Name: ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00
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저자는 원고에 대한 통찰력있는 의견에 줄스 모린에게 감사드립니다. 이 연구는 CADASIL 함께 우리는 희망 비영리 단체, 여성 건강 및 연구 센터, NHLBI R01HL136636 (FD)에서 상에 의해 투자되었다.

모든 실험은 콜로라도 대학, 안슈츠 의료 캠퍼스의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 국립 보건원의 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 솔루션
<ol><li>해부를 위해 MOPS 버퍼링 식염수를 사용하고 시료를 사용 전에 4 °C로 유지하십시오. 용액을 가스로 사용하지 마십시오. 다음 조성으로 MOPS 완충 식염수 준비: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4,1 mM...

<ol>
	<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex.">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+fragile+aspects+of+cortical+blood+flow+in+relation+to+the+underlying+angioarchitecture.">Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+Myogenic+Tone,+and+Vasodilator+Responses+in+Middle+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles:+Effect+of+Ischemia+and+Reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li><li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization.">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels.">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors,+calcium+signaling,+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation.">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li><li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles+with+Aging:+Role+of+Rho+Kinase+2+and+Impact+of+Genetic+Background.">Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+smallest+stroke:+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit.">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).</li><li>Koide, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+KV+channels+in+cerebral+small+vessel+pathologies.">The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).</li><li>Girouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+endfoot+Ca2++and+BK+channels+determine+both+arteriolar+dilation+and+constriction.">Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2,+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent,+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles.">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).</li><li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K++channel+function.">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).</li><li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+TRPV3+channel+Ca2++influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).</li><li>Johnson, A. C., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+hippocampal+arteriole+structure+and+function+in+a+rat+model+of+preeclampsia:+Potential+role+in+impaired+seizure-induced+hyperemia.">Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).</li><li>Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+impairment+in+spontaneously+hypertensive+rats+is+associated+with+hippocampal+hypoperfusion+and+hippocampal+vascular+dysfunction.">Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. , (2019).</li><li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurovascular+Unit+Coming+of+Age:+A+Journey+through+Neurovascular+Coupling+in+Health+and+Disease.">The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease.</a> Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).</li><li>Roy, C. S., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Regulation+of+the+Blood-supply+of+the+Brain.">On the Regulation of the Blood-supply of the Brain.</a> The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).</li><li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+K+-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow.">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+GqPCR+activity+controls+capillary+electrical+signaling+and+brain+blood+flow+through+PIP2+depletion.">Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+depletion+promotes+TRPV4+channel+activity+in+mouse+brain+capillary+endothelial+cells.">PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells.</a> eLife. 7, 351 (2018).</li><li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+description+of+membrane+current+and+its+application+to+conduction+and+excitation+in+nerve.">A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.</a> The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).</li><li>Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potentials+and+microenvironment+of+rat+dorsal+vagal+cells+in+vitro+during+energy+depletion.">Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion.</a> The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).</li><li>Filosa, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+potassium+signaling+couples+neuronal+activity+to+vasodilation+in+the+brain.">Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).</li><li>Attwell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow.">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li><li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+patterns+of+the+rat+hippocampal+formation.">Vascular patterns of the rat hippocampal formation.</a> Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).</li><li>Wang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+the+K(ir)2+family+of+inward+rectifier+potassium+channels+by+a+small+molecule+probe:+the+discovery,+SAR,+and+pharmacological+characterization+of+ML133.">Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133.</a> ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).</li><li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles.">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li><li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure.">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li><li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus.">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis,+potentially+impacting+cognitive+functions.">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li><li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation.">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li></ol>

본 원고에 기재된 가압 HiCaPA(해모세혈관-자영형 동맥) 제제는 중증 모낭 동맥 을 분리, 가압 및 연구하기 위한 당사의 잘 확립된 절차의 연장체이다29. 최근 뇌 모세관 내피 세포에서 Kir2.1 채널이 신경 활성화와 관련된 [K+]o에서 감각이 증가하고, 상류 동맥20을팽창시키는 오름차순 과극성 신호를 생성한다고 보고하였다. 모세 혈관에 대한 이전에...

