Name: ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Jules Morin for innsiktsfulle kommentarer til manuskriptet. Denne forskningen ble finansiert av utmerkelser fra CADASIL sammen vi har Hope non-profit organisasjon, Center for Women ' s Health and Research, og NHLBI R01HL136636 (FD).

Alle eksperimenter ble godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved University of Colorado, Anschutz Medical campus og ble utført i henhold til retningslinjene fra National Institutes of Health.
1. løsninger
<ol><li>Bruk MOPPER-bufret saltvann for disseksjon og for å holde prøvene ved 4 ° c før utnyttelsen. Ikke gass løsningen. Forbered MOPPER bufret saltvann med følgende sammensetning: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4<...

<ol>
	<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex.">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+fragile+aspects+of+cortical+blood+flow+in+relation+to+the+underlying+angioarchitecture.">Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+Myogenic+Tone,+and+Vasodilator+Responses+in+Middle+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles:+Effect+of+Ischemia+and+Reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li><li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization.">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels.">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors,+calcium+signaling,+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation.">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li><li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles+with+Aging:+Role+of+Rho+Kinase+2+and+Impact+of+Genetic+Background.">Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+smallest+stroke:+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit.">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).</li><li>Koide, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+KV+channels+in+cerebral+small+vessel+pathologies.">The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).</li><li>Girouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+endfoot+Ca2++and+BK+channels+determine+both+arteriolar+dilation+and+constriction.">Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2,+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent,+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles.">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).</li><li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K++channel+function.">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).</li><li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+TRPV3+channel+Ca2++influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).</li><li>Johnson, A. C., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+hippocampal+arteriole+structure+and+function+in+a+rat+model+of+preeclampsia:+Potential+role+in+impaired+seizure-induced+hyperemia.">Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).</li><li>Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+impairment+in+spontaneously+hypertensive+rats+is+associated+with+hippocampal+hypoperfusion+and+hippocampal+vascular+dysfunction.">Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. , (2019).</li><li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurovascular+Unit+Coming+of+Age:+A+Journey+through+Neurovascular+Coupling+in+Health+and+Disease.">The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease.</a> Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).</li><li>Roy, C. S., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Regulation+of+the+Blood-supply+of+the+Brain.">On the Regulation of the Blood-supply of the Brain.</a> The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).</li><li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+K+-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow.">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+GqPCR+activity+controls+capillary+electrical+signaling+and+brain+blood+flow+through+PIP2+depletion.">Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+depletion+promotes+TRPV4+channel+activity+in+mouse+brain+capillary+endothelial+cells.">PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells.</a> eLife. 7, 351 (2018).</li><li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+description+of+membrane+current+and+its+application+to+conduction+and+excitation+in+nerve.">A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.</a> The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).</li><li>Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potentials+and+microenvironment+of+rat+dorsal+vagal+cells+in+vitro+during+energy+depletion.">Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion.</a> The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).</li><li>Filosa, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+potassium+signaling+couples+neuronal+activity+to+vasodilation+in+the+brain.">Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).</li><li>Attwell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow.">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li><li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+patterns+of+the+rat+hippocampal+formation.">Vascular patterns of the rat hippocampal formation.</a> Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).</li><li>Wang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+the+K(ir)2+family+of+inward+rectifier+potassium+channels+by+a+small+molecule+probe:+the+discovery,+SAR,+and+pharmacological+characterization+of+ML133.">Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133.</a> ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).</li><li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles.">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li><li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure.">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li><li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus.">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis,+potentially+impacting+cognitive+functions.">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li><li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation.">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li></ol>

HiCaPA (hippocampus kapillær-parenkymatøs arteriole) som er beskrevet i dagens manuskript, er en forlengelse av vår veletablerte prosedyre for å isolere, pressurize og studere parenkymatøs arterioler29. Vi har nylig rapportert at KIR 2.1 kanaler i hjernen kapillær endothelial celler forstand øker i [K+]o assosiert med nevrale aktivisering, og generere en stigende hyperpolarizing signal som utvider oppstrøms arterioler20. Å avsløre denne tidli...

