Name: ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Джулс Морин за глубокие комментарии к рукописи. Это исследование было профинансировано наградами от некоммерческой организации CADASIL Together We Have Hope, Центра здоровья и исследований женщин и NHLBI R01HL136636 (FD).

Все эксперименты были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Колорадо, медицинский кампус Аншуц и были проведены в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения.
1. Решения
<ol><li>Испол?...

<ol>
	<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex.">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+fragile+aspects+of+cortical+blood+flow+in+relation+to+the+underlying+angioarchitecture.">Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+Myogenic+Tone,+and+Vasodilator+Responses+in+Middle+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles:+Effect+of+Ischemia+and+Reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li><li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization.">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels.">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors,+calcium+signaling,+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation.">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li><li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles+with+Aging:+Role+of+Rho+Kinase+2+and+Impact+of+Genetic+Background.">Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+smallest+stroke:+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit.">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).</li><li>Koide, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+KV+channels+in+cerebral+small+vessel+pathologies.">The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).</li><li>Girouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+endfoot+Ca2++and+BK+channels+determine+both+arteriolar+dilation+and+constriction.">Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2,+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent,+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles.">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).</li><li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K++channel+function.">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).</li><li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+TRPV3+channel+Ca2++influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).</li><li>Johnson, A. C., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+hippocampal+arteriole+structure+and+function+in+a+rat+model+of+preeclampsia:+Potential+role+in+impaired+seizure-induced+hyperemia.">Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).</li><li>Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+impairment+in+spontaneously+hypertensive+rats+is+associated+with+hippocampal+hypoperfusion+and+hippocampal+vascular+dysfunction.">Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. , (2019).</li><li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurovascular+Unit+Coming+of+Age:+A+Journey+through+Neurovascular+Coupling+in+Health+and+Disease.">The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease.</a> Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).</li><li>Roy, C. S., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Regulation+of+the+Blood-supply+of+the+Brain.">On the Regulation of the Blood-supply of the Brain.</a> The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).</li><li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+K+-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow.">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+GqPCR+activity+controls+capillary+electrical+signaling+and+brain+blood+flow+through+PIP2+depletion.">Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+depletion+promotes+TRPV4+channel+activity+in+mouse+brain+capillary+endothelial+cells.">PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells.</a> eLife. 7, 351 (2018).</li><li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+description+of+membrane+current+and+its+application+to+conduction+and+excitation+in+nerve.">A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.</a> The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).</li><li>Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potentials+and+microenvironment+of+rat+dorsal+vagal+cells+in+vitro+during+energy+depletion.">Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion.</a> The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).</li><li>Filosa, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+potassium+signaling+couples+neuronal+activity+to+vasodilation+in+the+brain.">Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).</li><li>Attwell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow.">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li><li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+patterns+of+the+rat+hippocampal+formation.">Vascular patterns of the rat hippocampal formation.</a> Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).</li><li>Wang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+the+K(ir)2+family+of+inward+rectifier+potassium+channels+by+a+small+molecule+probe:+the+discovery,+SAR,+and+pharmacological+characterization+of+ML133.">Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133.</a> ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).</li><li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles.">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li><li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure.">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li><li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus.">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis,+potentially+impacting+cognitive+functions.">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li><li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation.">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li></ol>

Препарат HiCaPA под давлением HiCaPA (гиппокампа капиллярно-паранхимального артериола), описанный в настоящей рукописи, является продолжением нашей устоявшейся процедуры изоляции, давления и изучения паренхимальных артериол29. Недавно мы сообщили, что Kir2.1 каналов в мозге капил?...