뇌 표면의 pial 순환은 많은 연구의 대상이되었습니다, 부분적으로 때문에 실험 접근성. 그러나 대뇌 혈관 구조의 토폴로지는 뚜렷한 영역을 만듭니다. 혈류를 리디렉션하기위한 실질적인 용량을 가진 해부학이 풍부한 견고한 pial 네트워크와는 달리, 내측 중골 동맥 동맥 (PA)은 제한된 부수적 공급을 제시하며, 이들 각각은 신경 조직의 개별 부피를교배1,2. 이것은 독특한 생리적 특징3,4,5,6,7,8과결합하여 뇌혈류(CBF) 조절9,10을위한 중요한 부위로 뇌내 동맥을 만드는 혈류에 병목 현상 효과를 일으킨다. PA의 격리 및 통조림에 내재된 기술적 과제에도 불구하고, 지난 10년 동안 가압용기11,12,13,14,15,16,17을이용한 생체내 기능연구에 대한 관심이 높아지고 있다. 이러한 관심증가에 대한 이유 중 하나는 뇌 기능성 충혈을 지지하는 기전인 신경혈관 커플링(NVC)에 대한 상당한 연구 노력이 수행된 것이다18.
지역적으로, CBF는 현지 신경 활성화19에따라 급속하게 증가할 수 있다. NVC를 제어하는 셀룰러 메커니즘 및 신호 특성은 불완전하게 이해됩니다. 그러나, 우리는 신경 활동을 감지하고 상류 동맥20,21,22를팽창시키기 위하여 과극화 전기 신호로 번역하는 NVC 도중 두뇌 모세혈관을 위한 이전에 예기치 않은 역할을 확인했습니다. 행동 전위23,24 및 성상 세포 종받에 큰 전도도Ca2+활성화 된 K+ (BK) 채널의 개방25,26 간질 칼륨 이온 농도 [K+]o,이는 모세 혈관내 혈관 내 내 정류기 K+ (Kir) 채널의 활성화를 초래한다. 이 채널은 외부 K+에 의해뿐만 아니라 과분극 자체에 의해 활성화됩니다. 갭 접합을 통해 확산, 과분극 전류는 근세포 이완 및 CBF 증가20,21원인 arteriole까지 인접한 모세관 내피 세포에서 재생. 이 기계장치의 연구 결과는 혈관 활성에이전트를 가진 모세관 자극 도중 동맥 직경을 측정하기 위하여 가압 모세관-parenchymal arteriole (CaPA) 준비를 개발하기 위하여 저희를 지도했습니다. CaPA 제제는 손상되지 않은 하류 모세관 파급 효과를 가진 굴절식 중계 동맥 분절로 구성됩니다. 모세관 끝은 마이크로피펫에 의해 챔버 유리 바닥에 압축되며, 이는 전체 혈관형성을 20,21로막고 안정화시킵니다.
우리는 이전에 쥐 편도체 13 및 해마16, 17에서마우스 피질20,21 및 동맥에서 CaPA 제제를 이미징하여 도구적 혁신을 이루었다. 해마 혈관구조는 병리학적 조건에 대한 감수성으로 인해 더 많은 관심을 받고 있기 때문에, 여기서 우리는 기능적 NVC 연구뿐만 아니라 분자 생물학, 면역 화학 및 전기 생리학에서도 사용할 수있는 마우스 해마 (HiCaPA)에서 CaPA 준비를위한 단계별 방법을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Syringe Filters</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>229751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-0 Nylon (12cm) Black</td>
			<td>Microsurgery Instruments, Inc</td>
			<td>S12-0 NYLON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &#8212; complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Water Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra&#8482; Miltex&#8482;Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML 133 hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NS309</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>PS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PP-83</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study

