制御する細胞機構およびシグナル伝達特性は不完全に理解されている。しかし、神経活動を感知し、上流動脈20、21、22を拡張する過分極電気信号に変換する際に、NVC中の脳毛細血管に対する予想外の役割を同定した。作用電位23、24および大導電Ca2+活性化K+(BK)チャネルの星腸エンドフィート25上の大導電率Ca2+活性化K+(BK)チャネルの開口部は、間質カリウムイオン濃度[K+]oを増加させ、その結果、毛細血管の血管内皮における強い内向き整流K+(Kir)チャネルの活性化をもたらす。このチャネルは、外部K+だけでなく、高分極自体によって活性化されます。ギャップ接合部を介して広がる、過分極電流は、その後、動脈まで隣接する毛細血管内皮細胞で再生し、そこで筋細胞弛緩およびCBF増加20、21を引き起こす。このメカニズムの研究は、血管活性剤による毛細血管刺激中に動脈径を測定するための加圧毛細血管-パン酸動脈(CaPA)製剤を開発することにつながりました。CaPA調製物は、無傷の下流の毛細血管の影響を有するカニューレ化された脳内動脈セグメントで構成される。毛細血管端部は、マイクロピペットによってチャンバーガラス底部に対して圧縮され、血管形成全体を閉塞し安定化させる20、21である。
我々は以前、マウス扁桃体13および海馬13、17からマウス皮質20、21および動脈からのCaPA製剤をイメージングすることによって器械的な革新を行った。海馬血管系は病理学的状態に対する感受性から注目を集める中、機能的NVC研究のみならず、分子生物学、免疫化学、電気生理学においても使用できるマウス海馬(HiCaPA)からのCaPA調製方法を段階的に提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Syringe Filters</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>229751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-0 Nylon (12cm) Black</td>
			<td>Microsurgery Instruments, Inc</td>
			<td>S12-0 NYLON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &#8212; complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Water Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra&#8482; Miltex&#8482;Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML 133 hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NS309</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>PS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PP-83</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study

微妙な行動変化から後期型認知症まで、血管認知障害は典型的には脳虚血の後に発症する。脳卒中と心停止は著しく性的に二形性疾患であり、どちらも脳虚血を誘発する。しかしながら、血管認知障害を理解し、その後性特異的な治療法を開発する進歩は、機能研究におけるマウスモデルからの脳微小循環の調査における課題によって部分的に制限されている。ここでは、マウス脳からの生体内海馬毛細血管-毛細血管-毛細血管-毛細血管-毛細血管性動脈(HiCaPA)製剤における毛細血管から動脈へのシグナル伝達を調べるアプローチを提示する。毛細血管刺激に応じて動脈径を測定するために微小循環を分離、カニューレート、加圧する方法について説明する。我々は、HiCaPA調製完全性を検証し、神経血管カップリング剤としてのカリウムの試験および最近特徴付けられたキル2内向き整流カリウムチャネルファミリーML133の効果を含む典型的な結果を表示するために使用できる適切な機能制御を示す。また、雄マウスと雌マウスから得られた調製物中の応答を比較する。これらのデータは機能的な調査を反映していますが、分子生物学、免疫化学、電気生理学の研究にも活用できます。

内皮小導電率(SK)および中間導電率(IK)Ca2+感受性K+チャネルは、CAの直径に拡張的な影響を及ぼす。合成IKおよびSKチャネルアゴニストである1μM NS309の浴適用は、最大膨張に近い原因となった(図2A,B)。しかし、毛細血管内皮細胞はIKおよびSKチャネルを欠き、NS30920に応答して過分極を行わなかった。そ?...