Den saify sirkulasjon på overflaten av hjernen har vært gjenstand for mye studier, dels på grunn av sin eksperimentelle tilgjengelighet. Topologien i cerebral blodkar skaper imidlertid atskilte områder. I motsetning til den robuste saify nettverk rik på anastomoser med betydelig kapasitet for å omdirigere blodstrømmen, den intracerebrale parenkymatøs arterioler (Pas) presentere begrenset sikkerhet forsyning, hver av dem perfusing en diskret volum av nervøse vev1,2. Dette skaper en flaskehals effekt på blodstrømmen som, kombinert med unike fysiologiske funksjoner3,4,5,6,7,8, gjør intracerebrale arterioler et avgjørende sted for cerebral blodstrøm (CBF) regulering9,10. Til tross for de tekniske utfordringene som ligger i isolasjon og kanyleringen av Pas, har det siste tiåret sett en økt interesse for ex vivo funksjons studier som bruker trykkbeholdere11,12,13,14,15,16,17. En av grunnene til denne økte interessen er betydelig forskningsinnsats utført på nevrovaskulære kopling (NVC), mekanismen opprettholde hjernen funksjonell hyperemia18.
Regionalt kan CBF raskt øke følgende lokale nevrale aktivisering19. Den cellulære mekanismer og signalering egenskaper kontrollerende NVC er ufullstendig forstått. Men vi identifiserte en tidligere uforutsett rolle for hjernen blodkar under NVC i sensing neural aktivitet og oversette den til en hyperpolarizing elektrisk signal til dilate oppstrøms arterioler20,21,22. Action potensialer23,24 og åpning av store konduktans ca2 +-aktivert K+ (BK) kanaler på astrocytic endfeet25,26 øke interstitiell kalium ion konsentrasjon [K+]o, som resulterer i aktivering av sterke innover likeretter K+ (KIR) kanaler i vaskulær endotelet av blodkar. Denne kanalen er aktivert av eksterne K+ men også av hyperpolarization selv. Sprer seg gjennom gap veikryss, hyperpolarizing strøm deretter regenererer i tilstøtende kapillær endothelial celler opp til arteriole, hvor det fører til myocyte avslapping og CBF øke20,21. Studiet av denne mekanismen førte oss til å utvikle en trykk kapillær-parenkymatøs arteriole (CaPA) forberedelse til å måle arterioler diameter under kapillær stimulering med vasoactive midler. Den CaPA preparatet består av et kanylert intracerebrale arteriole segment med en intakt, nedstrøms kapillær forgreninger. Kapillær endene er komprimert mot kammer glass bunnen av en micropipette, som dualcare og stabiliserer hele vaskulær formasjon20,21.
Vi har tidligere gjort instrumental innovasjoner av Imaging CaPA preparater fra musen cortex20,21 og arterioler fra rotte amygdala13 og hippocampus16,17. Som hippocampus blodkar mottar mer oppmerksomhet på grunn av sin mottakelighet for patologiske tilstander, her gir vi en trinnvis metode for CaPA forberedelse fra musen hippocampus (HiCaPA) som ikke bare kan brukes i funksjonelle NVC studier, men også i molekylærbiologi, immunokjemi, og elektrofysiologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Syringe Filters</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>229751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-0 Nylon (12cm) Black</td>
			<td>Microsurgery Instruments, Inc</td>
			<td>S12-0 NYLON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &#8212; complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Water Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra&#8482; Miltex&#8482;Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML 133 hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NS309</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>PS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PP-83</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study

Fra subtile atferdsendringer til sen-stadiet demens, vaskulær kognitiv svekkelse vanligvis utvikler følgende cerebral iskemi. Hjerneslag og hjertestans er bemerkelsesverdig seksuelt dimorphic sykdommer, og begge induserer cerebral iskemi. Men fremgang i forståelsen av vaskulær kognitiv svekkelse, og deretter utvikle sex-spesifikke behandlinger, har vært delvis begrenset av utfordringer i å undersøke hjernen mikrosirkulasjonen fra musemodeller i funksjonelle studier. Her presenterer vi en tilnærming for å undersøke kapillær-til-arteriole signalering i en ex vivo hippocampus kapillær-parenkymatøs Arteriole (HiCaPA) forberedelse fra mus hjernen. Vi beskriver hvordan du isolerer, kannelerer og pressurize mikrosirkulasjonen for å måle arterioler diameter som respons på kapillær stimulering. Vi viser hvilke egnede funksjonelle kontroller kan brukes til å validere HiCaPA forberedelse integritet og vise typiske resultater, inkludert testing kalium som en nevrovaskulære kopling agent og effekten av den nylig karakterisert hemmer av Kir2 innover rectifying kalium kanal familien, ML133. Videre sammenligner vi svarene i forberedelsene innhentet fra mannlige og kvinnelige mus. Selv om disse dataene reflekterer funksjonelle undersøkelser, kan tilnærmingen vår også brukes i molekylærbiologi, immunokjemi og elektrofysiologi studier.