Pial циркуляции на поверхности мозга был объектом много исследований, отчасти из-за его экспериментальной доступности. Однако топология сосуды головного мозга создает отдельные регионы. В отличие от надежной пиальной сети, богатой анастомосами со значительной способностью перенаправлять кровоток, внутримозговые паренхимальные артериолы (ПА) представляют ограниченное обеспечение, каждый из которых пронизывает дискретный объем нервной ткани1,2. Это создает узкое место влияние на кровоток, который, в сочетании с уникальными физиологическими особенностями3,4,5,6,7,8, делает внутримозговые артериолы важным местом для мозгового кровотока (CBF) регулирование9,10. Несмотря на технические проблемы, присущие изоляции и канистра ПА, в последнее десятилетие наблюдается повышенный интерес к ex vivo функциональных исследований с использованием под давлением судов11,12,13,14,15,16,17. Одной из причин такого повышенного интереса является значительный исследовательский опыт, проведенный на нервно-сосудистых сцепления (NVC), механизм поддержания мозга функциональной гиперемии18.
На региональном уровне, CBF может быстро увеличиться после локальной нейроннойактивации 19. Сотовые механизмы и сигнальные свойства, контролирующие NVC, не полностью понятны. Тем не менее, мы определили ранее непредвиденную роль для капилляров мозга во время NVC в зондировании нейронной активности и переводе его в гиперполяризующий электрический сигнал, чтобы расшифывать вверх по течению артериолы20,21,22. Потенциалы действий23,24 и открытие крупнопроводимого Ca 2-активированныхканалов K(BK) на астроцитарных эндфутах25,26 увеличивают интерстициальную концентрацию иона калия, что приводит к активации сильного внутреннего выпрямителя K(Кир) каналов в сосудистом эндотелии капилляров. Этот канал активируется внешнимK, но и самой гиперполяризации. Распространение через разрыв узлов, гиперполяризующий ток затем регенерирует в соседних капиллярных эндотелиальных клеток до артериола, где он вызывает релаксацию миоцитов и CBF увеличение20,21. Изучение этого механизма привело нас к разработке под давлением капиллярно-паранхимального артериола (CaPA) для измерения диаметра артериоляров во время стимуляции капилляров с помощью вазоактивных агентов. Препарат CaPA состоит из консервированного внутримозгового артериола сегмента с нетронутыми, вниз по течению капиллярных последствий. Концы капилляров сжимаются на дно камерного стекла микропипеттом, который окклюзии и стабилизирует все сосудистое образование20,21.
Ранее мы сделали инструментальные инновации, изображая препараты CaPA из коры мыши20,21 и артериол от крыс миндалины13 и гиппокампа16,17. Поскольку гиппокампа сосуды получает больше внимания из-за его восприимчивости к патологическим условиям, здесь мы предоставляем пошаговый метод для подготовки КаПА из мыши гиппокампа (HiCaPA), который может быть использован не только в функциональных исследованиях NVC, но и в молекулярной биологии, иммунохимии и электрофизиологии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Syringe Filters</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>229751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-0 Nylon (12cm) Black</td>
			<td>Microsurgery Instruments, Inc</td>
			<td>S12-0 NYLON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &#8212; complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Water Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra&#8482; Miltex&#8482;Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML 133 hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NS309</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>PS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PP-83</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study

От тонких поведенческих изменений до поздней стадии деменции, сосудистые когнитивные нарушения обычно развивается после ишемии головного мозга. Инсульт и остановка сердца удивительно сексуально диморфных заболеваний, и оба вызывают ишемию головного мозга. Тем не менее, прогресс в понимании сосудистых когнитивных нарушений, а затем разработки секс-специфических методов лечения, была частично ограничена проблемами в исследовании микроциркуляции мозга из моделей мыши в функциональных исследованиях. Здесь мы представляем подход к изучению капилляров к артериолу сигнализации в ex vivo гиппокампа капилляра-паранхимального артериола (HiCaPA) препарат из мозга мыши. Мы описываем, как изолировать, кануляции и давления микроциркуляции для измерения диаметра артериоляров в ответ на стимуляцию капилляров. Мы показываем, какие соответствующие функциональные элементы управления могут быть использованы для проверки целостности подготовки HiCaPA и отображения типичных результатов, в том числе тестирование калия в качестве нервно-сосудистого связующего агента и эффект недавно характеризуется ингибитор Kir2 внутренне выправила калий канала семьи, ML133. Кроме того, мы сравниваем ответы в препаратах, полученных от мышей мужского и женского пола. Хотя эти данные отражают функциональные исследования, наш подход также может быть использован в молекулярной биологии, иммунохимии и электрофизиологии исследований.

Эндотелиальная малопроводимость (SK) и промежуточная проводимость (IK) Ca2 -чувствительныеканалы K- оказывают расширительное влияние на диаметр ПА. Ванна применение 1 мкм NS309, синтетический IK и SK канал агонист, вызванные вблизи максимального расширения<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study at JoVE.com

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

В настоящей рукописи подробно описано, как изолировать гиппокампа артериолы и капилляры из мозга мыши и как надавить на них для давления myography, иммунофлюоресценции, биохимии и молекулярных исследований.