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Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

本原稿では、海馬動脈と毛細血管をマウス脳から分離する方法と、圧力ミオグラフィー、免疫蛍光、生化学、分子研究のためにそれらを加圧する方法について詳しく説明している。

機能的研究のためのEx Vivo加圧海馬毛細血管-パンレンキマル動脈製剤

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

我々の方法は、海馬のようなVivoで画像化することが困難であろう構造に位置する血管の研究を可能にする。血管は脳組織から取り除かれるため、毛細血管と動脈の間のシグナル伝達は、周囲の組織に対するオフターゲット効果なしに研究することができる。海馬を分離するには、小さな解剖ハサミを使用して、マウスの頭の上の正中線に沿って皮膚を切断し、皮膚を側面に移動させます。頭蓋骨の尾側から始めて、嗅球に達するまで正中線に沿って頭蓋骨を切断し、大脳が露出するまで頭蓋骨の一部を取り除きます。マウスの鼻付近から、耳鼻をゆっくりと取り除き、はさみを使って嗅球、頭蓋神経、脊髄を切り抜けます。脳を沈め、腹側をMOPS緩衝生理液線に下に下に、解剖板の中央に、解剖顕微鏡の下に置く。皿の底に平行に鋭い端を保持し、1ストロークで縦方向の裂け目に沿って半分に脳をカットするためにカミソリの刃を使用しています。中線を下に向けてプレートの中央に1つの半球を置き、横の裂け目に沿って組織を通してカミソリの刃をまっすぐに押して、小脳と脳幹を取り除きます。内側側が上向きになるように半球を回転させ、ヘラを使って脳を所定の位置に保持します。脳梁の下に2番目のヘラの先端を挿入し、組織の下にすくい、海馬から視床、中隔、視床下部を取り除きます。海馬は大脳の後部側付近の湾曲した構造として見えるはずです。1つのへらを使って大脳を所定の位置に保持し、2番目のへらを使って大脳から海馬をすくい取ります。その後、新鮮なMOP溶液で約半分を充填した新しい解剖プレートに海馬を転送します。海馬動脈分離の場合は、1つの海馬の両端に小さなピンを置き、海馬動脈側のサンプルを固定します。非常に鋭い鉗子を使用して、海馬の小さな部分を穏やかに伸ばして、細動脈を取り巻く組織を緩める。そして、外部横動脈を識別するために、側側海馬組織を検索します。動脈が配置されたら、海馬から外部横動脈をつかみ、ゆっくりと組織から引き離して細動脈と毛細血管を採取する。各海馬からの動脈は別々に除去される。除去する血管がなくなったら、サンプルを氷の上に置き、残りの海馬組織を捨てます。細動脈のカンヌレーションのために、毛細血管で終わる枝を持つ動脈を見つけ、動脈を臓器室に入れる。カニューレ先端を標的領域の下の動脈壁に慎重に押し込み、血管を装着します。その後、慎重にネクタイを配置するのに十分な組織があるまでカニューレに容器をスライドさせます。血管とカニューレの上に収まる緩い結び目を作るために12-0ナイロン縫合糸を使用し、ネクタイを固定するために半分のヒッチ結び目を使用し、カニューレに動脈を固定するために結び目を引き締めるために端を引っ張ります。それを密封するために動脈の反対側の端に別のネクタイを固定します。チャンバーの反対側で、カニューレのポイントが動脈の端のネクタイを下にピン留めするまで、2番目のカニューレを下げる。次に、3番目のカニューレを使用してキャピラリーブランチをカバースリップに固定し、先端を枝の端に近づけ、毛細血管の端部を露出させたままにします。脳の微小循環は絶妙に壊れやすいので、細動脈の生存を確実にするために、カヌレーション手順中に血管の伸張と取り扱いを最小限に抑えるようにしてください。圧力ミノグラフィー解析のために、記録ソフトウェアを用いて、部屋を光顕微鏡の段階に移し、流入管と流出管をチャンバに接続して拡散させます。毎分4ミリリットルの流量で37°Cの人工脳脊髄液で拡散を開始し、圧力トランスデューサーと組み合わせた蠕動ポンプに加圧カニューレを取り付けます。内圧を20ミリメートルのMercuryに持ち込み、録音ソフトウェアを起動します。顕微鏡と画像の設定を調整して、可能な限り鮮明な画像を実現します。そして、エッジ検出ソフトウェアを使用して、動脈が完全に拡張されたときに直径が約15〜30マイクロメートルであることを確認します。設定が最適化されたら、記録を開始し、血管内の血管内圧を最大40ミリメートルの水銀まで増加させ、エッジ検出ソフトウェアで動脈径を記録します。その後、MOP溶液を洗い流すために15〜20分間チャンバーを使い果たします。