미묘한 행동 변경에서 말기 치매에, 혈관 인식 손상은 전형적으로 대뇌 허혈 다음 발전합니다. 뇌졸중과 심장 마비는 현저하게 성적으로 이형질환이며, 둘 다 대뇌 허혈을 유발합니다. 그러나, 혈관 인지 장애를 이해 하 고 다음 성 별 치료를 개발에 진행, 기능 연구에서 마우스 모델에서 뇌 미세 순환을 조사에 의해 부분적으로 제한 되었습니다. 여기에서, 우리는 마우스 두뇌에서 전 생체 내 해모모세-자영-자영 아테리올(HiCaPA) 준비에서 모세관-아티올 신호신호를 검사하는 접근법을 제시한다. 우리는 모세관 자극에 응하여 동맥 직경을 측정하기 위하여 미세 순환을 분리, 통조림 및 가압하는 방법을 기술합니다. 우리는 HiCaPA 제제 무결성을 검증하고 신경 혈관 커플링 제로 칼륨을 테스트하고 Kir2 안쪽정류 칼륨 채널 패밀리, ML133의 최근 특징 억제제의 효과를 포함하여 전형적인 결과를 표시하는 데 사용할 수있는 적절한 기능 적 제어를 보여줍니다. 또한, 우리는 남성과 여성 마우스로부터 수득된 제제에서의 반응을 비교한다. 이러한 데이터는 기능적 조사를 반영하는 반면, 우리의 접근 방식은 분자 생물학, 면역 화학 및 전기 생리학 연구에서도 사용될 수 있습니다.

내피 소형 전도도 (SK) 및 중간 전도도 (IK) Ca2 +-민감한 K+ 채널은 PA의 직경에 경악영향을 미칩니다. 1 μM NS309의 목욕 적용, 합성 IK 및 SK 채널 작용제, 거의 최대 팽창 발생(그림 2A,B). 그러나, 모세관 내피 세포는 IK 및 SK 채널이 부족하고 NS30920에대한 반응으로 과분극화되지 않았다. 그 결과, 모세관을 자극?...

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Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

본 원고는 마우스 뇌에서 해마 동맥과 모세 혈관을 분리하는 방법과 압력 myography, 면역 형광, 생화학 및 분자 연구를 위해 그들을 가압하는 방법을 자세히 설명합니다.