Endothelial små-konduktans (SK) og middels-konduktans (IK) ca2 +-sensitive K+ Channels utøve en Dilatory innflytelse på diameteren av Pas. Bad anvendelse av 1 μM NS309, en syntetisk IK og SK kanal Agonistiske, forårsaket nær maksimal utvidelse (figur 2a, B). Men kapillær endothelial celler mangler IK og SK kanaler og ikke hyperpolarize som svar på NS30920. Som et resultat av stimulerende k...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study at JoVE.com

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Den nåværende manuskriptet detaljer hvordan å isolere hippocampus arterioler og blodkar fra musen hjernen og hvordan å pressurize dem for press myography, immunofluorescence, biokjemi, og molekylær studier.

Ex vivo trykk hippocampus kapillær-Parenkymatøs Arteriole forberedelse for funksjonell studie

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Vår metode gjør det mulig å studere blodkar som ligger i strukturer som ellers ville være vanskelig å bilde i Vivo, for eksempel hippocampus. Fordi blodårene fjernes fra hjernevevet, kan signalene mellom kapillærene og arteriole studeres uten off-target effekter på det omkringliggende vevet. For å isolere hippocampus, bruk små disseksjonsaks for å kutte huden langs midtlinjen på toppen av musens hode og flytt huden til sidene.Starter på den kaudale siden av skallen, kutt skallen langs midtlinjen til olfaktoriske pærer er nådd og fjern deler av skallen til cerebrum er utsatt. Starter nær nesen av musen, sakte fjerne hjernen, ved hjelp av saksen til å skjære gjennom olfactory pærer, kraniale nerver, og ryggmargen. Senk hjernen, ventral side ned i MOPS Bufret saltvann, i midten av en disseksjonsplate, og plasser platen under et disseksjonsmikroskop.Hold den skarpe kanten parallelt med bunnen av parabolen, bruk barberblad for å kutte hjernen i to langs langsgående sprekk i ett slag. Plasser en halvkule i midten av platen med midtlinjen vendt ned og skyv barberbladet rett gjennom vevet langs tverrgående sprekk for å fjerne lillehjernen og hjernestammen. Roter halvkule slik at den mediale siden vender opp og bruker en slikkepott for å holde hjernen på plass.Sett spissen av en annen slikkepott under corpus callosum, scooping under vevet for å fjerne thalamus, septum, og hypothalamus fra hippocampus. Hippocampus skal nå være synlig som en buet struktur nær den bakre siden av cerebrum. Bruk en slikkepott til å holde cerebrum på plass, bruk den andre slikkepotten til å øse hippocampus ut av cerebrum.Deretter overfører hippocampi til en ny disseksjonsplate, fylt omtrent halvveis med fersk MOP-løsning. For hippocampal arteriole isolasjon, plasser små pinner i hver ende av en hippocampus for å sikre prøven hippocampal arterie side opp. Bruk svært skarpe tang, forsiktig strekke små deler av hippocampi for å løsne vevet rundt arteriolene.Og søk gjennom det dorsale hippocampal vev for å identifisere de ytre tverrgående arteriene. Når arterien har blitt plassert, ta tak i den ytre tverrgående arterien fra hippocampus og trekk den sakte bort fra vevet for å samle arteriene og kapillærene. Arterien fra hver hippocampus fjernes separat.Når det ikke er flere fartøy som skal fjernes, legg prøvene på is og kast det gjenværende hippocampalvevet. For kanyler, finn og arteriole med en gren som slutter med kapillærer og legg arteriole i et organkammer. Skyv forsiktig kanylespissen gjennom arterioleveggen under målområdet for å montere blodkaret.Skyv deretter forsiktig fartøyet på kanylen til det er nok vev til å plassere slipset. Bruk 12-0 nylon suturer for å lage en løs knute som passer over blodkaret og kanylen, og bruk en halv haik knute for å sikre båndene, trekk endene for å stramme knuten for å sikre arteriole til kanylen. Fest et annet slips i den andre enden av arteriole for å forsegle den.På motsatt side av kammeret, senk en andre kanyle til punktet av kanylen pinner ned slipset på enden av arteriole. Bruk deretter en tredje kanyle til å feste kapillærgrenen til dekkglasset, og plasser spissen nær enden av grenen, mens endene av kapillærene blir eksponert. Som hjernen mikrosirkulasjonen er utsøkt skjør, sørg for å minimere strekking og håndtering av fartøyene under hermetulering prosedyren for å sikre overlevelse av arteriolene.For trykkmyografianalyse, overfør kammeret til et lett mikroskop stadium med opptaksprogramvare og koble tilsig og utstrømningsrør til kammeret for overflod. Start overfloden med 37 grader Celsius Kunstig cerebrospinalvæske med en fire