血管の生存率をテストするために、1つのマイクロモルNS309溶液を浴拡散に適用し、動脈管セグメントは拡張する必要があり、30〜40%の筋性トーンを示す。動脈のベースライントーンが確立されたら、ガラスの引き手を使用して一端に細かい点を持つカニューレを作り、鉗子を使って各カニューレの先端を壊し、目的の薬物が1平方インチ当たり5ポンドの圧力で先端を滑らかに流ることができるようにします。目的の薬でカニューレを埋めます.そして、顕微鏡に取り付けられた3軸マイクロマニピュレータにカニューレをロードします。圧力放出システムからカニューレにチューブを接続し、ゆっくりとキャピラリーの近くの浴槽にカニューレを下げ、容器またはチャンバーの一部に当たらないのに注意してください。毛細血管を刺激するには、キャピラのすぐ隣にあるカバースリップにカニューレを下げ、所望の吐出時間で圧力放出システムを作動させます。刺激の終わりに、カニューレをわずかに上げて、さらなる刺激を避ける。毛細血管のみが刺激されていることを確認するには、新しいカニューレをNS309溶液の1つのマイクロモルで満たし、実証したように毛細血管を刺激します。次いで、カルシウムフリー溶液で調製物を浴びることによって最大血管拡張を得る。1つのマイクロモルNS309の浴用途は、内皮のカルシウム感受性カリウムチャネルによる動脈動脈のほぼ最大拡張を引き起こす。しかし、毛細血管内皮細胞は、中間および小さい導電チャネルを欠き、アゴニストに応答して過分極を行わない、結果として、NS309で毛細血管の終了を刺激し、上流動脈拡張を引き起こさない、これはNS309が動脈に到達しなかったことを示し、そして、その制御として使用することができる海馬毛細管の毛細血管の花頭動脈管製剤を用いて、毛細管末端に10ミリモルカリウムを添加した人工脳脊髄液を適用すると、男性マウスと雌マウスの調製物間で変わらない上流動脈拡張をもたらす。また、Kir2阻害剤ML133を添加すると、毛細管誘導動脈拡張を事実上廃止し、雄マウスと雌マウスの両方から調製した10ミリモルカリウムに応答する。血液ベッセルを取り付ける場合、血管との直接的な相互作用を制限して損傷を最小限に抑え、血管の生存率を高めます。血管が単離されると、異なる薬物化合物を試験したり、オレキュラ生物学、免疫化学、または電気生理学の研究のために血管をさらに処理することができます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

老化とアミロイド病理の間にシナプス変化の研究のためのラットおよびトランスジェニックマウスからの急性海馬スライスの準備

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

神経形態形成の研究のための方法：<em&gt;エキソビボ</em胎児マウス大脳皮質&gt; RNAiのエレクトロポレーション

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

マウス後脳<em&gt;生体外</em&gt;文化顔面Branchiomotorニューロンの移行を研究する

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

同時<em&gt; ex vivoで</emによる二つの網膜の&gt;機能テスト<em&gt; in vivoで</em&gt;電図システム

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

慢性的なシリコン プローブと豊かなトレッドミル装置海馬場所細胞の記録

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

電気生理学的記録のための急性ヒト海馬スライスの調製

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Ex Vivo神経生理学のためのラット坐骨神経の調製

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for AMD Research

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration (Video) | JoVE 

エクスビボ 加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のOCTを用いたマルチモーダルイメージング

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...