Ex Vivo 가압 해모골 모세관-Parenchymal Arteriole 기능 적 연구를 위한 준비

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

우리의 방법은 그렇지 않으면 해마와 같은 Vivo에서 이미지하기 어려울 것이다 구조에 있는 혈관의 연구를 허용합니다. 혈관은 뇌 조직에서 제거되기 때문에 모세 혈관과 동맥 사이의 신호는 주변 조직에 대한 오프 타겟 효과없이 연구 할 수 있습니다. 해마를 분리하려면 작은 해부 가위를 사용하여 마우스 머리 상단의 중간선을 따라 피부를 자르고 피부를 측면으로 이동시합니다.두개골의 코달 측면에서 시작하여 후각 전구에 도달 할 때까지 중간선을 따라 두개골을 자르고 두개골이 노출 될 때까지 두개골의 일부를 제거하십시오. 마우스의 코 근처에서 시작하여 가위를 사용하여 후각 전구, 두개골 신경 및 척수를 잘라 내어 뇌를 천천히 제거합니다. 뇌를 침수하고, 복부 면을 MOPS 버퍼드 식염수, 해부 판의 중앙에 아래로 잠수하고, 해부 현미경 아래에 접시를 놓습니다.접시의 바닥에 평행날카로운 가장자리를 잡고, 한 스트로크에서 세로 균열을 따라 반으로 뇌를 잘라 면도날을 사용합니다. 중간선을 향한 접시 중앙에 한 반구를 놓고 소뇌와 뇌줄기를 제거하기 위해 횡방향 균열을 따라 조직을 통해 면도날을 똑바로 밀어 넣습니다. 내측이 위쪽을 향하고 있는지 반구를 회전시키고 주걱을 사용하여 뇌를 제자리에 고정시하십시오.코퍼스 캘로섬 아래에 두 번째 주걱 의 끝을 삽입, 해마에서 시상, 중격 및 시상 하부를 제거하기 위해 조직 아래에 특종. 해마는 이제 뇌의 후방 측면 근처의 곡선 구조로 볼 수 있어야합니다. 한 주걱을 사용하여 뇌막을 제자리에 고정시면 두 번째 주걱을 사용하여 뇌마를 자궁에서 내보냅니다.그런 다음 해마를 새로운 해부 판으로 옮기고, 신선한 MOP 용액으로 절반 정도 채워지도록 합니다. 해마 동맥 격리를 위해, 샘플 해마 동맥 측면을 위로 확보하기 위해 한 해마의 각 끝에 작은 핀을 배치합니다. 매우 날카로운 집게를 사용하여 해마의 작은 부분을 부드럽게 스트레칭하여 동맥을 둘러싼 조직을 풀어냅니다.그리고 외장 횡방향 동맥을 식별하기 위해 등쪽 해마 조직을 검색합니다. 동맥이 발견되면 해마에서 외부 횡단 동맥을 잡고 천천히 조직에서 당겨 동맥과 모세 혈관을 수집합니다. 각 해마의 동맥은 별도로 제거됩니다.더 이상 제거할 혈관이 없을 때, 얼음에 샘플을 놓고 나머지 해마 조직을 폐기하십시오. 동맥의 수조를 위해, 모세 혈관으로 끝나는 가지를 찾아 내고 동맥을 장기 챔버에 놓습니다. 조심스럽게 혈관을 장착하기 위해 대상 영역 아래 의 동맥 벽을 통해 캐뉼라 팁을 밀어.그런 다음, 조심스럽게 넥타이를 배치 할 수있는 충분한 조직이있을 때까지 캐뉼라에 혈관을 밀어. 12-0 나일론 봉합사를 사용하여 혈관과 캐뉼라에 맞는 느슨한 매듭을 만들고, 반 히치 매듭을 사용하여 넥타이를 고정하고, 끝을 당겨 매듭을 당겨 캐뉼라에 동맥을 고정하십시오. 아티리올의 다른 쪽 끝에 또 다른 넥타이를 고정하여 밀봉합니다.챔버의 반대편에, 캐뉼라의 지점이 동맥의 끝에 넥타이 아래로 핀 때까지 두 번째 캐뉼라를 낮춥다. 그런 다음 세 번째 캐뉼라를 사용하여 모세 혈관 가지를 표지 슬립에 고정하고 팁을 분기 의 끝 부분에 가깝게 두면서 모세 혈관의 끝이 노출됩니다. 뇌 미세 순환이 정교하게 깨지기 때문에, 동맥의 생존을 보장하기 위해 캐니레이션 절차 동안 혈관의 스트레칭과 처리를 최소화해야합니다.압력 myography 분석을 위해, 기록 소프트웨어와 함께 가벼운 현미경 단계로 챔버를 전송하고 풍부하기 위해 챔버에 유입 및 유출 튜브를 연결합니다. 분당 4밀리리터의 인공 뇌척수액37도로 증식을 시작하고 압력 트랜스듀서와 페어링된 연동 펌프에 가압 캐뉼라를 부착합니다. 내부 압력을 20밀리미터의 머큐리로 가져와 녹음 소프트웨어를 시작하십시오.현미경과 이미지 설정을 조정하여 가능한 가장 선명한 이미지를 구현합니다. 그리고 에지 검출 소프트웨어를 사용하여 동맥이 완전히 팽창될 때 직경이 약 15~30 마이크로미터인지 확인합니다. 설정이 최적화되면 레코딩을 시작하고 선박의 내혈관 압력을 최대 40mm까지 늘리는 동시에 에지 감지 소프트웨어로 동맥 직경을 기록합니다.그런 다음 15~20분 동안 챔버를 사용하여 MOP 용액을 씻어낸다. 