Ex Vivo Под давлением Гиппокампального Капилляры-Паранчимал Артериол Подготовка для функционального исследования

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Наш метод позволяет изучать кровеносные сосуды, расположенные в структурах, которые в противном случае было бы трудно изображение в Vivo, таких как гиппокамп. Поскольку кровеносные сосуды удаляются из ткани мозга, сигнализация между капиллярами и артериолом может быть изучена без нецелевых воздействий на окружающие ткани. Чтобы изолировать гиппокамп, используйте небольшие ножницы для вскрытия, чтобы сократить кожу вдоль средней линии в верхней части головы мыши и переместить кожу в стороны.Начиная с хвостовой стороны черепа, вырезать череп вдоль средней линии, пока обонятельные луковицы не будут достигнуты и удалить части черепа, пока головной мозг подвергается. Начиная с носа мыши, медленно удалить мозг, используя ножницы, чтобы прорезать обонятельные луковицы, черепные нервы и спинной мозг. Погрузите мозг, брюшной стороной вниз в MOPS Buffered Saline, в центре пластины вскрытия, и поместите пластину под микроскопом вскрытия.Удерживая острый край параллельно нижней части блюда, используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать мозг пополам вдоль продольной трещины одним ударом. Поместите одно полушарие в центре пластины с средней линией лицом вниз и нажмите лезвие бритвы прямо через ткань вдоль поперечной трещины, чтобы удалить мозжечок и ствол мозга. Поверните полушарие так, чтобы медиальная сторона была обращена вверх и используйте шпатель, чтобы держать мозг на месте.Вставьте кончик второго шпателя под корпус мозоли, черпая под тканью, чтобы удалить таламус, перегородку и гипоталамус из гиппокампа. Гиппокамп теперь должен быть виден как изогнутая структура вблизи задней стороны головного мозга. Используя один шпатель, чтобы держать мозг на месте, используйте второй шпатель, чтобы зачерпнуть гиппокамп из головного мозга.Затем перенесите гиппокамп на новую пластину вскрытия, заполненную примерно на полпути свежим раствором MOP. Для изоляции гиппокампа артериола, поместите небольшие булавки на каждом конце одного гиппокампа, чтобы обеспечить образец гиппокампа артерии сторону вверх. Используя очень острые типсы, аккуратно растягивайте небольшие участки гиппокампа, чтобы ослабить ткань, окружающую артериолы.И поиск через спинной гиппокампа тканей для выявления внешних поперечных артерий. Когда артерия была расположена, захватить внешнюю поперечную артерию из гиппокампа и медленно вытащить его из ткани, чтобы собрать артериолы и капилляры. Артерия из каждого гиппокампа удаляется отдельно.Когда больше не будет сосудов, которые необходимо удалить, поместите образцы на лед и отбросьте оставшуюся ткань гиппокампа. Для канюкуляции артериол, найти и arteriole с ветвью, которая заканчивается капилляров и место arteriole в органную камеру. Тщательно нажмите кончик канюли через стенку arteriole ниже целевой области, чтобы смонтировать кровеносный сосуд.Затем осторожно сдвиньте сосуд на канюлю, пока не будет достаточно ткани, на которой можно разместить галстук. Используйте 12-0 нейлоновых швов, чтобы сделать свободный узел, который будет соответствовать над кровеносным сосудом и канюлей, и использовать половину заминки узел для обеспечения связей, тянуть концы, чтобы затянуть узел, чтобы обеспечить arteriole к канюле. Закретте другой галстук на другом конце артериола, чтобы запечатать его.На противоположной стороне камеры опустите вторую канюлю до тех пор, пока точка канюлы не приколоет галстук на конце артериола. Затем используйте третью канюлю, чтобы прикрепить капиллярную ветвь к крышке, поместив кончик близко к концу ветви, оставляя концы капилляров открытыми. Поскольку микроциркуляция мозга изысканно хрупкая, не забудьте свести к минимуму растяжение и обработку сосудов во время процедуры каннюляции, чтобы обеспечить выживание артериол.Для анализа миографии давления перенесите камеру на сцену светового микроскопа с помощью программного обеспечения для записи и соедините приток и отток труб в камеру для изобилия. Начните изобилие с 37 градусов по Цельсию Искусственная спинномозговая жидкость на четыре миллилитра в минуту скорости потока, и приложите давление канюли перистальтического насоса в паре с давлением преобразователя. Доввейте внутреннее давление до 20 миллиметров Меркурия и запустите программное обеспечение для записи.Отрегулируйте микроскоп и настройки изображения, чтобы получить максимально четкое изображение. И используйте программное обеспечение Edge Detection, чтобы проверить, что arteriole составляет около 15 до 30 микрометров в диаметре, когда он полностью расширен. После оптимизации настроек начните запись и увеличьте внутрисосудийное давление в сосуде до 40 миллиметров Меркурия, записывая диаметр артериола с помощью программного обеспечения Edge Detection.