milliliter per minutt strømningshastighet, og fest trykknekt kanylen til peristaltisk pumpe sammen med en trykktransduser. Bring det interne trykket til 20 millimeter Kvikksølv og start opptaksprogramvaren.Juster mikroskopet og bildeinnstillingene for å oppnå det klareste bildet som er mulig. Og bruk Edge Detection-programvaren til å kontrollere at arteriole er ca 15 til 30 mikrometer i diameter når den er fullt utvidet. Når innstillingene er optimalisert, begynner du opptaket og øker det intravaskulære trykket i fartøyet opptil 40 millimeter Kvikksølv, mens du registrerer arteriolediameteren med Edge Detection-programvaren.Deretter rikelig kammeret i 15 til 20 minutter for å vaske ut MOP-løsningen. For å teste fartøyets levedyktighet, bruk en mikromust NS309-løsning på badefifusjonen, det arteriolar segmentet skal utvide, og demonstrere en 30 til 40% myogen tone. Når grunntonen for arteriole er etablert, bruk en glasstrekker for å lage kanyler med et fint punkt i den ene enden, og bruk tang til å bryte spissen av hver kanyle, slik at stoffet av interesse kan flyte jevnt gjennom spissen på fem pounds av trykk per kvadrattomme.Fyll kanylen med stoffet av interesse. Og legg kanylen på en treakse mikromanipulator festet til mikroskopet. Koble slangen fra trykkutstøtingssystemet til kanylen, og senk kanylen langsomt ned i badekaret i nærheten av kapillærene, og ta vare på å ikke treffe noen del av fartøyet eller kammeret.For å stimulere kapillærene, senk kanylen til dekkglasset like ved kapillærene og aktiver trykkutstøtingssystemet med ønsket utstøtingstid. På slutten av stimuleringen, løft kanylen litt for å unngå ytterligere stimulering. For å bekrefte at bare kapillærene ble stimulert, fyll den nye kanylen med en mikromos av NS309-oppløsning og stimulere kapillærene som vist.Oppnå deretter maksimal vasodilatasjon ved å bade preparatet med den kalsiumfrie løsningen. Bath påføring av en mikromolar NS309 forårsaker en nær maksimal utvidelse av arteriole på grunn av kalsiumfølsomme kaliumkanaler i endotelet. Kapillære endotelceller mangler imidlertid mellomliggende og små kondukskanaler og hyperpolariserer ikke som svar på agonisten, som et resultat, stimulerende kapillærender slutter med NS309, forårsaker ikke oppstrøms arteriell utvidelse, dette indikerer at NS309 ikke nådde arteriole, og kan brukes som en kontroll for å få tilgang til den spaciale begrensningen av forbindelsen som brukes på kapillær ved trykkutstøting.Ved hjelp av hippocampal kapillær parenchymal arteriole forberedelse som demonstrert, anvendelsen av en kunstig cerebrospinalvæske supplert med 10 millimolar Kalium til kapillære ender, resulterer i en oppstrøms arteriell utvidelse som ikke varierer mellom preparater fra mannlige og kvinnelige mus. Videre, tilsetning av Kir2-hemmeren ML 133, nesten avskaffer kapillær indusert arteriolar utvidelse, som svar på 10 millimolar kalium i preparater fra både mannlige og kvinnelige mus. Når du monterer blodsysselen, begrense direkte interaksjoner med blodkaret for å minimere skaden på, og øke levedyktigheten til fartøyet.Når blodkaret er isolert, kan ulike legemiddelforbindelser testes eller blodkaret kan behandles videre for olecular biologi, immunkjemi eller elektrofysiologistudier.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Metoder for å studere nevrale morphogenesis:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation i Embryonic murin Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mus hindbrain<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur å studere Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funksjonell testing av to netthinne etter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetic Disseksjon av Fear kretser i hjernen skiver

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

Implantering av kronisk Silicon sonder og opptak av hippocampus sted celler i et beriket tredemølle apparat

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Fremstilling av akutte menneskelige hippocampale skiver for elektrofysiologiske opptak

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Forberedelse av rotte isjiasnerven for Ex Vivo neurofysiologi

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for AMD Research

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration (Video) | JoVE 

Eks Vivo OCT-basert multimodal avbildning av menneskelige donorøyne for forskning på aldersrelatert makuladegenerasjon

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...