선박의 생존 가능성을 테스트하려면, 목욕 풍부에 하나의 마이크로 몰러 NS309 용액을 적용, 동맥 세그먼트는 30 ~ 40 %의 근생 톤을 시연, 팽창한다. 동맥의 기준선 톤이 확립되면 유리 풀러를 사용하여 한쪽 끝에 미세한 포인트로 캐뉼라를 만들고 집게를 사용하여 각 캐뉼라의 끝을 깨뜨려 관심있는 약물이 평방 인치 당 5 파운드의 압력으로 끝을 통해 원활하게 흐를 수 있습니다.관심의 약물캐뉼라를 채웁니다. 그리고 현미경에 부착 된 3 축 미세 조작기에 캐뉼라를로드합니다. 압력 배출 시스템에서 캐뉼라에 튜브를 연결하고, 혈관이나 챔버의 일부를 치지 않도록 주의하여 카누라를 모세혈관 근처의 욕조로 천천히 낮춥니다.모세 혈관을 자극하기 위해, 모세 혈관 바로 옆에 있는 커버슬립으로 캐뉼라를 낮추고 원하는 배출 시간으로 압력 배출 시스템을 활성화한다. 자극의 끝에서, 추가 자극을 피하기 위해 약간 캐뉼라를 올립니다. 모세혈관만 자극되고 있음을 확인하려면 새로운 캐뉼라를 NS309 용액의 1마이크로몰라로 채우고 모세혈관을 자극합니다.그런 다음 칼슘이 없는 용액으로 준비하여 최대 혈관 확장을 얻습니다. 1개의 마이크로몰러 NS309의 목욕 응용은 내피의 칼슘 에 민감한 칼륨 채널로 인해 동맥의 거의 최대 팽창을 일으킵니다. 모세관 내피 세포는 그러나 중간 및 소형 전도성 채널이 부족하고 고뇌에 대한 응답으로 과극화하지 않으며, 그 결과, 모세관을 NS309로 자극하고, 상류 동맥 팽창을 일으키지 않으며, 이는 NS309가 동맥에 도달하지 못했고, 이는 포세피라압력에 대한 접근조절으로 사용될 수 있음을 나타낸다.입증된 바와 같이 해마 모세관 당면 성동맥 제제를 사용하여, 모세관 끝에 10 밀리머 칼륨으로 보충된 인공 뇌척수액의 적용은 남성과 여성 마우스의 제제마다 다르지 않은 상류 동맥 팽창을 초래한다. 또한, Kir2 억제제 ML 133의 첨가는, 모세관 유도 된 동맥 팽창을 사실상 폐지하며, 남성과 여성 마우스 모두에서 준비시 10 밀리머 칼륨에 대응한다. 혈액 베셀을 장착할 때 혈관과의 직접적인 상호 작용을 제한하여 손상을 최소화하고 혈관의 생존 가능성을 높입니다.일단 혈관이 고립되면, 다른 약 화합물을 시험할 수 있고 혈관은 전골 생물학, 면역화학, 또는 전기생리학 연구를 위해 추가처리될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

노화와 아밀로이드 병리 동안 시냅틱 얼터 레이션의 연구에 대한 고양이와 트렌스 제닉 마우스의 급성 Hippocampal 조각의 준비

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

연구

신경과학

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

마우스 후뇌<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 문화 얼굴 Branchiomotor 신경 세포의 마이 그 레이션을 연구하는

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

동시<em&gt; 생체</em두 망막의&gt; 기능 테스트로<em&gt; 생체</em&gt; 전위도 시스템

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

만성 실리콘 프로브 및 녹음 풍부한 디딜 방 아 장치에 Hippocampal 장소 세포의 이식

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

전기 생리학적 기록을 위한 급성 인간 해마 슬라이스의 준비

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Ex Vivo 신경 생리학을위한 쥐 좌골 신경의 제조

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for AMD Research

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration (Video) | JoVE 

Ex Vivo (생체 외 ) 연령 관련 황반변성 연구를 위한 인간 기증자 눈의 OCT 기반 다중 모드 이미징

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...