Затем обильное камеру в течение 15 до 20 минут, чтобы вымыть раствор MOP. Чтобы проверить жизнеспособность сосуда, применить один раствор микромолара NS309 к изобилию ванны, артериолярный сегмент должен расшириться, демонстрируя 30-40%миогенный тон. После того, как базовый тон для arteriole была создана, использовать стеклянный шкив, чтобы сделать канюли с тонкой точкой на одном конце, и использовать типсы, чтобы сломать кончик каждой канюли, так что препарат интерес может плавно течь через кончик на пять фунтов давления на квадратный дюйм.Заполните канюлю препаратом, представляющим интерес. И загрузите канюлю на трехосевой микроманипулятор, прикрепленный к микроскопу. Соедините трубки от системы выброса давления к канюле и медленно опустите канюлю в ванну возле капилляров, заботясь о том, чтобы не попасть ни в какую часть сосуда или камеры.Чтобы стимулировать капилляры, опустите канюлю на крышку рядом с капиллярами и активируйте систему выброса давления с желаемым временем выброса. В конце стимуляции, поднять канюлю немного, чтобы избежать дальнейшей стимуляции. Чтобы подтвердить, что стимулируются только капилляры, заполните новую канюлю одним микромолярем раствора NS309 и стимулировать капилляры, как это было продемонстрировано.Затем получить максимальное вазодилатации путем купания препарат с раствором без кальция. Ванна применения одного микромолара NS309 вызывает почти максимальное расширение артериола из-за кальция чувствительных каналов калия в эндотелии. Капиллярные эндотелиальные клетки, однако, отсутствие промежуточных и малых каналов проводимости и не гиперполяризируются в ответ на агонист, в результате, стимулируя капиллярные концы с NS309, не вызывает вверх по течению артериолярного расширения, это указывает на то, что NS309 не достиг артериола, и может быть использован в качестве контроля для доступа к спациального ограничения соединения применяется на капилляры путем выброса давления.Использование гиппокампа капиллярных паренхимальных arteriole подготовки, как попродемонстрировано, применение искусственной спинномозговой жидкости, дополненной 10 миллимолярной калия в капиллярных концах, приводит к вверх по течению артериолярного расширения, которое не отличается между препаратами от мужчин и самок мышей. Кроме того, добавление ингибитора Kir2 ML 133, практически отменяет капиллярное индуцированное расширение артериоляров, в ответ на 10 миллимолярия калия в препаратах от мышей мужского и женского пола. При монтаже крови vesssel, ограничить прямое взаимодействие с кровеносным сосудом, чтобы свести к минимуму ущерб, и увеличить жизнеспособность сосуда.После того, как кровеносный сосуд был изолирован, различные соединения наркотиков могут быть проверены или кровеносный сосуд может быть дополнительно обработан для олекулярной биологии, иммунохимии или электрофизиологических исследований.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Подготовка острого срезах гиппокампа крыс и трансгенных мышей для изучения Synaptic Изменения в процессе старения и амилоида патологии

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Методы изучения морфогенеза нейронов:<em&gt; Ex естественных условиях</em&gt; RNAi Электропорация в эмбриональной коры головного мозга мышей

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Мышь Hindbrain<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Культура учиться на лице миграции Branchiomotor Neuron

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Одновременный<em&gt; Экс естественных условиях</em&gt; Функциональное тестирование двух сетчатки по<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Система электроретинограммы

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo оптогенетика Вскрытие страха схем в головном мозге Ломтики

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

Имплантация хронической кремниевых датчиков и записи клеток гиппокампа место в аппарат обогащенного беговая дорожка

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Подготовка острых человеческих гиппокампа для электрофизиологических записей

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Подготовка седалищного нерва крысы к нейрофизиологии Ex Vivo

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for AMD Research

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration (Video) | JoVE 

Ex Vivo Мультимодальная визуализация донорских глаз человека на основе ОКТ для исследования возрастной макулярной дегенерации

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...